Name: isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells
Uploaded: 2018-11-16T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Bu eser Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi (889018) ve nemli Vakfı (2016-11) FORUN Program tarafından desteklenmiştir. Buna ek olarak,'da ve R.D. BMBF (VIP + 00240) tarafından desteklenmektedir.

HDFSCs çıkarılan yirmilik dişler bölümü Oral ve Maksillofasiyal Cerrahi plastik cerrahi Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından sağlanan diş köklerinin etkilenmezsiniz. Aydınlatılmış onam ve yazılı onayı elde edilen tüm hastalar. Bu çalışmada Rostock Üniversitesi (izni Hayır ' 2017-0158) Yerel Etik Komitesi tarafından yetkilendirilmiştir.
1. hDFSCs yalıtım
Not: Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için yirmilik dişler...

Erişkin kök hücrelerin şu anda birçok dejeneratif hastalıkların tedavisi için odak vardır. Özellikle, kemik iliği (BM)-hematopoetik kök hücre (HSCs) de dahil olmak üzere, kök hücre elde edilen ve MSCs, yoğun klinik soruşturma47altında. Ancak, BM hasat bağış yerinde ağrı neden invaziv bir işlemdir ve istenmeyen olaylar48olarak yol açabilir. Son zamanlarda, Doğum sonrası diş dokusu bir roman ve kök hücre için kolayca erişilebilir kaynak olarak...

İnsan diş kökü bir gevşek ectomesenchymally kaynaklı bag gelişmekte olan diş1,2çevreleyen doku var. Işlevini koordinat osteoclastogenesis ve osteogenesis diş Erüpsiyonu işleminin, özellikle periodontium3,4,5geliştirilmesi için kök ve progenitör hücrelerin bu doku liman. Bu nedenle, diş kökü insan yetişkin kök hücreleri6,7hasat için alternatif bir kaynak olarak kabul edilir.
Çeşitli çalışmalarda insan diş kökü kök hücreler (hDFSCs) dokusunu, bağ fibroblastlar ve cementoblasts8,9,10 da dahil olmak üzere periodontal lineage ayırt yetenekli olduğunu gösterdi . Ayrıca, bu hücreler kendini yenileyerek kapasitesi, plastik bağlılık, ifade belirli yüzey işaretleri de dahil olmak üzere tüm özellikleri mezenkimal stromal hücre (MSCs) Maç gösterilmiştir (örneğin, CD73, CD90, CD105) olarak osteojenik de, Adipojenik ve chondrogenic farklılaşma potansiyeli11,12,13. Diğer çalışmalar da hDFSCs2,14,15,16,17,18bir sinirsel farklılaşma potansiyeli ortaya koydu.
Umut verici özellikleri ve kolay erişim nedeniyle, hDFSCs doku mühendisliği19,20,21için son zamanlarda ilgili oldu. İlk çalışmalar DFSCs potansiyeli kemik, periodontal yeniden üzerinde yoğunlaştı ve19,22,23,24,25,26Diş kökleri, 27,28,29,30. HDFSCs nörojenik yeteneğini bilen beri onların uygulama nörodejeneratif hastalıklar için olası tedavi olarak incelenen31,32,33olmuştur. HDFSCs da ile mineral için önem kazandı diğer dokulara (Örneğin, kornea epitel)34,35rejenerasyon. HDFSC tedavi edici potansiyel sadece onların doğrudan farklılaşma potansiyeli aynı zamanda parakrin faaliyetlerini dayalı değildir. Son zamanlarda, hDFSCs bir servet matriks metalloproteinazların (MMPs), insülin benzeri büyüme faktörü (IGF), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve Hepatosit büyüme gibi biyoaktif faktörlerin salgılar gösterilmiştir faktör (HGF), anjiogenez, immunomodulation, ekstra hücresel matris remodeling ve onarıcı süreçleri36için çok önemli bir rol oynamaktadır.
Ancak, kök hücre tedavisinin geniş klinik çeviri hala büyük ilk hücre ölümü ve düşük faydalı kök hücre etkileri37,38gibi çeşitli sorunlar tarafından Engelli. Genetik Mühendisliği bu sorunları ele almak üzere bir umut verici strateji sağlar ve bu nedenle kök hücre38,39,40tedavi edici etkinliği büyük ölçüde geliştirebilirsiniz. Bu küçük translasyonel düzenleyiciler kader ve kök hücre istikrarlı genom tümleştirme41,42, tehlike olmadan davranışını kontrol uygun adaylar, mikroRNA (miRs) geçici hücre manipülasyon için şunlardır 43. bugüne kadar birkaç yararlı miRs kök hücre çoğalması, hayatta kalma, posta, parakrin aktivite yanı sıra kendi farklılaşma içine birkaç soy44teşvik tespit edilmiştir. Örneğin, miR-133a hazır sıçan kalpler değiştirilmemiş MSCs45ile karşılaştırıldığında geliştirilmiş bir kardiyak fonksiyon sonuçlanan bir artan hayatta kalma ve engraftment gösterdi MSCs mühendislik. Aynı şekilde, miR-146a overexpressing MSCs iskemik doku46gelişmiş bir terapötik verimliliği için sırayla açan VEGF daha yüksek miktarda salgılaması için gösterildi.
Bu el yazması seçici ayıklama ve hDFSCs genetik mühendisliği için detaylı bir Protokolü sunar. Bu amaçla, biz insan diş köklerinin hasat ve enzimatik sindirim yanı sıra hDFSCs sonraki yalıtım nitelendirdi. İzole hücreleri ayırdetmek için MSC özellikleri doğrulanması için önemli talimatlar için hücresel tedavi13uluslararası toplumun kurallarına uygun olarak dahil edilmiştir. Buna ek olarak, biz katyonik lipit tabanlı transfection strateji ve transfection verimliliği ve sitotoksisite değerlendirilmesi uygulayarak hDFSCs miR-modified nesil için ayrıntılı bir açıklama sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse anti Human CD105 Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA1557A488</td>
			<td>Clone SN6, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse IgG1 Negative Control Antibody: Alexa Fluor 488</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>MCA928A488</td>
			<td>monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD29 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559883</td>
			<td>Clone MAR4, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555751</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse Anti-Human CD73 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550257</td>
			<td>Clone AD2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555749</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse Anti-Human CD117 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>339217</td>
			<td>Clone 104D2, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557872</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD44 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560531</td>
			<td>Clone G44-26, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>558304</td>
			<td>Clone 27-35, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse Anti-Human CD90&#160;Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>561557</td>
			<td>Clone 5E10, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP-Cy5.5 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>55095</td>
			<td>Clone MOPC-21, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse Anti-Human CD45 Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560777</td>
			<td>Clone HI30, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V500 Mouse IgG1, &#954; Isotype Control Antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560787</td>
			<td>Clone X40, monoclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking Reagent, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15575-020</td>
			<td>0.5M, pH 8.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steritop</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td>0.22 &#181;m, radio-sterilized, polyethersulfone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1040051000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Mesenchymal Stem Cell Functional Identification Kit</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>SC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase decontamination solution; RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17120</td>
			<td>5 nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM17110</td>
			<td>5nmol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cationic lipid-based transfection reagent; Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reduced serum medium; Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11055</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-21202</td>
			<td>polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium; Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6057-20ML</td>
			<td>histology mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS LSRII flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software 6.1.2</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2011 software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA solution (0.05%/ 0.02%)</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L2143</td>
			<td>in PBS, w/o: Ca2+, Mg2+</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine reactive dye; LIVE/DEAD&#8482; Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>L10119</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (1x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010023</td>
			<td>pH: 7.4; w/o: Ca and Mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>P-S-G (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10378016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basal medium; Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11039021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic, ZellShield</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>W 13-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type I</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17105041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter, Sterifix syringe filter 0.2 &#181;m</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4099206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50&#160;mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,547,254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62,554,502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask 75 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,910,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask, 25 cm2</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>833,911,002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing medium, Biofreeze</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>F 2270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryotubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>377267</td>
			<td>1.8 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td>0.4 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Counting chamber</td>
			<td>Paul Marienfeld</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Local anesthetic, Xylocitin (lidocaine hydrochloride) 2% with epinephrine (adrenaline) 0.001%</td>
			<td>Mibe</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl solution</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td>0.9 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vicryl satures, Vicryl rapide</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>3 - 0</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation, characterization and microrna-based genetic modification of human dental follicle stem cells

Bugüne kadar odak dejeneratif hastalıkların tedavisi için farklı gelişim aşamalarında birkaç kök hücre türü vardır. Henüz, ilk büyük hücre ölümü ve düşük tedavi edici etkileri, gibi belirli özellikleri onların geniş klinik çeviri bozulmuş. Genetik Mühendisliği kök hücre nakli öncesinde tedavi kök hücre efektleri optimize etmek için umut verici bir yöntemi olarak ortaya çıktı. Ancak, güvenli ve verimli gen vasıtalarının hala eksik. Bu nedenle, uygun yöntem geliştirme kök hücre tabanlı tedaviler mevcut sorunları çözmek için bir yaklaşım sağlayabilir.
Mevcut Protokolü çıkarma ve karakterizasyonu insan diş kökü kök hücre (hDFSCs) yanı sıra kendi viral genetik değişiklik açıklar. Doğum sonrası diş kökü yüksek yayılma potansiyeli haiz yetişkin multipotent kök hücre hasat için umut verici ve kolayca erişilebilir bir kaynak olarak açıkladı. Açıklanan yalıtım yordamı hDFSCs gömülü yirmi yaş dişleri üzerinden hasat için basit ve güvenilir bir yöntem sunuyor. Ayrıca bu iletişim kuralı izole hücreler kök hücre özelliklerini tanımlamak için yöntem oluşmaktadır. Genetik mühendisliği için hDFSCs, bir en iyi duruma getirilmiş katyonik lipit tabanlı transfection strateji sitotoksik efekt neden olmadan sağlayan yüksek verimli mikroRNA giriş sunulmaktadır. Bu küçük translasyonel düzenleyiciler kader ve kök hücre istikrarlı genom tümleştirme tehlike olmadan davranışını kontrol mikroRNA'lar geçici hücre düzenleme, uygun adayları şunlardır. Böylece, bu iletişim kuralını onların tedavi edici etkinliği optimize etmek için önemli hale gelebilir hDFSCs Mühendisliği için güvenli ve verimli yordamı temsil eder.

Burada, hDFSCs insan diş kökü dokusundan hasat için detaylı yalıtım talimat mevcut. Rutin bir ameliyat sırasında diş kökü kolay erişim nedeniyle, bu yetişkin kök hücreleri çıkarım için umut verici bir kaynaktır.
İzole hDFSCs MSCs13tanımı için açıklanan tüm özellikleri gösterdi. Aslında, plastik-yapışık hücreleri küçük kültür koşulları açıklanan ve fibroblast ben...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells at JoVE.com

Isolation, Characterization and MicroRNA-based Genetic Modification of Human Dental Follicle Stem Cells

Bu iletişim kuralı insan diş kökü çıkarılan diş kök hücrelerin geçici genetik mühendisliği açıklar. Uygulanan non-viral değişiklik strateji tedavi kök hücre ürünlerin geliştirilmesi için bir temel olabilir.

Yalıtım, karakterizasyonu ve insan diş kökü kök hücrelerin genetik değişiklik mikroRNA tabanlı

To date, several stem cell types at different developmental stages are in the focus for the treatment of degenerative diseases. Yet, certain aspects, such ...

Bu yöntem Rejeneratif Tıp alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, bir insan diş folikül kök hücreleri genetik olarak tedavi özelliklerini geliştirmek için tasarlanmış olabilir gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, kök hücrelerin kararlı genom entegrasyonu tehlikesi olmadan mikroRNA girişi ile modifiye edilebilmektedir. Oda sıcaklığına, insan diş folikülü kök hücresine veya hDFSC kültür ortamına ve PBSPSG çözeltisine önceden ısıtılarak iki folikülün enzimatik sindirim prosedürüne başlayın.Çözülme bir aliquot her Kollajenaz tip I ve Dispase II stok çözümleri. Kollajenaz tip I stok çözeltisi 500 mikrolitre ve% 1 antibiyotik ajan içeren Bazal Medium 4 mililitre Dispase II stok çözeltisi 500 mikrolitre ekleyerek bir sindirim çözümü hazırlayın. İnsan diş folikülü kök hücre izolasyonu sırasında site kontaminasyonunu önlemek için yıkama tamponları ve kullanılan kültür ortamı antibiyotik ajanlar içermelidir.Steril petri kabına çıkarılmış bir diş folikülü yerleştirin. Çıkarılan dokuyu yıkamak için 10 mililitre PBSPSG çözeltisi ekleyin. Aspirat ve çözelti atın ve yıkama tekrarlamak için taze PBSPSG çözeltisi ekleyin.Steril bir neşter kıyma kullanarak parçalarhalinde çıkarılan folikül eğer 1 ile 1 milimetre. Kıyma lı dokuyu ve PBSPSG çözeltisini Petri kabından 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın, Petri kabını 10 mililitre PBSPSG çözeltisi ile yıkayın ve çözeltiyi aynı tüpe aktarın. Konik tüpü oda sıcaklığında 353 x g'de on dakika santrifüj edin.Paletli dokuya 5 mililitre sindirim çözeltisi ekleyin, çözeltiyi ve dokuyu hafifçe karıştırın, karışımı 37 santigrat derecede ve %5 CO2'de iki saat boyunca sallayarak kuvözde kuluçkaya yatırın. İki saat sonra, oda sıcaklığında on dakika boyunca 353 g sindirilmiş hücre ve doku süspansiyon santrifüj. Supernatant atın ve HDFSC kültür orta 6 mililitre elde edilen palet yeniden askıya.Hücre süspansiyonuna 25 santimetre karelik bir hücre kültür şişesinde tohum atve hücreleri 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücre hasadı ve HDFSC karakterizasyonu metin protokolünde açıklandığı gibi sonra, 24 iyi hücre kültür plakası tohum hDFSCs. 24 saat boyunca 37 santigrat derece, %5 CO2 ve %20 Oksijen ile kuluçkaya yat.Ertesi gün azaltılmış serum orta 66.7 mikrolitre mikroRNA mikroRNA 40 pikomol seyreltmek ve çözelti girdap. Katyonik lipid bazlı 0,67 mikrolitre seyreltin, azaltılmış serum orta 66.7 mikrolitre transfeksiyon reaktif, çözelti girdap, ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Beş dakika sonra önceden seyreltilmiş mikroRNA önceden seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi ekleyin, çözelti karıştırın ve on beş dakika oda sıcaklığında kuluçka.Daha sonra, hazırlanan transfeksiyon karmaşıklıkları, dropwise, doğrudan hücreler üzerinde kültür ortamı ekleyin. 24 iyi hücre kültürü plakasını ileri geri sallayarak hafifçe karıştırın. Hücreleri 24 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Transfeksiyondan 24 saat sonra, 15 mililitrelik konik santrifüj tüplerinde numunelerin süpernatantını toplayın. Hücreleri 1 mililitre PBS ile yıkayın ve PBS'yi ilgili santrifüj tüpüne aktarın. Hücrelere 500 mikrolitre damla ve EDTA ekleyin ve 24 kuyu plakasını 3 7 santigrat derecede 3 dakika kuluçkaya yatırın.Hücreler için hücre kültürü ortamı 1 mililitre ekleyerek ve ilgili santrifüj tüpü içine çözüm aktararak tripsinizasyon durdurun. Hücreleri 300 x g ve 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Aksi belirtilmedikçe hücreleri ve reaktifleri buzüzerinde tutun.Supernatant atın, boyama tampon 100 mikrolitre hücreleri resuspend, ve 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp hücre çözeltisi aktarın. Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için her örneğe 0,5 mililitre amin reaktif boya ekleyin. Çözeltiyi hafifçe karıştırın ve 10 dakika boyunca 4 derecede kuluçkaya yatırın.Hücrelere 1 mililitre PBS ekleyin ve 10 dakika boyunca 300g ve 4 santigrat derecede santrifüj atın Süpernatant'ı atın ve pbs'nin 100 mikrolitresi ndeki hücreleri yeniden askıya alın, 33 mikrolitre paraformaldehit ekleyin ve çözümleri karıştırın, numuneleri akış sitometrik ölçümlerine kadar ışıktan korunan 4 derece santigrat derecede saklayın. Örnekleri akış sitometrik ölçümleri için uygun tüplere aktarın ve metin protokolünde açıklanan gating stratejisini kullanarak akış sitometrisi gerçekleştirin. İzole insan diş folikül kök hücreleri mezenkimal stromal hücrelerin tanımı için açıklanan tüm özellikleri gösterdi, hücreler plastik yapışık ve morfolojisi gibi bir fiberglas görüntülenen, standart kültür koşulları altında.Akış sitometrik analizi, hDFSC'lerin CD29, CD44, CD73, CD90 ve CD105 gibi belirli yüzey antijenlerinden oluşan bir paneli ifade ettiğini ortaya çıkardı. CD45 ve CD117 yokiken. Belirli In Vitro kültür koşulları altında hücrelerin adipojenik, osteojenik ve kondrojenik farklılaşma potansiyelleri immünboyama ile doğrulandı, için bir yağ asidi bağlayıcı protein:Osteokalsin, ve Aggrecan.Sitotoksisite ve Cy3'ün sayısallaştırılması için kullanılan gating stratejisi, transfeksiyon sonrası 24 saat mikroRNA alım verimliliğini etiketledi, canlı hücrelerin %100'ünde mikroRNA alımını doğruladı. Transfektasyonlu ve transfektasyonsuz örneklerdeki ölü hücrelerin karşılaştırılabilir miktarları mikroRNA'nın sitotoksik etkiler olmadan verimli bir şekilde sunulduğuna işaret eder. Bu prosedürü takiben Cytolab plastisite gibi ek soruları cevaplamak için transdifferentiation gibi diğer yöntemler de uygulanabilmektedir.

Research

JoVE Journal

Genetics

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Yapay Faktörler Mühendislik Özellikle İnsan Hücreleri alternatif bağlantı işleyin için

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA değişiklikler için Immunostaining: Confocal görüntülerin sayısal analiz

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Generation of a Gene-disrupted Streptococcus mutans Strain Without Gene Cloning

Nesil bir gen kesintiye Streptococcus mutans çoğunlukla zorlanma olmadan Gen Klonlama

Typical methods for the elucidation of the function of a particular gene involve comparative phenotypic analyses of the wild-type strain and a strain in ...

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Constitutive and Inducible Systems for Genetic In Vivo Modification of Mouse Hepatocytes Using Hydrodynamic Tail Vein Injection

Hidrodinamik kuyruk ven enjeksiyon kullanarak fare tetkikine genetik Vivo içinde değişiklik kurucu ve indüklenebilir sistemleri

In research models of liver cancer, regeneration, inflammation, and fibrosis, flexible systems for in vivo gene expression and silencing are highly ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

Endojen Protein insan etiketleme Pluripotent kök hücre kullanarak CRISPR/Cas9 indüklenen

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

İzole, sıralama ve insan Mezenkimal Kök hücreleri ekstrasellüler mikroRNA'lar analiz

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hazırlık ve Nonhuman primat hematopoetik kök ve progenitör hücrelerin gen modifikasyonu

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...