Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dal foro con. rar programma di il Rostock University Medical Centre (889018) e la Fondazione umida (2016-11). In aggiunta, P.M. e R.D. sono supportati da BMBF (VIP + 00240).

HDFSCs sono isolati dai follicoli dentali dei denti del giudizio estratti forniti dal dipartimento di chirurgia orale e maxillo-facciale plastica Rostock University Medical Center. Approvazione scritta e consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti. Questo studio è stato autorizzato dal comitato etico locale dell'Università di Rostock (autorizzazione No. A 2017-0158).
1. isolamento di hDFSCs
Nota: Per evitare la contaminazione batterica,...

Cellule staminali adulte sono attualmente a fuoco per il trattamento di parecchie malattie degeneranti. In particolare, dell'osso midollo osseo (BM)-cellule staminali, tra cui le cellule staminali ematopoietiche (HSCs) e MSCs, sono sotto indagine clinica intensiva47. Tuttavia, BM raccolta è una procedura invasiva, causando dolore al sito di donazione e può portare a eventi avversi48. Recentemente, il tessuto dentale postnatale è emerso come un romanzo e una fonte facilme...

Il follicolo dentale umano è un derivato ectomesenchymally tessuto connettivo che circonda il dente in via di sviluppo1,2. Al lato della sua funzione di coordinamento osteoclastogenesi e osteogenesi per il processo di eruzione dei denti, questo tessuto nutre le cellule staminali e progenitrici soprattutto per lo sviluppo del parodonto3,4,5. Di conseguenza, il follicolo dentale è considerato come una fonte alternativa per la raccolta di cellule staminali adulte umane6,7.
Diversi studi hanno dimostrato che le cellule staminali del follicolo dentale umano (hDFSCs) sono in grado di differenziarsi in lignaggio parodontale tra cui osteoblasti, fibroblasti del legamento e cementoblasti8,9,10 . Inoltre, queste cellule sono state indicate per abbinare tutte le caratteristiche delle cellule stromali mesenchimali (MSCs) tra cui capacità di auto-propagarsi, plastica aderenza, espressione di marcatori di superficie specifici (ad esempio, CD73, CD90, CD105) anche come osteogenica, adipogenico e condrogenica differenziazione potenziali11,12,13. Altri studi hanno anche rivelato un potenziale di differenziazione neurale di hDFSCs2,14,15,16,17,18.
A causa di loro proprietà promettente e un facile accesso, hDFSCs è diventato recentemente relativo per tessuto ingegneria19,20,21. I primi studi concentrano sulle potenzialità del DFSCs per rigenerare osso, parodontale e19,22,23,24,25,26, radici di dente 27,28,29,30. Poiché la conoscenza delle capacità neurogena di hDFSCs, loro applicazione come trattamento potenziale per le malattie neurodegenerative è stato indagato31,32,33. HDFSCs hanno anche acquisito importanza rispetto alla la rigenerazione di altri tessuti (ad es., epitelio corneale)34,35. Il potenziale terapeutico di hDFSC non si basa solo sul loro potenziale di differenziazione diretto, ma anche sulla loro attività paracrina. Recentemente, hDFSCs sono stati indicati a secernere una ricchezza di fattori bioattivi, come metalloproteinasi della matrice (MMPs), fattore di crescita insulino-simile (IGF), fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), fattore di crescita di base del fibroblasto (bFGF) e crescita dell'epatocita Factor (HGF), che svolgono un ruolo cruciale per l'angiogenesi, immunomodulazione, rimodellamento della matrice extracellulare e processi riparativi36.
Tuttavia, ampio traduzione clinica della terapia con cellule staminali è ancora compromessa da diverse sfide, come la morte iniziale massiccia delle cellule e cellule staminali benefico basso effetti37,38. Ingegneria genetica fornisce una strategia promettente per affrontare queste sfide e di conseguenza può migliorare notevolmente l'efficacia terapeutica delle cellule staminali38,39,40. Per manipolazione cellulare transitoria, microRNA (miRs) sono candidati adatti, come questi piccoli regolatori traduzionali controllano il destino e il comportamento delle cellule staminali senza il pericolo di genoma stabile integrazione41,42, 43. ad oggi, sono stati identificati diversi benefici miRs promuovere la proliferazione delle cellule staminali, sopravvivenza, homing, attività paracrina, nonché la loro differenziazione in diversi lignaggi44. Per esempio, miR-133a ingegnerizzato MSCs ha mostrato un aumento della sopravvivenza e l'attecchimento nei cuori del ratto colpito da infarto conseguente a un miglioramento della funzione cardiaca rispetto ai non modificato MSCs45. Allo stesso modo, miR-146a overesprimenti MSCs sono stati indicati per secernono una maggiore quantità di VEGF che a sua volta ha condotto ad una migliorata efficienza terapeutica nel tessuto ischemico46.
Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per l'estrazione selettiva e dell'ingegneria genetica di hDFSCs. Per questo scopo, abbiamo descritto la digestione enzimatica e raccolta dei follicoli dentali umane nonché l'isolamento successivo di hDFSCs. Per caratterizzare le cellule isolate, importanti istruzioni per la verifica delle proprietà MSC sono state incluse in conformità con le linee guida della società internazionale per la terapia cellulare13. Inoltre, forniamo una descrizione dettagliata per la generazione di hDFSCs miR-modificato applicando una strategia di trasfezione basata sui lipidi cationici e la valutazione di efficienza di trasfezione e citotossicità.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

Ad oggi, diversi tipi di cellule staminali a diversi stadi di sviluppo sono nel fuoco per il trattamento di malattie degenerative. Ancora, alcuni aspetti, ad esempio iniziale massiccia delle cellule morte e bassi effetti terapeutici, alterato la loro ampia traduzione clinica. Ingegneria genetica delle cellule staminali prima del trapianto è emerso come un metodo promettente per ottimizzare gli effetti terapeutici delle cellule staminali. Tuttavia, mancano ancora sistemi di consegna del gene sicuro ed efficiente. Pertanto, lo sviluppo di metodi adatti può fornire un approccio per risolvere le sfide attuali in terapie basate sulle cellule staminali.
Il presente protocollo descrive l'estrazione e caratterizzazione di cellule staminali umane follicolo dentale (hDFSCs) così come loro modificazione genetica non-virali. Il follicolo dentale postnatale ha presentato come una fonte promettente e facilmente accessibile per la raccolta di cellule staminali adulte multipotenti che possiede potenziale elevata proliferazione. La procedura di isolamento descritto presenta un metodo semplice e affidabile per la raccolta hDFSCs da denti del giudizio. Anche questo protocollo comprende i metodi per definire le caratteristiche di cellule staminali di cellule isolate. Per l'ingegneria genetica di hDFSCs, una strategia di trasfezione basata sui lipidi cationici ottimizzato è presentata abilitazione microRNA altamente efficiente introduzione senza causare effetti citotossici. I microRNA sono candidati adatti per la manipolazione di transitoria delle cellule, come questi piccoli regolatori traduzionali controllano il destino e il comportamento delle cellule staminali senza il pericolo di integrazione del genoma stabile. Così, questo protocollo rappresenta una procedura sicura ed efficiente per l'ingegneria di hDFSCs che potrebbe diventare importante per ottimizzare la loro efficacia terapeutica.

Qui, presentiamo un istruzioni dettagliate isolamento per raccogliere hDFSCs dal tessuto umano del follicolo dentale. A causa del facile accesso del follicolo dentale durante l'intervento chirurgico di routine, è una fonte di promessa per l'estrazione di cellule staminali adulte.
Il hDFSCs isolato ha mostrato tutte le caratteristiche descritte per la definizione di MSCs13. Infatti, le cellule erano plast...

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Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Questo protocollo descrive l'ingegneria genetica transitoria delle cellule staminali dentali estratti dal follicolo dentale umano. La strategia applicata modifica non virali può diventare una base per il miglioramento dei prodotti terapeutico delle cellule staminali.

Isolamento, caratterizzazione e MicroRNA-basato di modificazione genetica di cellule staminali del follicolo dentale umano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina rigenerativa, come dove le cellule staminali del follicolo dentale umano potrebbero essere geneticamente progettate per migliorare le loro proprietà terapeutiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le cellule staminali possono essere modificate con l'introduzione di microRNA senza il rischio di un'integrazione stabile del genoma. Iniziare la procedura per la digestione enzimatica dei due follicoli, prerifabbturando a temperatura ambiente, le cellule staminali del follicolo dentale umano o il mezzo di coltura hDFSC e la soluzione PBSPSG.Scongelare un'aliquota ciascuna delle soluzioni stock collagenasi di tipo I e Dispasi II. Preparare una soluzione di digestione aggiungendo 500 microlitri della soluzione stock di collagenasi di tipo I e 500 microlitri della soluzione stock di Dispasi II a 4 millilitri di Basal Medium contenenti 1%di agente antibiotico. Per evitare la contaminazione del sito durante l'isolamento delle cellule staminali dentali umane, i tamponi di lavaggio e i mezzi di coltura utilizzati devono contenere agenti antibiotici.Posizionare un follicolo dentale estratto in una piastra di Petri sterile. Aggiungere 10 millilitri di soluzione PBSPSG per lavare il tessuto estratto. Aspirare e scartare la soluzione e aggiungere una fresca soluzione PBSPSG per ripetere il lavaggio.Usando un bisturi sterile tritare il follicolo estratto in pezzi se circa 1 per 1 millimetro. Trasferire il tessuto tritato e la soluzione PBSPSG dalla piastra di Petri in un tubo di centrifuga conico da 50 millilitri, lavare la piastra di Petri con 10 millilitri di soluzione PBSPSG e trasferire la soluzione nello stesso tubo. Centrifugare il tubo conico a 353 x g a temperatura ambiente per dieci minuti.Aggiungere 5 millilitri di soluzione di digestione al tessuto pallettizzato, mescolare delicatamente la soluzione e il tessuto, incubare la miscela a 37 gradi celsius e 5%CO2 in un'incubatrice di scuotimento per due ore. Dopo due ore, centrifugare la sospensione di cellule e tessuti digerita a 353 g per dieci minuti a temperatura ambiente. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pallet ottenuto in 6 millilitri di mezzo di coltura HDFSC.Seedare la sospensione cellulare in un pallone da coltura cellulare di 25 centimetri quadrati e incubare le cellule a 37 gradi Celsius. Dopo la raccolta cellulare e la caratterizzazione dell'HDFSC è come descritto nel protocollo di testo, i hDFSC di semi in una piastra di coltura cellulare da 24 po '. Incubare a 37 gradi celsius, 5%CO2 e 20%Ossigeno per 24 ore.Il giorno seguente diluire 40 picomoli di microRNA in 66,7 microlitri di mezzo siero ridotto e vortice la soluzione. Diluire 0,67 microlitri a base di lipidi cationici, reagente di trasfezione in 66,7 microlitri di mezzo sierico ridotto, vortice la soluzione e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti aggiungere il microRNA predilutato al reagente di trasfezione prediluto, mescolare la soluzione e incubare a temperatura ambiente per quindici minuti.Quindi, aggiungere le complessità di trasfezione preparate, dropwise, direttamente al mezzo di coltura sulle cellule. Mescolare delicatamente dondolando la piastra di coltura cellulare di 24 pozzi avanti e indietro. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 24 ore.24 ore dopo la trasfezione, raccogliere il supernatante di campioni nei rispettivi tubi di centrifuga conica da 15 millilitri. Lavare le celle con 1 millilitro di PBS e trasferire il PBS nel rispettivo tubo di centrifuga. Aggiungere 500 microlitri di gocciolamenti ed EDTA alle cellule e incubare la piastra del pozzo 24 a 37 gradi celsius, per 3 minuti.Interrompere la tripsininazione aggiungendo 1 millilitro di mezzo di coltura cellulare per le cellule e trasferendo la soluzione nel rispettivo tubo di centrifuga. Centrifugare le cellule a 300 x g e 4 gradi Celsius per dieci minuti. Da qui in poi tenere le cellule e i reagenti sul ghiaccio, salvo diversa indicazione.Scartare il supernatante, rimescolare le cellule in 100 microlitri di tampone di colorazione e trasferire la soluzione cellulare in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere 0,5 millilitri di colorante reattivo all'ammina a ciascun campione per distinguere tra cellule vive e morte. Mescolare delicatamente la soluzione e incubare a 4 gradi celsius per dieci minuti.Aggiungere 1 millilitro di PBS alle cellule e centrifugare a 300 g e 4 gradi celsius per dieci minuti Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 100 microlitri di PBS, aggiungere 33 microlitri di paraformaldeide e mescolare le soluzioni, conservare i campioni a 4 gradi celsius protetti dalla luce fino alle misurazioni citometriche del flusso. Trasferire i campioni in tubi adatti alle misurazioni citometriche del flusso ed eseguire la citometria del flusso utilizzando la strategia di gating descritta nel protocollo di testo. Le cellule staminali del follicolo dentale umano isolato mostravano tutte le caratteristiche descritte per la definizione di cellule stromali mesenchimali, le cellule erano aderenti alla plastica e mostravano una morfologia simile alla fibra di vetro, in condizioni di coltura standard.L'analisi citometrica del flusso ha rivelato che gli hDFSC esprimerono un pannello di alcuni antigeni di superficie, tra cui CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105. Mentre CD45 e CD117 erano assenti. I potenziali di differenziazione adipogenica, osteogenica e condrogenica delle cellule in specifiche condizioni di coltura in vitro sono stati confermati dall'immunostaining, una proteina legante gli acidi grassi per:Osteocalcina e Aggrecan.La strategia di gating utilizzata per la quantificazione della citotossicità e dell'efficienza di assorbimento del microRNA etichettato Cy3 24 ore dopo la trasfezione, ha confermato l'assorbimento di microRNA nel 100% delle cellule vitali. Quantità comparabili di cellule morte in campioni trasfettati e non trasfettati indicano che il microRNA viene introdotto in modo efficiente senza effetti citotossici. Seguendo questa procedura, altri metodi come la transdifferenziazione possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive come la plasticità di Cytolab.

Research

JoVE Journal

Genetics

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