Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על-ידי התוכנית FORUN של המרכז הרפואי האוניברסיטאי (889018) של רוסטוק וקרן לח (2016-11). בנוסף, אחה צ ר נתמכים על ידי BMBF (VIP + 00240).

HDFSCs מבודדים מן הזקיקים שיניים של שיני בינה שחולצו הניתנים על ידי המחלקה של אורלי פה ולסת כירורגיה פלסטית במרכז הרפואי באוניברסיטת רוסטוק. ממנו כל המטופלים הושג מדעת ואישור בכתב. מחקר זה אושרה על ידי ועדת האתיקה המקומית של אוניברסיטת רוסטוק (הרשאה ל'לא 2017-0158).
1. בידוד של hDFSCs
<...

תאי גזע בוגרים הם כרגע בפוקוס לטיפול של מספר מחלות ניווניות. בפרט, עצם מח (מוניטור)-תאי גזע, לרבות תאי גזע hematopoietic (HSCs) נגזר MSCs, נמצאים תחת חקירה קלינית אינטנסיבית47. עם זאת, מוניטור קציר הוא הליך פולשני גורמות לכאב באתר של תרומה, עלול להוביל תיעודו48. לאחרונה, הרקמה שינ...

זקיק שיניים האנושי הוא רופף, נגזר ectomesenchymally רקמת חיבור המקיפים את1,המתפתח השן2. לצד תפקידה לתאם osteoclastogenesis ואת פרכת בתהליך התפרצות השן, רקמה זו בנמלים תאי גזע וקדמון במיוחד עבור הפיתוח של periodontium3,4,5. לכן, זקיק שיניים נחשב כמקור חלופי כדי לקצור תאי גזע בוגרים אנושי6,7.
מספר מחקרים הדגימו כי תאי גזע אנושי זקיק שיניים (hDFSCs) מסוגלים להבדיל לתוך שושלת היוחסין חניכיים כולל תאי העצם, רצועה fibroblasts ו cementoblasts8,9,10 . יתר על כן, תאים אלה הוצגו כדי להתאים כל המאפיינים של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) כולל קיבולת עצמי המתחדש, הדבקות מפלסטיק, ביטוי של סמני פני שטח מסוים (למשל, CD73, CD90, CD105), כמו גם כמו osteogenic adipogenic, chondrogenic בידול פוטנציאליים11,12,13. מחקרים אחרים התגלה גם פוטנציאל התמיינות עצבית של hDFSCs2,14,15,16,17,18.
בשל תכונותיהם מבטיח ואת גישה נוחה, hDFSCs הפך לאחרונה הרלוונטיים רקמות-20,19,-הנדסה-21. המחקרים הראשונים התרכזו הפוטנציאל של DFSCs להתחדש העצם, חניכיים ושורשים השן19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. ידיעת היכולת neurogenic של hDFSCs, היישום שלהם כמו טיפול פוטנציאלי עבור מחלות ניווניות מאז ובדוקים31,32,33. HDFSCs זכו גם חשיבות ביחס לרגנרציה של שאר רקמות (למשל, אפיתל הקרנית)34,35. הפוטנציאל הטיפולי של hDFSC אינה מבוססת רק על הפוטנציאל בידול ישירה שלהם אלא גם על פעילותם paracrine. לאחרונה, hDFSCs הוכחו להפריש שפע של גורמים ביו, כגון מטריקס metalloproteinases (MMPs), פקטורי גדילה דמויי אינסולין (IGF), כלי הדם צמיחה אנדותל (VEGF), בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF), hepatocyte צמיחה פקטור (דבורה שחר), אשר לשחק תפקיד מכריע אנגיוגנזה, immunomodulation, מטריקס סלולרית נוספת שיפוץ של תהליכים תיקוני36.
עם זאת, תרגום קליני רחב של טיפול בתאי גזע הוא עדיין לקוי על ידי מספר אתגרים, כגון מוות של תאים הראשונית מסיבי נמוכה תאי גזע מיטיב אפקטים37,38. הנדסה גנטית מספקת אסטרטגיה מבטיח לטפל באתגרים אלה, ולכן יכול מאוד לשפר את היעילות הטיפולית של תאי גזע-38,-39,-40. תמרון תא ארעי, Rna (מירס) הם מועמדים מתאימים, כמו אלה הרגולטורים translational קטנים לשלוט את גורל וההתנהגות של תאי גזע ללא הסכנה של הגנום יציב אינטגרציה41,42, 43. נכון להיום, מספר מירס מועיל זוהו מקדם התפשטות תאי גזע, הישרדות, יונת, פעילות paracrine, כמו גם בידול שלהם לתוך שושלות מספר44. למשל, מיר-133a מתוכנן MSCs הראה, הישרדות מוגברת ו engraftment בלבבות עכברוש infarcted וכתוצאה מכך שיפור בתפקוד הלב בהשוואה ל- MSCs יאומתו45. באופן דומה, MSCs overexpressing מיר-146a הוצגו להפריש כמויות גבוה יותר של VEGF אשר הוביל בתורו משופרת יעילות טיפולית של רקמות איסכמי46.
כתב יד זה מציג פרוטוקול מפורט עבור חילוץ סלקטיבי ו הנדסה גנטית של hDFSCs. למטרה זו, אנו המתואר העיכול האיסוף, אנזימטי של זקיקי שיניים האנושית, כמו גם הבידוד עוקבות של hDFSCs. על מנת לאפיין תאים בודדים, נכללו הוראות חשובות עבור האימות של מאפייני MSC בהתאם לקווים המנחים של האגודה הבינלאומית עבור טיפול הסלולרית13. בנוסף, אנו מספקים תיאור מפורט לדור של hDFSCs מיר-לאחרונה על-ידי החלת אסטרטגיה תקנים מבוססי השומנים cationic והערכת יעילות תרביות תאים, cytotoxicity.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

נכון להיום, מספר סוגי תאי גזע בשלבים התפתחותיים שונים הם המוקד לטיפול של מחלות ניווניות. ובכל זאת, היבטים מסוימים, כגון מוות של תאים מסיבית הראשונית ואפקטים טיפולית נמוכה, נפגעת שלהם תרגום קלינית רחבה. הנדסה גנטית של תאי גזע לפני השתלת צמחו כשיטה מבטיח כדי למטב את השפעות טיפוליות תאי גזע. עם זאת, מערכות אספקה יעילה ובטוחה ג'ין עדיין חסרים. לכן, בפיתוח שיטות מתאים עשוי לספק גישה כדי לפתור אתגרים הנוכחי טיפולים מבוססי תאי גזע.
בפרוטוקול הנוכחי מתאר את החילוץ של אפיון של תאי גזע אנושי זקיק שיניים (hDFSCs) כמו גם ההנדסה הגנטית נגיפי שלהם. זקיק שיניים כמחנכת חשפה כמקור מבטיח ונגיש בקלות לשימוש בתאי גזע multipotent למבוגרים בעלי פוטנציאל התפשטות גבוה. ההליך המתואר בידוד מציג שיטה פשוטה ואמינה למסוק hDFSCs של שיני בינה מיותרות. פרוטוקול זה כוללת גם שיטות כדי להגדיר מאפייני תא גזע תאים מבודדים. עבור הנדסה גנטית של hDFSCs, אסטרטגיית ממוטבת cationic ליפיד המבוסס על תרביות תאים מוצג מבוא יעילה במיוחד microRNA המאפשר מבלי לגרום תופעות ציטוטוקסיות. מיקרו Rna הם מועמדים מתאימים תמרון תא ארעי, כמו אלה הרגולטורים translational קטנים לשלוט את גורל וההתנהגות של תאי גזע ללא הסכנה של הגנום יציב אינטגרציה. לפיכך, פרוטוקול זה מייצג שגרה יעילה ובטוחה עבור הנדסה של hDFSCs שעלולים להיות חשוב עבור מיטוב היעילות הטיפולית שלהם.

כאן, אנו מציגים הוראה מפורטת בידוד למסוק hDFSCs מרקמות אנושיות זקיק שיניים. בשל הגישה הקלה של זקיק שיניים במהלך ניתוח שגרתי, זה מקור מבטיח עבור החילוץ בתאי גזע בוגרים.
HDFSCs מבודד הראה כל המאפיינים שתוארו עבור ההגדרה של MSCs13. למעשה, ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

פרוטוקול זה מתאר את הנדסה גנטית ארעית של תאי גזע שיניים שחולצו מן הזקיק שיניים אנושיות. האסטרטגיה יישומית השינוי נגיפי יכול להיות בסיס לקידום מוצרים טיפוליים תאי גזע.

בידוד, אפיון, ההנדסה הגנטית מבוסס-MicroRNA, בתאי גזע אנושיים זקיק שיניים

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הרפואה הרגנרטיבית, כגון איפה תאי גזע זקיק שיניים אנושי יכול להיות מהונדס גנטית כדי לשפר את המאפיינים הטיפוליים שלהם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שתאי גזע יכולים להשתנות על ידי הקדמת microRNA ללא סכנה של שילוב גנום יציב. התחל את ההליך לעיכול אנזימטי של שני זקיק, על ידי התחממות מראש לטמפרטורת החדר, תא גזע זקיק שיניים אנושי או hDFSC תרבות בינונית פתרון PBSPSG.הפשרו כינוי אחד לכל אחד מפתרונות המניות של קולגנס I ו-Dispase II. הכן פתרון עיכול על ידי הוספת 500 microliters של פתרון מלאי מסוג Collagenase I ו 500 microliters של פתרון מלאי Dispase II ל 4 מיליליטר של מדיום בזל המכיל 1% חומר אנטיביוטי. כדי למנוע זיהום באתר במהלך בידוד תא גזע זקיק אנושי לשטוף מאגרים ותקשורת תרבות בשימוש חייב להכיל סוכנים אנטיביוטיים.מניחים זקיק שן שחולץ בצלחת פטרי סטרילית. הוסף 10 מיליליטר של פתרון PBSPSG לשטוף את הרקמה שחולצו. שאפו והשליכו את הפתרון והוסיפו פתרון PBSPSG טרי כדי לחזור על הכביסה.באמצעות אזמל סטרילי טחון זקיק שחולץ לחתיכות אם על 1 על 1 מילימטרים. מעבירים את הרקמה הטחון ואת תטגם PBSPSG מצלחת פטרי לצינור צנטריפוגה חרוטי 50 מיליליטר, לשטוף את צלחת פטרי עם 10 מיליליטר של פתרון PBSPSG, ולהעביר את הפתרון לתוך אותו צינור. צנטריפוגה הצינור חרוט ב 353 x גרם בטמפרטורת החדר במשך עשר דקות.מוסיפים 5 מיליליטר של פתרון עיכול לרקמה המשטחים, מערבבים בעדינות את הפתרון ואת הרקמה, דוגרים את התערובת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO2 באינקובטור רועד במשך שעתיים. לאחר שעתיים, צנטריפוגה התא מתעכל השעיית רקמות ב 353 גרם במשך עשר דקות בטמפרטורת החדר. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את המשטח המתקבל ב-6 מיליליטר של מדיום תרבות HDFSC.זרע את ההשעיה התא בבקבוק תרבות תאים 25 ס"מ מרובע, ולהדיגר את התאים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר קצירת התא ואפיון HDFSC הוא כמתואר בפרוטוקול הטקסט, hDFSCs זרע בצלחת 24 תרבות תאים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 ו 20% חמצן במשך 24 שעות.למחרת לדלל 40 picomoles של microRNA ב 66.7 microliters של מדיום סרום מופחת, ומערבולת הפתרון. לדלל 0.67 microliters של השומנים הקטיוני מבוסס, reagent transfection ב 66.7 microliters של מדיום סרום מופחת, מערבולת הפתרון, דגירה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר חמש דקות מוסיפים את המיקרו-רנ"א הטרום-מדולגל לרגנט הטראנס-חלקיקי הקדומה, מערבבים את הפתרון ומטוגים בטמפרטורת החדר במשך רבע שעה.לאחר מכן, להוסיף את המורכבות transfection מוכן, dropwise, ישירות למדיום התרבות על תאים. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה צלחת 24 תרבות התא היטב קדימה ואחורה. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.24 שעות לאחר transfection, לאסוף את supernatant של דגימות בהתאמה 15 צינורות צנטריפוגה חרוטית מיליליטר בהתאמה. לשטוף את התאים עם 1 מיליליטר של PBS, ולהעביר את PBS לתוך צינור צנטריפוגה בהתאמה. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של טפטפות ו- EDTA לתאים, ו דגירה 24 צלחת גם ב 37 מעלות צלזיוס, במשך 3 דקות.לעצור את טריפסיניזציה על ידי הוספת 1 מיליליטר של מדיום תרבות התא עבור התאים, והעברת הפתרון לתוך צינור צנטריפוגה בהתאמה. צנטריפוגה התאים ב 300 x גרם ו 4 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות. מכאן הלאה לשמור את התאים ואת reagents על קרח אלא אם כן צוין אחרת.השלך את העל-טבעי, תן שימוש חוזר בתאים ב-100 מיקרוליטרים של מאגר כתמים, והעבר את ת פתרון התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. הוסף 0.5 מיליליטר של צבע תגובתי אמין לכל מדגם על מנת להבחין בין תאים חיים ומתים. מערבבים בעדינות את הפתרון, ו דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות.הוסף 1 מיליליטר של PBS לתאים, וצנטריפוגה ב 300g ו 4 מעלות צלזיוס במשך עשר דקות השלך את supernatant ו resuspend התאים ב 100 microliters של PBS, להוסיף 33 microliters של paraformaldehyde, ולערבב את הפתרונות, לאחסן את הדגימות ב 4 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור עד זרימה cytometric מדידות. העבר את הדגימות לצינורות המתאימים למדידות ציטומטריות של זרימה, ובצע ציטומטריית זרימה באמצעות אסטרטגיית הגתה המתוארת בפרוטוקול הטקסט. תאי גזע זקיק השיניים האנושיים המבודדים הראו את כל המאפיינים המתוארים להגדרה של תאים סטרומה mesenchymal, תאים היו חסידי פלסטיק והפגינו פיברגלס כמו מורפולוגיה, בתנאי תרבות סטנדרטיים.ניתוח ציטומטרי זרימה גילה כי hDFSCs ביטא פאנל של אנטיגנים משטח מסוימים, כולל CD29, CD44, CD73, CD90, ו CD105. בעוד CD45 ו-CD117 נעדרו. פוטנציאל ההידול האדיפוגניים, האוסטיאוגניים והכונדרוגניים של תאים בתנאים ספציפיים בתרבות הויטרו אושר על ידי immunostaining, חלבון מחייב חומצת שומן עבור: אוסטאוקלצין ואגגרקן.אסטרטגיית gating המשמש לכימות של cytotoxicity ו Cy3 שכותרתו יעילות ספיגת microRNA 24 שעות לאחר transfection, ספיגת microRNA אישרה ב 100% של תאים קיימא. כמויות דומות של תאים מתים בדגימות מרוטות ולא פתורות מצביעות על כך שמיקרו-רנ"א מוצג ביעילות ללא השפעות ציטוקסיות. בעקבות הליך זה, שיטות אחרות כגון transdifferentiation יכול להתבצע על מנת לענות על שאלות נוספות כמו פלסטיות Cytolab.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

הנדסה גורמים מלאכותיים כדי לתמרן באופן ספציפי שחבור אלטרנטיבי בתאים אנושיים

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

מהדור ג'ין-שיבשו סטרפטוקוקוס mutans זן בלי ג'ין שיבוט

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

מערכות מכוננת Inducible עבור שינוי גנטי In Vivo של העכבר Hepatocytes באמצעות הזרקת וריד הזנב Hydrodynamic

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

שיבוש גנטי יעילים ביותר מאתר ואנושי Hematopoietic ובתאים מאת CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

הגישה קומבינטורית תא בודד כדי לאפיין את מולקולרית והטרוגניות Immunophenotypic של גזע האדם ואוכלוסיות קדמון

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

חלבון אנדוגני תיוג-אנוש המושרה בתאי גזע Pluripotent באמצעות CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

התאמת גנים של גזע Hematopoietic פרימוס Nonhuman, ובתאים והכנה

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...