Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

इस काम को रॉस्टॉक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (८८९०१८) और सीलन फाउंडेशन (2016-11) के FORUN प्रोग्राम ने सपोर्ट किया था । इसके अलावा, P.M. और R.D. BMBF (वीआईपी + ००२४०) द्वारा समर्थित हैं ।

HDFSCs रॉस्टॉक विश्वविद्यालय चिकित्सा केंद्र के मौखिक और मैक्सिलोफैशियल प्लास्टिक सर्जरी विभाग द्वारा उपलब्ध कराए गए ज्ञान दांत के दंत कूप से अलग कर रहे हैं । सभी रोगियों से सूचित सहमति एवं लिखित स्वीकृ...

वयस्क स्टेम सेल वर्तमान में ध्यान में कई अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए कर रहे हैं । विशेष रूप से, अस्थि मज्जा (बी. एम.)-व्युत्पन्न स्टेम सेल, सहित टेम स्टेम सेल (HSCs) और MSCs, गहन नैदानिक जांच४७के तहत कर ?...

मानव दंत कूप एक ढीला ectomesenchymally है संयोजी विकासशील दांत1,2आसपास के ऊतक व्युत्पंन । अपने कार्य के बगल में दांत विस्फोट प्रक्रिया के लिए osteoclastogenesis और आस्टियोजेनेसिस समंवय करने के लिए, इस ऊतक periodontium3,4,5के विकास के लिए विशेष रूप से स्टेम और जनक कोशिकाओं बंदरगाहों । इसलिए, दंत कूप मानव वयस्क स्टेम सेल6,7फसल के लिए एक वैकल्पिक स्रोत के रूप में माना जाता है ।
कई अध्ययनों से प्रदर्शन किया है कि मानव दंत कूप स्टेम सेल (hDFSCs) osteoblasts, बंध fibroblasts और cementoblasts8,9,10 सहित periodontal वंश में अंतर करने में सक्षम हैं . इसके अलावा, इन कोशिकाओं को आत्म-नवीकरण क्षमता, प्लास्टिक पालन, विशिष्ट सतह मार्करों की अभिव्यक्ति (जैसे, CD73, CD90, CD105) के रूप में अच्छी तरह से osteogenic सहित mesenchymal stromal कोशिकाओं (MSCs) के सभी विशेषताओं से मेल करने के लिए दिखाया गया है, adipogenic र chondrogenic विभेद संभावित११,१२,१३। अंय अध्ययनों से भी पता चला hDFSCs2,14,15,16,17,18के तंत्रिका विभेद की क्षमता ।
उनके होनहार गुणों और आसान पहुंच के कारण, hDFSCs हाल ही में ऊतक इंजीनियरिंग19,20,21के लिए प्रासंगिक बन गया । पहला अध्ययन DFSCs की क्षमता पर केंद्रित करने के लिए अस्थि, periodontal और दांत जड़ों19,22,23,24,25,26, पुनर्जंम 27,28,29,30. hDFSCs की तंत्रिकाजन्य क्षमता के ज्ञान के बाद से, neurodegenerative रोगों के लिए संभावित उपचार के रूप में उनके आवेदन31,३२,३३की जांच की गई है । HDFSCs भी अंय ऊतकों (जैसे, corneal उपकला)३४,३५के उत्थान के लिए संमान के साथ महत्व प्राप्त किया है । hDFSC की चिकित्सीय क्षमता न केवल उनके प्रत्यक्ष विभेदक क्षमता पर आधारित है बल्कि उनकी paracrine गतिविधि पर भी निर्भर करती है । हाल ही में, hDFSCs इस तरह के मैट्रिक्स metalloproteinases (MMPs), इंसुलिन जैसे विकास कारक (IGF), संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़), बुनियादी fibroblast वृद्धि कारक (bFGF) और hepatocyte वृद्धि के रूप में सक्रिय कारकों, के एक धन स्रावित करने के लिए दिखाया गया है फैक्टर (एचजीएफ), जो angiogenesis के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, चुहियों, अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स remodeling और प्रतिकारक प्रक्रियाओं३६।
हालांकि, स्टेम सेल थेरेपी के व्यापक नैदानिक अनुवाद अभी भी कई चुनौतियों से ख़राब है, जैसे बड़े पैमाने पर प्रारंभिक सेल मौत और कम लाभकारी स्टेम सेल प्रभाव३७,३८। आनुवंशिक इंजीनियरिंग इन चुनौतियों का पता करने के लिए एक आशाजनक रणनीति प्रदान करता है और इसलिए बहुत स्टेम कोशिकाओं३८,३९,४०की चिकित्सीय प्रभावकारिता को बढ़ा सकते हैं । क्षणिक कोशिका हेरफेर के लिए, microRNAs (miRs) उपयुक्त उंमीदवार हैं, के रूप में इन छोटे शोधों नियामकों स्थिर जीनोम एकीकरण के जोखिम के बिना स्टेम सेल के भाग्य और व्यवहार को नियंत्रित४१,४२, ४३. तिथि करने के लिए, कई लाभकारी miRs स्टेम सेल प्रसार को बढ़ावा देने की पहचान की गई है, अस्तित्व, होमिंग, paracrine गतिविधि के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई प्रजातियों में उनके भेदभाव४४. उदाहरण के लिए, मीर-133a इंजीनियर MSCs एक वृद्धि की उत्तरजीविता दिखाया और infarcted चूहा दिल में engraftment एक बेहतर हृदय समारोह में जिसके परिणामस्वरूप जब unmodified MSCs४५की तुलना में । इसी तरह, मीर-146a व्यक्त MSCs वीईजीएफ़ के उच्च मात्रा में जो बारी में कोरोनरी ऊतक४६में एक बढ़ाया चिकित्सकीय दक्षता के नेतृत्व में स्रावित करने के लिए दिखाया गया.
इस पांडुलिपि चयनात्मक निष्कर्षण और hDFSCs के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । इस प्रयोजन के लिए, हम मानव दंत कूप के संचयन और एंजाइमी पाचन के साथ ही hDFSCs के बाद के अलगाव का वर्णन किया । आदेश में अलग कोशिकाओं की विशेषता के लिए, एमएससी संपत्तियों के सत्यापन के लिए महत्वपूर्ण निर्देश के अनुसार सेलुलर चिकित्सा13के लिए इंटरनेशनल सोसायटी के दिशा निर्देशों के साथ शामिल किया गया है । इसके अलावा, हम एक cationic लिपिड आधारित अभिकर्मक रणनीति और अभिकर्मक दक्षता और cytotoxicity के मूल्यांकन लागू करने के द्वारा मीर संशोधित hDFSCs की पीढ़ी के लिए एक विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

तिथि करने के लिए, विभिंन विकासात्मक चरणों में कई स्टेम सेल प्रकार अपक्षयी रोगों के उपचार के लिए ध्यान में हैं । फिर भी, कुछ पहलुओं, जैसे प्रारंभिक बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु और कम उपचारात्मक प्रभाव, उनके व्यापक नैदानिक अनुवाद बिगड़ा । प्रत्यारोपण करने से पहले स्टेम कोशिकाओं के आनुवंशिक इंजीनियरिंग चिकित्सकीय स्टेम सेल प्रभाव का अनुकूलन करने के लिए एक आशाजनक विधि के रूप में उभरा । हालांकि, सुरक्षित और कुशल जीन डिलिवरी सिस्टम अभी भी कमी है । इसलिए, उपयुक्त विधियों का विकास स्टेम सेल आधारित उपचारों में वर्तमान चुनौतियों का समाधान करने के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान कर सकता है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल निष्कर्षण और मानव दंत कूप स्टेम सेल (hDFSCs) के रूप में अच्छी तरह के रूप में उनके गैर वायरल आनुवंशिक संशोधन के लक्षण वर्णन । जन्मोत्तर दंत कूप उच्च प्रसार क्षमता रखने वयस्क multipotent स्टेम सेल कटाई के लिए एक होनहार और आसानी से सुलभ स्रोत के रूप में अनावरण किया । वर्णित अलगाव प्रक्रिया प्रभावित ज्ञान दांत से hDFSCs फसल के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रस्तुत करता है । इसके अलावा इस प्रोटोकॉल के लिए अलग कोशिकाओं के स्टेम सेल विशेषताओं को परिभाषित करने के तरीके शामिल हैं । hDFSCs के आनुवंशिक इंजीनियरिंग के लिए, एक अनुकूलित cationic लिपिड आधारित अभिकर्मक रणनीति साइटोटोक्सिक प्रभाव के कारण के बिना अत्यधिक कुशल microRNA परिचय को सक्षम करने के लिए प्रस्तुत किया है । MicroRNAs परिवर्तनीय सेल हेरफेर के लिए उपयुक्त उंमीदवार हैं, के रूप में इन छोटे शोधों नियामकों स्थिर जीनोम एकीकरण के खतरे के बिना भाग्य और स्टेम सेल के व्यवहार को नियंत्रित करते हैं । इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल hDFSCs कि उनके चिकित्सीय प्रभावकारिता के अनुकूलन के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है इंजीनियरिंग के लिए एक सुरक्षित और कुशल प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है ।

यहां, हम मानव दंत कूप ऊतक से hDFSCs फसल के लिए एक विस्तृत अलगाव अनुदेश पेश करते हैं । नियमित सर्जरी के दौरान दंत कूप के आसान पहुंच के कारण, यह वयस्क स्टेम कोशिकाओं के निष्कर्षण के लिए एक आशाजनक स्?...

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Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

इस प्रोटोकॉल चिकित्सकीय स्टेम मानव दंत कूप से निकाले कोशिकाओं के क्षणिक आनुवंशिक इंजीनियरिंग का वर्णन । लागू गैर वायरल संशोधन रणनीति चिकित्सकीय स्टेम सेल उत्पादों के सुधार के लिए एक आधार बन सकता है ।

अलगाव, लक्षण वर्णन और मानव दंत कूप स्टेम सेल के MicroRNA आधारित आनुवंशिक संशोधन

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

इस विधि को पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब में मदद कर सकते हैं, जैसे जहां एक मानव दंत कूप स्टेम कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से अपने चिकित्सकीय गुणों में सुधार करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि स्टेम कोशिकाओं को स्थिर जीनोम एकीकरण के खतरे के बिना माइक्रोआरएनए परिचय द्वारा संशोधित किया जा सकता है। कमरे के तापमान, मानव दंत कूप स्टेम सेल या एचडीएफएससी संस्कृति माध्यम और पीबीएसपीएसजी समाधान के लिए पूर्व वार्मिंग द्वारा, दो कूप के एंजाइमेटिक पाचन के लिए प्रक्रिया शुरू करें।कोलेज प्रकार मैं और Dispase द्वितीय शेयर समाधान के प्रत्येक एक aliquot गल । कोलेजेस टाइप आई स्टॉक सॉल्यूशन के 500 माइक्रोलीटर और डिस्पास II स्टॉक सॉल्यूशन के 500 माइक्रोलीटर को 1% एंटीबायोटिक एजेंट वाले बेसल मीडियम के 4 मिलीलीटर में जोड़कर पाचन समाधान तैयार करें। मानव दंत कूप स्टेम सेल आइसोलेशन वॉश बफ़र्स और संस्कृति मीडिया के दौरान साइट संदूषण से बचने के लिए एंटीबायोटिक एजेंटों को शामिल करना चाहिए।एक बाँझ पेट्री डिश में एक निकाले गए दांत कूप रखें। निकाले गए ऊतकों को धोने के लिए पीबीएसपीएसजी समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें। एस्पिरेट और समाधान त्यागें और धोने को दोहराने के लिए ताजा पीबीएसपीएसजी समाधान जोड़ें।एक बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके निकाले गए कूप को टुकड़ों में शामिल करें यदि लगभग 1 बाय 1 मिलीमीटर हो। पेट्री डिश से कीमा बनाया हुआ ऊतक और PBSPSG समाधान को 50 मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें, पेट्री डिश को 10 मिलीलीटर PBSPSG समाधान के साथ धोएं, और समाधान को एक ही ट्यूब में स्थानांतरित करें। दस मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 353 x g पर शंकु नली अपकेंद्रित्र।पैलेट किए गए ऊतक में पाचन समाधान के 5 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे-धीरे समाधान और ऊतक को मिलाएं, मिश्रण को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर दो घंटे तक एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर में डालें। दो घंटे के बाद, कमरे के तापमान पर दस मिनट के लिए 353 ग्राम पर पचा सेल और ऊतक निलंबन अपकेंद्रित्र। सुपरनेट को त्यागें और एचडीएफएससी संस्कृति माध्यम के 6 मिलीलीटर में प्राप्त फूस को फिर से निलंबित करें।25 वर्ग सेंटीमीटर सेल कल्चर फ्लास्क में सेल सस्पेंशन को सीड करें, और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। सेल हार्वेस्ट और एचडीएफएससी के लक्षण वर्णन के बाद टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित है, 24 अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट में बीज एचडीएफएससी। 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 और 20% ऑक्सीजन पर इनक्यूबेट।अगले दिन कम सीरम माध्यम के 66.7 माइक्रोलीटर में माइक्रोआरएनए के 40 पिकोमोल्स को पतला करें, और समाधान को भंवर दें। कम सीरम माध्यम के 66.7 माइक्रोलीटर में cationic लिपिड आधारित, ट्रांसफैक्शन रिएजेंट के 0.67 माइक्रोलीटर पतला, समाधान भंवर, और पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट। पांच मिनट के बाद पूर्वाक्षात्मक ट्रांसफेक्शन रिएजेंट में पूर्वाचलित माइक्रोआरएनए जोड़ें, समाधान को मिलाएं, और पंद्रह मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।इसके बाद, तैयार ट्रांसफेक्शन जटिलताओं को जोड़ें, ड्रॉपवाइज, सीधे कोशिकाओं पर संस्कृति माध्यम में जोड़ें। 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट आगे और पीछे कमाल से धीरे मिलाएं । कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।ट्रांसफेक्शन के 24 घंटे बाद, संबंधित 15 मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूबों में नमूनों का सुपरनैंट एकत्र करें। पीबीएस के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोएं, और पीबीएस को संबंधित सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं में ड्रिप और EDTA के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 अच्छी तरह से प्लेट को इनक्यूबेट करें।कोशिकाओं के लिए सेल कल्चर माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़कर ट्राइपसिनाइजेशन बंद करें, और समाधान को संबंधित अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। दस मिनट के लिए 300 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें। यहां से कोशिकाओं और बर्फ पर अभिकर्मक रखने पर जब तक अंयथा कहा जाता है ।सुपरनैंट को त्यागें, कोशिकाओं को धुंधला बफर के 100 माइक्रोलीटर में फिर से खर्च करें, और सेल समाधान को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। जीवित और मृत कोशिकाओं के बीच अंतर करने के लिए प्रत्येक नमूने में 0.5 मिलीलीटर अमीन प्रतिक्रियाशील डाई जोड़ें। धीरे-धीरे समाधान मिलाएं, और दस मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।कोशिकाओं में पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और दस मिनट के लिए 300 ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइज सुपरनेट को त्यागें और पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से रीसस्ट करें, पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 33 माइक्रोलीटर जोड़ें, और समाधान मिलाएं, प्रकाश प्रवाह से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को स्टोर करें जब तक कि साइटॉम पर मापन तक प्रकाश प्रवाह से सुरक्षित रहें। नमूनों को प्रवाह साइटोमेट्रिक माप के लिए उपयुक्त ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और टेक्स्ट प्रोटोकॉल में वर्णित गेटिंग रणनीति का उपयोग करके प्रवाह साइटोमेट्री करें। अलग मानव दंत कूप स्टेम कोशिकाओं सभी mesenchymal स्ट्रोमल कोशिकाओं की परिभाषा के लिए वर्णित विशेषताओं से पता चला, कोशिकाओं प्लास्टिक अनुयायी थे और आकृति विज्ञान की तरह एक शीसे रेशा प्रदर्शित, मानक संस्कृति की स्थिति के तहत ।फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण से पता चला है कि एचडीएफएससी ने सीडी 29, सीडी 44, सीडी 73, सीडी 90 और सीडी 105 सहित कुछ सतह एंटीजन का एक पैनल व्यक्त किया। जबकि सीडी45 और सीडी117 अनुपस्थित रहे। विशिष्ट इन विट्रो संस्कृति स्थितियों के तहत कोशिकाओं की एडिपोजेनिक, ऑस्टियोजेनिक और कॉन्ड्रोजेनिक विभेदन क्षमता की पुष्टि इम्यूनोसटेनिंग द्वारा की गई थी, जो एक फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन के लिए: ऑस्टियोकैल्सिन और एग्रीकन।साइटोटॉक्सिकिटी और Cy3 लेबल माइक्रोआरएनए तेज दक्षता के मात्राकरण के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग रणनीति 24 घंटे ट्रांसफैक्शन के बाद, 100% व्यवहार्य कोशिकाओं में माइक्रोआरएनए तेज की पुष्टि की गई। संक्रमित और असंक्रमित नमूनों में मृत कोशिकाओं की तुलनीय मात्रा से संकेत मिलता है कि माइक्रोआरएनए को साइटोटॉक्सिक प्रभावों के बिना कुशलतापूर्वक पेश किया जाता है। इस प्रक्रिया के बाद, साइटोलैब प्लास्टिसिटी जैसे अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए ट्रांसफेरेशन जैसे अन्य तरीकों का प्रदर्शन किया जा सकता है।

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Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

मानव टेलोमिरेज रिवर्स Transcriptase प्रोटीन की आरएनए-निर्भर आरएनए पोलीमरेज़ गतिविधि का अर्द्ध मात्रात्मक पता लगाना

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Murine और मानव टेम जनक कोशिकाओं के अत्यधिक कुशल जीन व्यवधान CRISPR द्वारा Cas9/

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

मानव स्टेम और जनक आबादी के आणविक और Immunophenotypic विविधता की विशेषताएं करने के लिए एक मिश्रित एकल सेल दृष्टिकोण

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

अंतर्जात प्रोटीन टैगिंग में मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

आइसोलेटिंग, अनुक्रमण और मानव mesenchymal स्टेम कोशिकाओं से extracellular micrornas का विश्लेषण

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

तैयारी और अमानवीय रहनुमा टेम स्टेम और जनक कोशिकाओं के जीन संशोधन

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...