Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Este trabalho foi financiado pelo programa Forum de Rostock University Medical Centre (889018) e a Fundação úmida (2016-11). Além disso, P.M. e R.D. são suportados pelo BMBF (VIP + 00240).

HDFSCs são isolados os folículos dentários dos dentes do siso extraídos fornecidos pelo departamento de Cirurgia Buco Maxilo facial plástica do centro médico da Universidade de Rostock. Obteve-se consentimento informado e autorização por escrito de todos os pacientes. Este estudo foi autorizado pelo Comitê de ética local da Universidade de Rostock (permissão No. A 2017-0158).
1. isolamento de hDFSCs
Nota: Para evitar a contaminação bacter...

Células-tronco adultas estão atualmente em foco para o tratamento de diversas doenças degenerativas. Em particular, a medula (BM) óssea-derivadas de células-tronco, incluindo as células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) e MSCs, estão sob investigação clínica intensiva47. No entanto, BM colheita é um procedimento invasivo, causando dor no local da doação e pode levar a efeitos adversos48. Recentemente, o tecido dental pós-Natal tem emergido como um romance ...

O folículo dental humano é um frouxo ectomesenchymally-derivado do tecido conjuntivo em torno do desenvolvimento dente1,2. Ao lado de sua função de coordenação osteoclastogenesis e osteogênese para o processo de erupção do dente, este tecido abriga células estaminais e progenitoras especialmente para o desenvolvimento do periodonto,4,3,5. Portanto, o folículo dental é considerado como uma fonte alternativa para colher células-tronco adultas humanas6,7.
Vários estudos demonstraram que as células-tronco humanas folículo dental (hDFSCs) são capazes de diferenciar em linhagem periodontal, incluindo osteoblastos, fibroblastos do ligamento e cementoblastos8,9,10 . Além disso, essas células foram mostradas para coincidir com todas as características de células estromais mesenquimais (MSCs) incluindo a capacidade de auto renovadora, aderência plástica, expressão de marcadores de superfície específicas (por exemplo,, CD73, CD90, CD105), bem como osteogênico, adipogenic e chondrogenic diferenciação potencial11,12,13. Outros estudos também revelaram um potencial de diferenciação neural de hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Devido a suas propriedades promissoras e fácil acesso, o hDFSCs tornou-se recentemente relevante para a engenharia de tecido19,20,21. Os primeiros estudos concentraram-se sobre o potencial de DFSCs de regeneração óssea, periodontal e raízes de dente19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Desde o conhecimento da funcionalidade de neurogênica de hDFSCs, sua aplicação como potencial tratamento para doenças neurodegenerativas tem sido investigados31,32,33. HDFSCs também ganharam importância com respeito à regeneração de outros tecidos (por exemplo, o epitélio corneano)34,35. O potencial terapêutico de hDFSC não se baseia apenas em seu potencial de diferenciação directa, mas também na sua atividade parácrina. Recentemente, hDFSCs têm sido mostrados para secretar uma variedade de fatores bioativos, tais como metaloproteinases de matriz (MMPs), fator de crescimento semelhante à insulina (IGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) e crescimento hepatócito fator (HGF), que desempenham um papel crucial para a angiogênese, imunomodulação, remodelação da matriz extracelular e processos reparativa36.
No entanto, ampla tradução clínica da terapia de células-tronco ainda é prejudicada por vários desafios, como a morte maciça inicial celular e células-tronco baixo benéfico efeitos37,38. Engenharia genética fornece uma estratégia promissora para enfrentar esses desafios e, portanto, pode aumentar consideravelmente a eficácia terapêutica de células-tronco38,39,40. Para manipulação de célula transitória, microRNAs (miRs) são candidatos adequados, como estes pequenos reguladores translacionais controlam o destino e comportamento de células-tronco sem o perigo de genoma estável integração41,42, 43. até à data, vários miRs benéficos foram identificados promovendo a proliferação de células-tronco, sobrevivência, orientação, atividade parácrina bem como a sua diferenciação em várias linhagens44. Por exemplo, miR-133a engenharia MSCs mostrou uma maior sobrevivência e enxertia em corações de rato enfartado, resultando em uma melhor função cardíaca quando comparado a não modificado MSCs45. Da mesma forma, miR-146 superexpressão MSCs foram mostrados a secretar quantidades mais elevadas de VEGF, que por sua vez, levou a uma maior eficiência terapêutica no tecido isquêmico46.
Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a extração seletiva e engenharia genética de hDFSCs. Para este fim, descrevemos a digestão enzimática e colheita dos folículos dentários humanas, bem como o posterior isolamento do hDFSCs. Para caracterizar células isoladas, instruções importantes para a verificação das propriedades MSC foram incluídas em conformidade com as diretrizes da sociedade internacional para terapia celular13. Além disso, nós fornecemos uma descrição detalhada para a geração de hDFSCs miR-modificado pela aplicação de uma estratégia de transfeccao baseada em lipídios catiônicos e a avaliação da eficiência do transfection e citotoxicidade.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

Até à data, vários tipos de células-tronco em diferentes estádios de desenvolvimento estão no foco para o tratamento de doenças degenerativas. Ainda, certos aspectos, tais como morte celular maciça inicial e baixos efeitos terapêuticos, prejudicada sua ampla tradução clínica. Engenharia genética de células-tronco antes da transplantação surgiu como um método promissor para otimizar os efeitos terapêuticos de células estaminais. No entanto, sistemas de entrega segura e eficiente do gene ainda estão faltando. Portanto, o desenvolvimento de métodos adequados pode fornecer uma abordagem para resolver desafios atuais de terapias baseadas em células-tronco.
O presente protocolo descreve o extração e caracterização de células-tronco humanas folículo dental (hDFSCs) bem como suas modificações genéticas não-virais. O folículo dental pós-natal revelou-se como uma fonte promissora e facilmente acessível para a colheita de células estaminais adultas multipotentes possuindo potencial de alta proliferação. O procedimento de isolamento descrito apresenta um método simples e confiável para colher hDFSCs de dentes do siso. Este protocolo inclui também métodos para definir as características de células-tronco de células isoladas. Para a engenharia genética de hDFSCs, uma estratégia otimizada do transfection baseada em lipídios catiônicos é apresentada permitindo introdução de microRNA altamente eficiente sem causar efeitos citotóxicos. MicroRNAs são candidatos adequados para manipulação de célula transitória, como estes pequenos reguladores translacionais controlam o destino e comportamento de células-tronco sem o perigo de integração estável do genoma. Assim, este protocolo representa um procedimento seguro e eficiente para a engenharia de hDFSCs que pode se tornar importante para otimizar sua eficácia terapêutica.

Aqui, apresentamos uma instrução detalhada de isolamento para colher hDFSCs do tecido do folículo dental humana. Devido ao fácil acesso do folículo dental durante cirurgia de rotina, é uma fonte promissora para a extração de células-tronco adultas.
O hDFSCs isoladas mostrou todas as características descritas para a definição do MSCs13. Na verdade, as células foram plástico aderente sob descr...

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Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Este protocolo descreve a transiente engenharia genética de células-tronco dentárias extraídas do folículo dental humano. A estratégia de modificação não-virais aplicada pode tornar-se uma base para a melhoria dos produtos terapêuticos células-tronco.

Isolamento, caracterização e baseada em MicroRNA modificação genética de células-tronco humanas folículo Dental

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da Medicina Regenerativa, como onde células-tronco de folículos dentários humanos poderiam ser geneticamente modificadas para melhorar suas propriedades terapêuticas. A principal vantagem dessa técnica é que as células-tronco podem ser modificadas pela introdução de microRNA sem o risco de integração estável do genoma. Inicie o procedimento para digestão enzimática dos dois folículos, pré-aquecimento à temperatura ambiente, célula-tronco folículo dentário humano ou solução de cultura hDFSC e solução PBSPSG.Descongele uma alíquota cada uma das soluções de estoque Tipo I e Dispase II. Prepare uma solução de digestão adicionando 500 microliters da solução de estoque tipo I de Collagenase e 500 microliters da solução de estoque Dispase II a 4 mililitros de Basal Medium contendo 1% de agente antibiótico. Para evitar a contaminação do local durante o isolamento de células-tronco de torção de folículos dentários humanos e os meios de cultura utilizados devem conter agentes antibióticos.Coloque um folículo de dente extraído em uma placa de Petri estéril. Adicione 10 mililitros de solução PBSPSG para lavar o tecido extraído. Aspire e descarte a solução e adicione uma solução PBSPSG fresca para repetir a lavagem.Usando um bisturi estéril, pique o folículo extraído em pedaços se cerca de 1 por 1 milímetro. Transfira o tecido picado e a solução PBSPSG da placa de Petri em um tubo de centrífuga cônica de 50 mililitros, lave a placa de Petri com 10 mililitros de solução PBSPSG e transfira a solução para o mesmo tubo. Centrifugar o tubo cônico a 353 x g em temperatura ambiente por dez minutos.Adicione 5 mililitros de solução de digestão ao tecido palleted, misture suavemente a solução e o tecido, incubar a mistura a 37 graus celsius e 5% de CO2 em uma incubadora de agitação por duas horas. Após duas horas, centrifufique a suspensão de células e tecidos digeridos a 353 g por dez minutos em temperatura ambiente. Descarte o supernatante e suspenda a palete obtida em 6 mililitros de meio de cultura HDFSC.Semear a suspensão celular em um frasco de cultura celular de 25 centímetros quadrados, e incubar as células a 37 graus celsius. Após a colheita celular e a caracterização do HDFSC é como descrito no protocolo de texto, as sementes hDFSCs em uma placa de cultura celular de 24 poços. Incubar a 37 graus celsius, 5%DE CO2 e 20% oxigênio por 24 horas.No dia seguinte dilui 40 picomoles de microRNA em 66,7 microliters de meio soro reduzido, e vórtice da solução. Diluir 0,67 microliters à base lipídica, reagente de transfecção em 66,7 microliters de meio soro reduzido, vórtice da solução e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Após cinco minutos adicione o microRNA pré-ludo ao reagente de transfecção pré-diluído, misture a solução e incubar à temperatura ambiente por quinze minutos.Em seguida, adicione as complexidades de transfecção preparadas, dropwise, diretamente ao meio de cultura nas células. Misture suavemente balançando a placa de cultura celular 24 bem para frente e para trás. Incubar as células a 37 graus celsius por 24 horas.24 horas após a transfecção, colecione o sobrenatário de amostras em seus respectivos tubos de centrífuga cônica de 15 mililitros. Lave as células com 1 mililitro de PBS e transfira o PBS para o respectivo tubo de centrífuga. Adicione 500 microliters de gotejamentos e EDTA às células, e incubar a placa de 24 poços a 37 graus celsius, por 3 minutos.Pare a trippsinização adicionando 1 mililitro de meio de cultura celular para as células e transferindo a solução para o respectivo tubo de centrífuga. Centrifugar as células a 300 x g e 4 graus celsius por dez minutos. A partir de agora mantenha as células e reagentes no gelo, a menos que seja dito o contrário.Descarte o supernascer, resuspenja as células em 100 microliters de tampão de coloração, e transfira a solução celular para um tubo de microcentrifuge de 1,5 mililitro. Adicione 0,5 mililitros de corante reativo de amina a cada amostra, a fim de distinguir entre células vivas e mortas. Misture suavemente a solução e incubar a 4 graus celsius por dez minutos.Adicione 1 mililitro de PBS às células, e centrífuga a 300g e 4 graus celsius por dez minutos Descarte o supernatante e resuspenque as células em 100 microliters de PBS, adicione 33 microliters de paraformaldeído, e misture as soluções, armazene as amostras a 4 graus celsius protegidos da luz até as medições citométricas de fluxo. Transfira as amostras para tubos adequados para medições citométricas de fluxo e realize a citometria de fluxo usando a estratégia de gating descrita no protocolo de texto. As células-tronco do folículo dentário humano isolado mostraram todas as características descritas para a definição de células estromais mesenquimais, as células eram aderentes ao plástico e exibiam uma fibra de vidro como a morfologia, em condições de cultura padrão.A análise citométrica de fluxo revelou que os hDFSCs expressaram um painel de certos antígenos de superfície, incluindo CD29, CD44, CD73, CD90 e CD105. Enquanto CD45 e CD117 estavam ausentes. Os potenciais adipogênicos, osteogênicos e condrogênicos de diferenciação de células sob condições específicas de cultura In Vitro foram confirmados por imunostaining, uma proteína de ligação de ácido graxo para:Osteocalcina e Aggrecan.A estratégia de gating utilizada para a quantificação da citotoxicidade e da eficiência de absorção de microRNA rotulada cy3 24 horas após a transfecção, confirmou a absorção de microRNA em 100% das células viáveis. Quantidades comparáveis de células mortas em amostras transfecidas e não transtraísicas indicam que o microRNA é introduzido eficientemente sem efeitos citotóxicos. Após esse procedimento, outros métodos como a transdiferenciação podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como a plasticidade cytolab.

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