Name: visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context with an rna in situ hybridization assay
Uploaded: 2018-08-14T14:30:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

Человека опухоли образцы, используемые в данном исследовании были deidentified и приобрела из коммерческих источников в соответствии с местными этические руководящие принципы для исследований человеческого.
1. образец, оборудование и подготовка реагента
<ol><li>
Подготовка образца FFPE
	<ol>
<li>Ткани<ol>
<li>Сразу после вскрытия, исправить ткани (нарезать блоки 3-4 мм в толщину) в 10% буферизацией нейтрального формалина (NBF) для 16-32 ч при комнатной температуре (RT). Примечание: Время фиксации будет варьироваться в зависимости от типа ткани и размер.</li>
			<li>Вымойте образца с 1 x фосфат амортизированное saline (PBS) и обезвоживанию, с помощью ряда стандартных этанола (EtOH) (70% EtOH за 30-60 мин, 80% EtOH за 30-60 мин, 90% EtOH для 30 – 60 минут, 95% EtOH за 30-60 мин, 3 x 100% для EtOH 30-60 мин) следуют ксилол.</li>
			<li>Внедрить образца в парафин, используя стандартные процедуры6 и обрезать парафиновых блоков при необходимости для удаления избыточных парафина. Примечание: Размер блока будет варьироваться в зависимости от размера выборки ткани, но типичный размер – 0.75 x 0,75 дюйма2 или меньше.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Линии клетки<ol>
<li>Собирать и Пелле клетки согласно Рекомендуемые методы для конкретной ячейки строки.</li>
			<li>Исправьте клетки в 10% формальдегида на RT для 24 h на ротатора.</li>
			<li>Подготовка клетки как гранулы в подогретую обработки гель (например., Histogel). Разрешить Пелле затвердеть, поместив гель клеточной гранул на кусок парафина на льду и пусть сидят на 2 – 3 мин Submerge гель клеточной Пелле в однократном ПБС.</li>
			<li>Обезвоживанию и вставлять ячейки гранулы, как описано в шаге 1.1.1.</li>
		</ol>
</li>
		<li>В разделе Подготовка<ol>
<li>Нарезать 5 ± 1 мкм разделы, используя микротом встроенных ткани/клетки, смонтировать разделы на слайдах электростатически клей стекла и просушите их на ночь на RT. Примечание: Слайды могут храниться на RT под высыхания до 3-х месяцев.</li>
			<li>Место слайды в стойку слайд и выпекать навесные ткани слайды в циркулирующего воздуха печи при 60 ° C для 1 h перед выполнением assay. Примечание: Используйте слайды сразу или хранить их в RT с сиккативов на срок до 1 недели. Длительного хранения может привести к деградации РНК.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Подготовка оборудования
	<ol>
<li>Установить печь гибридизации до 40 ° C. Тщательно мокрой увлажнения бумаги и удалите любые остаточные dH2O. Вставьте бумагу в лоток контроля влажности и Вставьте лоток в печь гибридизации prewarm по крайней мере 30 минут перед использованием.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Подготовка реагента
	<ol>
<li>Заполнить два очистки агента блюда с 200 мл ксилол и заполнить два окрашивание блюда с 200 мл 100% EtOH, который будет использоваться для депарафинизации секций.</li>
		<li>Подготовка 200 mL реагента коммерчески доступных 1 x целевой поиск путем добавления 180 мл dH2O 20 мл 10 x цели получения реагента. Место два слайд Держатели в пароварку. Заполнить один слайд держатель с 200 мл 1 x цели получения реагента и заполнить другой слайд держатель с 200 мл dH2O. тепла оба решения до кипения, используя пароварку.</li>
		<li>Подогретую буфера мытья теплой 50 x до 40 ° C на 10 – 20 мин подготовить 3 L 1 x мыть буфера путем разбавления 60 мл 50 x мыть буфер с 2,94 Л dH2O.</li>
		<li>В Зонта Подготовьте 50% Гилл гематоксилином counterstaining решение, добавив гематоксилином Гилл в 100 мл до 100 мл dH2O. В Зонта Подготовьте воронение реагента (0,02% (w/v) аммиачная вода), добавив 1,43 мл гидроксида аммония 28 – 30% в 250 мл dH2O.</li>
		<li>Prewarm целевой зондов при 40 ° C за 10 мин до зонд гибридизации и принести RT. усилительных реагентов (AMP 0-6)</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. РНК в Situ гибридизация Assay
<ol><li>
Депарафинизации и обезвоживания
	<ol>
<li>После выпечки, как описано в шаге 1.1.3.2 (необязательный остановочный пункт 1), deparaffinize разделы в ксилоле на 5 мин с агитации. Deparaffinize снова в свежих ксилол для 5 минут Dehydrate в 100% EtOH на 2 мин с агитация и повторять снова в свежих 100% EtOH на 2 мин.</li>
		<li>Воздух сухой слайды для 5 мин при 60 ° C в циркулирующего воздуха печи или на RT до тех пор, пока они полностью сухой (необязательный остановочный пункт 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Образец взрывоопасностью
	<ol>
<li>Инкубируйте секции с ~ 4 капель перекиси водорода готовых к использованию для 10 мин на RT для утоления активности эндогенной пероксидазы. Декантируют раствор из слайдов и промойте их дважды dH2O.</li>
		<li>Инкубируйте секции с 200 мл реагента целевого поиска для 15 – 30 мин при температуре 100 ° C в пароварку. Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от типа ткани. В этом протоколе целевого поиска была исполнена для 15 мин как образцы опухоли, так и клеток гранулы.</li>
		<li>Декантируют раствор из слайдов, дважды промыть dH2O, окунуть в 100% EtOH 3 мин, и сухой, слайды в 60 ° C в циркулирующего воздуха печи или в РТ, до тех пор, пока полностью сухой.</li>
		<li>Нарисуйте гидрофобный барьер вокруг секции с использованием гидрофобных пера, приблизительно 0,75 х 0,75 дюйма2. Примечание: Не рекомендуется сделать меньше барьер. Для более крупных разделов больше барьер нужно будет извлечь.</li>
		<li>Пусть барьер сухой полностью за 1 мин, или оставить на ночь на RT (необязательный остановочный пункт 3).</li>
		<li>Место слайды в слайд владельца и поместите слайд владельца в лоток контроля влажности. Добавить ~ 4 капли протеазы III для каждого слайда и Инкубируйте 15 – 30 мин при 40 ° C в гибридизации печи для переваривания белка. Примечание: Время инкубации может варьироваться в зависимости от типа ткани. В этом протоколе протеазы пищеварение была исполнена для 30 минут для образцов опухоли и 15 минут для ячейки окатышей.</li>
		<li>Декантируют раствор из слайдов и промойте их дважды dH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Зонд гибридизации
	<ol>
<li>Добавьте ~ 4 капли раствора соответствующие готовых к использованию зонд для покрытия всего раздела. При использовании более крупные разделы, добавить ~ 5-6 капель.</li>
		<li>Гибридизируйте зонды для 2 ч при 40 ° C в печь гибридизации. Декантируют раствор из слайдов и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стиральная в этом шаге.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Усиления сигнала
	<ol>
<li>Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 0 на слайде при 40 ° C в гибридизации духовку на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфера для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стиральная в этом шаге.</li>
		<li>Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 1 каждого слайда при 40 ° C в гибридизации духовку на 15 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.</li>
		<li>Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 2 каждого слайда при 40 ° C в гибридизации духовку на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.</li>
		<li>Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 3 на слайде при 40 ° C в гибридизации духовку на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.</li>
		<li>Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 4 на слайде при 40 ° C в гибридизации духовку на 15 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.</li>
		<li>Инкубировать разделы с ~ 4 капли AMP 5 на слайд в РТ на 30 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.</li>
		<li>Инкубировать разделы с ~ 4 капель AMP 6 каждого слайда на RT на 15 мин Decant решение и мыть слайды в 200 мл 1 x мыть буфер для 2 мин на RT с случайные агитации. Повторите процедуру стирки.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Обнаружение сигнала
	<ol>
<li>Подготовьте быстро красный краситель рабочего раствора. Для одного слайда с 0,75 х 0,75 дюйма2 барьер, добавить 2 мкл краска быстро красно-B 120 мкл быстро красно-A в трубку и хорошо перемешать. Примечание: В зависимости от размера гидрофобный барьер и количество слайдов, будет отличаться томов быстро красный рабочего раствора.</li>
		<li>Декант избыток жидкости от слайды и добавить быстро красный краситель рабочего раствора к слайдам. Инкубируйте слайды для 10 мин на RT в лоток с крышкой, чтобы избежать воздействия света. Примечание: Используйте быстрый красный рабочего раствора в течение 5 мин, подготовки и не подвергать его прямого солнечного света или ультрафиолетового света.</li>
		<li>Сцеживаться быстро Красного раствора и промыть слайды дважды с водопроводной водой. Место слайды обратно в слайд стойку.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Counterstaining
	<ol>
<li>Counterstain разделов ткани с 50% Гилл гематоксилином решение для 2 мин на RT. мыть слайды с водопроводной водой и повторите это несколько раз, пока не ясно, в то время как разделы остаются фиолетовый слайды. Окуните слайды в 0,02% аммиачной воды для воронение (dip 2 – 3 раза). Замените воду аммиака с водопроводной водой и вымыть слайды 3 – 5 раз.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Монтаж на салазках
	<ol>
<li>Сухой слайды в циркулирующего воздуха печи на 60 ° C в течение 15 мин или RT до тех пор, пока полностью сухой. Место 1 – 2 капли реагента монтажа на каждый слайд и место coverslips над каждой секции. Избегайте любой перехват воздушных пузырьков. Воздух сухой слайды для по крайней мере 5 минут. Примечание: Быстро красный субстрат алкоголя чувствительных. Не обезвоживая слайды в спирте.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Визуализация
	<ol>
<li>Наблюдать за слайды под микроскопом стандартного brightfield.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bolha, L., Ravnik-Glava&#269;, M., Glava&#269;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNAs:+Biogenesis,+Function,+and+a+Role+as+Possible+Cancer+Biomarkers.">Circular RNAs: Biogenesis, Function, and a Role as Possible Cancer Biomarkers.</a> International Journal of Genomics. 2017, 6218353 (2017).</li><li>Yamada, A., Yu, P., Lin, W., Okugawa, Y., Boland, C. R., Goel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+RNA-Sequencing+approach+for+the+identification+of+novel+long+non-coding+RNA+biomarkers+in+colorectal+cancer.">A RNA-Sequencing approach for the identification of novel long non-coding RNA biomarkers in colorectal cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 575 (2018).</li><li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution.">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li><li>Mahmood, R., Mason, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-situ+hybridization+of+radioactive+riboprobes+to+RNA+in+tissue+sections.">In-situ hybridization of radioactive riboprobes to RNA in tissue sections.</a> Methods in Molecular Biology. 461, 675-686 (2008).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paraffin processing of tissue. Protocols Online Available from: <a target="_blank" href="https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/">https://www.protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue/</a> (2016)</li><li>An, Z., Aksoy, O., Zheng, T., Fan, Q. W., Weiss, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+receptor+and+EGFRvIII+in+glioblastoma:+signaling+pathways+and+targeted+therapies.">Epidermal growth factor receptor and EGFRvIII in glioblastoma: signaling pathways and targeted therapies.</a> Oncogene. , (2018).</li><li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+MET+via+diverse+exon+14+splicing+alterations+occurs+in+multiple+tumor+types+and+confers+clinical+sensitivity+to+MET+inhibitors.">Activation of MET via diverse exon 14 splicing alterations occurs in multiple tumor types and confers clinical sensitivity to MET inhibitors.</a> Cancer Discovery. 5 (8), 850-859 (2015).</li><li>Awad, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MET+Exon+14+Mutations+in+Non-Small-Cell+Lung+Cancer+Are+Associated+With+Advanced+Age+and+Stage-Dependent+MET+Genomic+Amplification+and+c-Met+Overexpression.">MET Exon 14 Mutations in Non-Small-Cell Lung Cancer Are Associated With Advanced Age and Stage-Dependent MET Genomic Amplification and c-Met Overexpression.</a> Journal of Clinical Oncology. 34 (7), 721-730 (2016).</li><li>Hammond, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=American+Society+of+Clinical+Oncology/College+of+American+Pathologists+guideline+recommendations+for+immunohistochemical+testing+of+estrogen+and+progesterone+receptors+in+breast+cancer.">American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer.</a> Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 134 (6), 907-922 (2010).</li><li>Gan, H. K., Cvrljevic, A. N., Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+variant+III+(EGFRvIII):+where+wild+things+are+altered.">The epidermal growth factor receptor variant III (EGFRvIII): where wild things are altered.</a> Federation of European Biochemical Societies Journal. 280 (21), 5350-5370 (2013).</li><li>Wheeler, S. E., Egloff, A. M., Wang, L., James, C. D., Hammerman, P. S., Grandis, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+EGFRvIII+detection+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Challenges in EGFRvIII detection in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Public Library of Science One. 10 (2), e0117781 (2015).</li><li>Zhu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Junction-specific+and+Quantifiable+In+Situ+Detection+of+AR-V7+and+its+Clinical+Correlates+in+Metastatic+Castration-resistant+Prostate+Cancer.">Novel Junction-specific and Quantifiable In Situ Detection of AR-V7 and its Clinical Correlates in Metastatic Castration-resistant Prostate Cancer.</a> European Urology. , (2017).</li><li>Piwecka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+a+mammalian+circular+RNA+locus+causes+miRNA+deregulation+and+affects+brain+function.">Loss of a mammalian circular RNA locus causes miRNA deregulation and affects brain function.</a> Science. , (2017).</li><li>Rev&#234;chon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rare+progerin-expressing+preadipocytes+and+adipocytes+contribute+to+tissue+depletion+over+time.">Rare progerin-expressing preadipocytes and adipocytes contribute to tissue depletion over time.</a> Scientific Reports. 7 (1), 4405 (2017).</li><li>Fu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+ectopic+neuritogenesis+by+retinal+rod+bipolar+cells+is+regulated+by+miR-125b-5p+during+retinal+remodeling+in+RCS+rats.">Functional ectopic neuritogenesis by retinal rod bipolar cells is regulated by miR-125b-5p during retinal remodeling in RCS rats.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1011 (2017).</li><li>Yates, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subclonal+diversification+of+primary+breast+cancer+revealed+by+multiregion+sequencing.">Subclonal diversification of primary breast cancer revealed by multiregion sequencing.</a> Nature Medicine. 21 (7), 751-759 (2015).</li><li>Baker, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+RNA-based+in+situ+mutation+detection+delineates+colorectal+cancer+subclonal+evolution.">Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution.</a> Nature Communications. 8 (1), 1998 (2017).</li></ol>

Все авторы являются сотрудниками расширенный клеток диагностики, Inc.

В настоящем докладе подробно обсуждались Роман протокол assay иш и ее применения. Assay позволяет для прямого визуализации экзона развязок, короткие цель и высоко гомологичных последовательности и точечные мутации в контексте ткани. Проба основана на технологии RNAscope5 и поэтому способен одной молекулы обнаружения. Однако из-за передовых Усилительная система, сигнал могут быть обнаружены с зондами, содержащие как одна пара двойных Z или целевой шаблон длиной всего 50 нуклеотидов. Потому что зонды могут быть как короткий как один двойной Z в длину, это позволяет для обнаружения экзона развязок, короткие цель и высоко гомологичных последовательности и точечные мутации (Таблица 1).
Для успешного выполнения анализа существует несколько технических рекомендаций. Во-первых тканей должна быть исправлена в свежие 10% буферизацией нейтрального формалина (NBF) при комнатной температуре для 16 – 32 h10. Underfixation (< 16 h) или overfixation (> 32 h) будет ухудшить производительность пробирного и может потребовать дополнительной оптимизации. Во-вторых для обеспечения оптимального контроля температуры и влажности, которые требуются для надежной зонд гибридизации и сигнала Усилители, слайд обработки системы и гибридизации печи должны использоваться для протокола шаги 2.3-5 (протеазы предварительной обработки, зонд Гибридизация, усиления сигнала и сигнала). Третьих, превышение остаточных буферы должны быть должным образом отстой перед каждым шагом на протяжении протокол (но не настолько, что в разделах ткани высохнуть). Если слайды высохнуть, значительные неспецифичный сигнал будет развиваться. В-четвертых в зависимости от типа ткани, может потребоваться предварительная оптимизация. Использование неправильно протеазы или выполнении субоптимальные количество времени может привести к в под - или над - digestion и отрицательно будет влиять на сигнал. И наконец важно всегда запускать положительной и отрицательной контроля с зондами теста. Отрицательный контроль зонды убедитесь, что нет фонового сигнала, и зонды позитивного управления убедитесь, что assay было сделано правильно, и что качество РНК в образце является оптимальным для интерпретации результатов тестов зонд. Если нет сигнала с положительный контроль зонда, то качество РНК в образце, скорее всего неоптимальной и сигнал не может быть видно с пробник.
В дополнение к ручной assay способность выполнить пробу на автоматизированных stainers был также продемонстрировал (рис. 6). Этот автоматизированный assay иш дает высокое соотношение сигнал шум и применима для тех же приложениях, как показано в таблице 1; Однако преимущества автоматизированных assay включают стандартизации анализа условий, минимизации изменчивости между пользователем и практический времени и пособие для высокопроизводительного скрининга образцов ткани надежным способом.
Хотя иммуногистохимия (IHC) и qRT ПЦР позволяет для обнаружения сращивания вариантов (особенно EGFRvIII), в FFPE клинических образцов, эти методы необходимые неконкретны и не предлагаем проницательность в пространственное разрешение сращивания выражение типа Variant, соответственно11,12. Ключевым преимуществом assay в этот протокол является его весьма деликатного и конкретных визуализации сращивания стыков при сохранении контексте морфологических ткани. Здесь способность пробирного точного уникальный экзона развязок для нескольких вариантов соединения, включая EGFRvIII и METΔ14, была продемонстрирована (рисунки 3 и 6). Кроме того было показано assay обнаружить соединитель вариант AR-V7 рака простаты, нескольких изоформ ErbB4 в мозге и подтверждение нокаут круговой Cdr1as РНК в мыши мозга3,,1314.
Короткие последовательности обнаружения, этот assay иш позволяет для визуализации РНК последовательности как 50 нуклеотидов в длину, короче, как свидетельствует обнаружение CDR3 последовательностей, производный от Jurkat клеток (рис. 3). Assay может также обнаружить последовательности гена, которые высоко гомологичных для других членов семьи или видов, как показано на Revêchon и др., которые использовали короткий целевого анализа для выявления человеческого progerin, выраженные в мыши подкожной жировой ткани белых15. Кроме того малые ядрышковые РНК (snoRNA), ТРИФОСФАТЫ опосредованной гена редактирования и прекурсоров микроРНК могут быть обнаружены в situ с короткой целевой assay. Совсем недавно Фу et al. сочетаются этот assay иш IHC определить точные клеток в сетчатке, выражая в pre-miRNA mir125b16.
Мутация, профилирование в опухоли имеет решающее значение для изучения прогрессии опухоли и для разработки целевой терапии. Хотя мутация профилирования может быть достигнуто через высокопроизводительного секвенирования, эта технология не может полностью решить внутриопухолевых ссылку или неоднородность генетические изменения с клеточной морфологии17,18. Определение наличия мутаций точки, используя этот assay иш позволяет различия РНК последовательности с разрешением сингл база, как проверенных путем обнаружения EGFR L858R и КАРСТЕ G12A единичных нуклеотидных изменений в клеточных линиях (рис. 5). Кроме того Baker et al. используется Точечная мутация assay целевой несколько мутации онкогенов BRAF, крас и PIK3CA в18колоректального рака. Они были в состоянии выявлять и пространственно карта редких мутантов subclones опухолевых клеток, в конечном счете показаны, как они способствуют интра опухоль неоднородности.
В целом был разработан специализированный пробирного РНК ISH. Эта методология позволяет для обнаружения сращивания вариантов, коротких последовательностей, и мутации в situ. Это чувствительных, конкретных, поддающихся количественной оценке и адаптируемой производительности как ручной методами, так и на автоматизированных stainers.

Высок объём транскриптомики технологии, такие как microarrays и следующего поколения РНК последовательности (RNAseq) экспоненциально повысили открытия биомаркеров РНК с диагностические, прогностические и прогнозирования клиническое значение для различных заболеваний, в том числе Рак1,2. Чтобы продвинуть использование этих биомаркеров в точности медицины, есть высокая потребность в стандартизированной и надежные технологии, которые можно измерить РНК биомаркеров в контексте клинических образцов ткани. Хотя широко grind и bind анализы как RNAseq и количественного RT-PCR включение высокочувствительный ген выражение измерения, требуемые ткани гомогенизации и РНК изоляции подразумевают потери в естественных условиях специфики камерного типа и Морфологическая информация3. Обычные в situ РНК методологиях обнаружения отсутствие чувствительности и специфичности, необходимые для надежного измерения редких или низкий выражая биомаркеров РНК в контексте ткани4.
Коммерческая в situ гибридизация (ISH) пробирного (например., проба RNAscope) является одной из технологий, которая имеет решить эти проблемы, а также позволяет весьма деликатного и конкретных визуализации одной молекулы РНК, больше чем 300 нуклеотидов в контексте морфологических ткани. Этот тип анализа использует уникальный олигонуклеотида зонд дизайн примерно 6 – 20 двойной Z зонд пар в сочетании с усиления передовые на основе гибридизации сигнала5.
Это исследование описывает специализированных пробирного РНК ISH, BaseScope, в дополнение к ранее конструированного коммерческие технологии, которая может обнаружить РНК последовательности как короче 50 нуклеотидов в единичных нуклеотидных резолюции. Этот assay рассматриваются сложные сложности транскриптом и применима для точного обнаружения экзона развязок, короткие последовательности и точечные мутации в контексте ткани (Таблица 1), с помощью одной двойной Z зонд пары. Этот доклад свидетельствует протокол assay полный и его использование в обнаружении сращивания вариантов, CDR3 последовательности для Т-клеточный рецептор клонов, и единого нуклеотидом мутации в FFPE клеточной линии и опухолевых тканей.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1692">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310010 or 310013 (HybEZ&#8482;), 321710 or 321720 (HybEZ&#8482; II)</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidity Control Tray (with lid)</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">HybEZ Humidifying Paper</td>
			<td style="width:255px;">ACD</td>
			<td style="width:172px;">310015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Vector Laboratory&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">SuperFrost Plus Slides (required)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">10% neutral-buffered formalin (NBF)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paraffin wax</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microtome</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">Gill&#8217;s Hematoxylin I&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">&#160;HXGHE1LT</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Xylene&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">X3P-1GAL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWSRA24</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Staining Dishes&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4457EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">LWT4456EA</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:695px;">100% alcohol (EtOH)&#160;</td>
			<td style="width:255px;">American Master Tech Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">ALREACS</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">VectaMount Permanent Mounting Medium (required)</td>
			<td style="width:255px;">Vector Labs&#160;</td>
			<td style="width:172px;">H-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Cover Glass, 24 x 50 mm</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS&#160;</td>
			<td style="width:172px;">12-545-F</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Ammonium hydroxide, 28&#8211;30%</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich/MLS</td>
			<td style="width:172px;">320145-500mL</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Carboy (&#62;3L)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:695px;">Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer</td>
			<td style="width:255px;">/</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Digital thermometer</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Pipettors and tips, 1&#8211;1000 &#956;L</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Distilled water</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Tubes (various sizes)</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Fume hood</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Graduated cylinder</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Parafilm</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Paper towel or absorbent paper</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Microscope and accessories</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/&#8211; 1&#176;C</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Formaldehyde</td>
			<td style="width:255px;">MLS</td>
			<td style="width:172px;">/</td>
			<td>MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">Histogel</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific/MLS</td>
			<td style="width:172px;">22-110-678</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Reagent Kit - RED</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E2</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E1E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E7E8</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-EGFR-E8E9</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701731</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E14E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701811</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Hs-MET-E13E15</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">701801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12A</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858R</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BaseScope Hs-EGFR-L858WT</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td>705461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:695px;">BaseScope Control Probe Pack Human</td>
			<td style="width:255px;">Advanced Cell Diagnostics</td>
			<td style="width:172px;">322975</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context with an rna in situ hybridization assay

Поскольку точность медицина сильно зависит от точного обнаружения биомаркеров, существует растущая потребность стандартизированных и надежные технологии, которые измеряют РНК биомаркеров в situ в клинических образцах. В то время как grind и bind анализов, как RNAseq и количественного RT-PCR включение высокочувствительный ген выражение измерения, они также требуют РНК добыча и тем самым предотвратить ценные выражение анализа в контексте морфологических ткани. В situ гибридизация (ISH) пробирного описанных здесь можно обнаружить РНК последовательности как короче 50 нуклеотидов в резолюции единого нуклеотидом и на уровне одной ячейки. Этот assay дополняет ранее разработанной коммерческих пробирного и позволяет чувствительной и конкретных на месте обнаружения сращивания варианты, короткие цели и точечные мутации в ткани. В этом протоколе зонды были разработаны для целевых уникальных экзона развязок для двух вариантов клинически важные соединения, EGFRvIII и METΔ14. Обнаружение короткие последовательности была продемонстрирована конкретного обнаружения последовательностей CDR3 Т-клеточных рецепторов α и β в строке Jurkat Т-клеток. Также показана полезность этот assay ISH для различения РНК последовательности в резолюции (точечные мутации) единого нуклеотидом через визуализацию EGFR L858R и КАРСТЕ G12A единого нуклеотидом вариации в клеточных линий, с помощью автоматизированных пятнать платформы. Таким образом протокол показывает специализированных РНК ISH assay, который позволяет обнаружение сращивания вариантов, коротких последовательностей, и мутации в situ для ручной работы и на автоматизированных stainers.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay at JoVE.com

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Здесь мы описываем в situ гибридизация assay который позволяет чувствительной и конкретных обнаружения последовательностей как короче 50 нуклеотидов с единого нуклеотидом резолюции на уровне одной ячейки. Анализа, который может выполняться автоматически или вручную, можно включить визуализация сращивания варианты, коротких последовательностей и мутации в контексте ткани.

Визуализация генетических вариантов, короткие цели и точечные мутации в контексте морфологических ткани с РНК в Situ гибридизация Assay

Because precision medicine is highly dependent on the accurate detection of biomarkers, there is an increasing need for standardized and robust ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay

Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Assay for Neural Induction in the Chick Embryo

Анализ для нейронных Индукция в куриных эмбрионах

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Visualizing RNA Localization in Xenopus Oocytes

Визуализация РНК Локализация в Xenopus Ооцитов

RNA localization is a conserved mechanism of establishing cell polarity.  Vg1 mRNA localizes to the vegetal pole of Xenopus laevis oocytes and acts to ...

Mutagenesis and Analysis of Genetic Mutations in the GC-rich KISS1 Receptor Sequence Identified in Humans with Reproductive Disorders

Мутагенеза и анализа генетических мутаций в GC-богатых KISS1 рецепторов Последовательность Выявленные у людей с репродуктивным расстройствам

The kisspeptin receptor (KISS1R) is a G protein-coupled receptor recognized as the trigger of puberty and a regulator of reproductive competence in ...

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Radioactive in situ Hybridization for Detecting Diverse Gene Expression Patterns in Tissue

Радиоактивный На месте Гибридизации для обнаружения разнообразных шаблонов экспрессии генов в ткани

Knowing the timing, level, cellular localization, and cell type that a gene is expressed in contributes to our understanding of the function of the gene. ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

Обнаружение вирусной РНК с помощью флуоресцентного<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация (FISH)

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Анализ одноклеточных транскрипции гена РНК-флуоресцентный<em&gt; В Situ</em&gt; Гибридизация (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Хромосома Репликация времени в сочетании с Флуоресцентные<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Всего горы РНК Флуоресцентные<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

RNA In situ Hybridization in Whole Mount Embryos and Cell Histology Adapted for Marine Elasmobranchs

РНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизации эмбрионов Всего в гору и сотовых гистологии адаптированный для морских хрящевых рыб

Marine  elasmobranchs are valued animal models for biomedical and genomic studies as  they are the most primitive vertebrates to have adaptive immunity ...