Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por el programa de Cajamarca del centro médico de la Universidad de Rostock (889018) y la Fundación húmeda (2016-11). Además, P.M. y R.D. son apoyados por el BMBF (VIP + 00240).

HDFSCs están aisladas de los folículos dentales de los dientes extraídos de la sabiduría proporcionados por el Departamento de Cirugía Oral y maxilofacial plástico de Rostock University Medical Center. Se obtuvo consentimiento informado y autorización por escrito de todos los pacientes. Este estudio fue autorizado por el Comité de ética local de la Universidad de Rostock (permiso No. A 2017-0158).
1. aislamiento de hDFSCs
Nota: Para evitar la...

Las células madre adultas están en foco para el tratamiento de varias enfermedades degenerativas. En particular, ósea la médula (BM)-derivado de las células madre, incluyendo las células madre hematopoyéticas (HSCs) y MSCs, están bajo intensa investigación clínica47. Sin embargo, BM la cosecha es un procedimiento invasivo que causa dolor en el sitio de la donación y puede conducir a eventos adversos48. Recientemente, el tejido dental postnatal ha emergido como un...

El folículo dental humano es un flojo Tejido fino conectivo de derivados de ectomesenchymally que rodea el diente en desarrollo1,2. Al lado de su función de coordinar la osteoclastogénesis y osteogénesis para el proceso de erupción del diente, este tejido presenta células madre y progenitoras especialmente para el desarrollo del periodonto3,4,5. Por lo tanto, el folículo dental se considera como una fuente alternativa para cosechar las células madre adultas humanas6,7.
Varios estudios demostraron que las células madre del folículo dental humana (hDFSCs) son capaces de diferenciarse en el linaje periodontal incluyendo osteoblastos, fibroblastos del ligamento y cementoblastos8,9,10 . Además, estas células fueron demostradas para que coincida con todas las características de las células estromales mesenquimales (MSCs) incluyendo la capacidad de auto renovación, adhesión plástica, expresión de marcadores de superficie específicos (por ejemplo,, CD73, CD90, CD105) así como osteogénico, adipogenic y condrogénica diferenciación potencial11,12,13. Otros estudios también revelaron un potencial de diferenciación de los nervios de hDFSCs2,14,15,16,17,18.
Debido a sus prometedoras propiedades y fácil acceso, hDFSCs se convirtió recientemente relevantes para tejido ingeniería19,20,21. Los primeros estudios se concentraron en el potencial de DFSCs para regenerar hueso periodontal y dientes raíces19,22,23,24,25,26, 27,28,29,30. Desde el conocimiento de la capacidad neurogénica de hDFSCs, su aplicación como tratamiento potencial para las enfermedades neurodegenerativas ha sido investigado31,32,33. HDFSCs también han cobrado importancia con respecto a la regeneración de otros tejidos (p. ej., epitelio corneal)34,35. El potencial terapéutico de hDFSC no se basa sólo en su potencial de diferenciación directa sino también en su actividad paracrina. Recientemente, hDFSCs se han demostrado para secretar una gran cantidad de factores bioactivos, como las metaloproteinasas de matriz (MMPs), factor de crecimiento insulínico (IGF), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), factor de crecimiento básico del fibroblasto (bFGF) y el crecimiento de hepatocito factor (HGF), que desempeñan un papel crucial de la angiogénesis, inmunomodulación, remodelación de la matriz extra celular y procesos reparativos36.
Sin embargo, amplia traducción clínica de la terapia de células madre se deteriora aún por varios desafíos, como la muerte masiva de células iniciales y células beneficioso bajo efectos37,38. Ingeniería genética proporciona una estrategia prometedora para abordar estos desafíos y por lo tanto, puede realzar grandemente la eficacia terapéutica de células madre38,39,40. Para la manipulación de celda transitoria, microRNAs (miRs) son los candidatos idóneos, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de las células madre sin el peligro de genoma estable integración41,42, 43. hasta la fecha, se han identificado varios miRs beneficiosos promover la proliferación de la célula de vástago, supervivencia, homing, actividad paracrina, así como su diferenciación en varios linajes44. Por ejemplo, miR-133a ingeniería MSCs mostraron un aumento de la supervivencia y el engraftment en corazones de rata infartado, dando por resultado una función cardíaca mejorada en comparación con MSCs45. Además, miR-146a MSCs expresando mostraron secretan mayores cantidades de VEGF, que a su vez condujo a una mayor eficacia terapéutica en el tejido isquémico46.
Este manuscrito presenta un protocolo detallado para la extracción selectiva y la ingeniería genética de hDFSCs. Para ello, describimos la digestión enzimática y cosecha de los folículos dentales humanas, así como el aislamiento posterior de hDFSCs. Para caracterizar las células aisladas, instrucciones importantes para la verificación de propiedades MSC se han incluido siguiendo las directrices de la sociedad internacional de terapia celular13. Además, ofrecemos una descripción detallada para la generación de hDFSCs miR-modificado por aplicación de una estrategia de transfección basada en lípidos catiónicos y la evaluación de la eficiencia de transfección y citotoxicidad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

Hasta la fecha, varios tipos de células madre en diferentes etapas de desarrollo están en el foco para el tratamiento de enfermedades degenerativas. Sin embargo, ciertos aspectos, como la muerte celular masiva inicial y bajos efectos terapéuticos, problemas de su traducción clínica amplia. Ingeniería genética de células antes del trasplante surgió como un método prometedor para optimizar los efectos terapéuticos de células madre. Sin embargo, todavía carecen de sistemas de entrega de genes seguros y eficientes. Por lo tanto, el desarrollo de métodos adecuados puede proporcionar un enfoque para resolver los retos actuales en terapias basadas en células madre.
El presente Protocolo describe la extracción y caracterización de células madre de folículo dental humana (hDFSCs) así como su modificación genética no-virales. El folículo dental postnatal dio a conocer como una fuente prometedora y de fácil acceso para la recolección de las células madre adultas multipotentes que poseen potencial de proliferación alta. El procedimiento de aislamiento descrito presenta un método simple y confiable para cosechar hDFSCs de cordales. Este protocolo incluye también métodos para definir las características de células madre de células aisladas. Para la ingeniería genética de hDFSCs, una estrategia optimizada transfección catiónico base de lípidos se presenta introducción de microARN altamente eficiente que permite sin producir efectos citotóxicos. MicroRNAs son candidatos adecuados para la manipulación de celda transitoria, como estos pequeños reguladores traslacionales controlan el destino y el comportamiento de células madre sin el peligro de la integración del genoma estable. Así, este protocolo representa un procedimiento seguro y eficaz para la ingeniería de hDFSCs que puede llegar a ser importante para la optimización de su eficacia terapéutica.

Aquí, presentamos una instrucción detallada aislamiento cosecha hDFSCs del tejido del folículo dental humana. Por el fácil acceso del folículo dental durante la cirugía de rutina, es una fuente prometedora para la extracción de células madre adultas.
El hDFSCs aislado demostró todas las características descritas para la definición de MSCs13. De hecho, las células eran de plástico adherente de...

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Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Este protocolo describe la ingeniería genética transitoria de células dentales extraídas del folículo dental humano. La estrategia de modificación no aplicada puede llegar a ser una base para la mejora de los productos terapéuticos de células madre.

Aislamiento, caracterización y MicroRNA basado en la modificación genética de las células madre del folículo Dental humano

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la medicina regenerativa, como donde las células madre de un folículo dental humano podrían ser genéticamente diseñadas para mejorar sus propiedades terapéuticas. La principal ventaja de esta técnica es que las células madre pueden ser modificadas por la introducción del microRNA sin el peligro de una integración del genoma estable. Comience el procedimiento para la digestión enzimática de los dos folículos, precalentándolo a temperatura ambiente, células madre del folículo dental humano o medio de cultivo hDFSC y solución PBSPSG.Descongelar una alícuota cada una de las soluciones de stock de Colágenonase tipo I y Dispase II. Preparar una solución de digestión añadiendo 500 microlitros de la solución de stock de colagenasa tipo I y 500 microlitros de la solución de stock Dispase II a 4 mililitros de basal Medium que contienen un 1% de agente antibiótico. Para evitar la contaminación del sitio durante el folículo dental humano, los tampones de lavado de células madre y los medios de cultivo utilizados deben contener agentes antibiótico.Coloque un folículo dental extraído en un plato estéril de Petri. Añadir 10 mililitros de solución de PBSPSG para lavar el tejido extraído. Aspirar y desechar la solución y añadir la solución PBSPSG fresca para repetir el lavado.Usando un escalón estéril picar el folículo extraído en pedazos si aproximadamente 1 por 1 milímetros. Transfiera el tejido picado y la solución PBSPSG de la placa Petri a un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros, lave el plato Petri con 10 mililitros de solución PBSPSG y transfiera la solución al mismo tubo. Centrifugar el tubo cónico a 353 x g a temperatura ambiente durante diez minutos.Añadir 5 mililitros de solución digestiva al tejido paletizado, mezclar suavemente la solución y el tejido, incubar la mezcla a 37 grados centígrados y 5%CO2 en una incubadora de agitación durante dos horas. Después de dos horas, centrifugar la suspensión digerida de la célula y el tejido a 353 g durante diez minutos a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el palet obtenido en 6 mililitros de medio de cultivo HDFSC.Siembra la suspensión celular en un matraz de cultivo celular de 25 centímetros cuadrados, e incuba las células a 37 grados centígrados. Después de la recolección celular y la caracterización de HDFSC es como se describe en el protocolo de texto, hDFSC semilla en una placa de cultivo celular de 24 pozos. Incubar a 37 grados centígrados, 5%CO2 y 20%Oxígeno durante 24 horas.Al día siguiente diluye 40 picomoles de microARN en 66,7 microlitros de medio sérico reducido, y vórtice la solución. Diluir 0,67 microlitros de reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos en 66,7 microlitros de medio sérico reducido, vórtice la solución e incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos añadir el microARN prediluido al reactivo de transfección prediluminado, mezclar la solución e incubar a temperatura ambiente durante quince minutos.A continuación, agregue las complejidades de la transfección preparadas, por gota, directamente al medio de cultivo en las células. Mezcle suavemente balanceando la placa de cultivo celular de 24 pozos de ida y vuelta. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 24 horas.24 horas después de la transfección, recoger el sobrenadante de muestras en los respectivos tubos de centrífuga cónica de 15 mililitros. Lavar las células con 1 mililitro de PBS y transferir el PBS al tubo centrífugo respectivo. Añadir 500 microlitros de goteos y EDTA a las células, e incubar la placa de 24 pozos a 37 grados centígrados, durante 3 minutos.Detenga la tripsinación añadiendo 1 mililitro de medio de cultivo celular para las células y transfiriendo la solución al tubo de centrífuga respectivo. Centrifugar las células a 300 x g y 4 grados centígrados durante diez minutos. A partir de ahora, mantenga las células y los reactivos en hielo a menos que se indique lo contrario.Deseche el sobrenadante, resuspendir las células en 100 microlitros de tampón de tinción y transferir la solución celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Añadir 0,5 mililitros de tinte reactivo de amina a cada muestra para distinguir entre células vivas y muertas. Mezclar suavemente la solución e incubar a 4 grados centígrados durante diez minutos.Añadir 1 mililitro de PBS a las células, y centrífuga a 300 g y 4 grados celsius durante diez minutos Deseche el sobrenadante y resusppend las células en 100 microlitros de PBS, agregue 33 microlitros de paraformaldehído, y mezcle las soluciones, almacene las muestras a 4 grados centígrados protegidos de la luz hasta la medición citométrica de flujo. Transfiera las muestras a tubos adecuados para mediciones citométricas de flujo y realice la citometría de flujo utilizando la estrategia de medición descrita en el protocolo de texto. Las células madre aisladas del folículo dental humano mostraron todas las características descritas para la definición de células estromales mesenquimales, las células eran de plástico adherente y mostraban una fibra de vidrio como morfología, en condiciones de cultivo estándar.El análisis citométrico de flujo reveló que los hDFSC expresaban un panel de ciertos antígenos superficiales, incluidos CD29, CD44, CD73, CD90 y CD105. Mientras que CD45 y CD117 estaban ausentes. Los potenciales de diferenciación adipogénico, osteogénico y condrógeno de las células bajo condiciones específicas de cultivo in Vitro se confirmaron mediante inmunosu mancha, una proteína de unión a ácidos grasos para:Osteocalcin y Aggrecan.La estrategia de medición utilizada para la cuantificación de la citotoxicidad y la eficiencia de absorción de microARNes etiquetada Cy3 24 horas después de la transfección, confirmó la absorción de microARN en el 100% de las células viables. Cantidades comparables de células muertas en muestras transinfectosas y no transinfectados indican que el microARN se introduce eficientemente sin efectos citotóxicos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la transdiferenciación para responder a preguntas adicionales como plasticidad de Cytolab.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Investigación

Genética

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