Name: sensitive measurement of mitophagy by flow cytometry using the ph-dependent fluorescent reporter mt-keima
Uploaded: 2018-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Research Foundation av Korea (2016R1D1A1B03931949) (å J. U.), og av National Research foundation av Korea (NRF) stipend finansiert av Korea-government(MSIT) (nr. 2016R1A2B2008887, nr. 2016R1A5A2007009) (til J.Y .)

1. generasjon HeLa celler uttrykke mito-Keima (mt-Keima)
<ol><li>
Utarbeidelse av mt-Keima lentivirus
	<ol>
<li>Coat en 100 mm kultur parabol ved å legge til 2 mL 0,001% poly-L-lysin/fosfat-bufret saltoppløsning (PBS) og la den stå i 5 minutter ved romtemperatur.</li>
		<li>Fjerne poly-L-lysine løsning ved hjelp av en glass pipette koblet til et vakuum og vask kultur parabol ved å legge til 2 mL 1 x PBS.</li>
		<li>Plate 1,5 x 106 HEK293T på bestrøket kultur parabol med 10 mL av DMEM ...

<ol>
	<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+More+than+just+a+powerhouse.">Mitochondria: More than just a powerhouse.</a> Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).</li><li>Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+revisited.+Alternative+functions+of+mitochondria.+Bioscience+Reports.">Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports.</a> Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).</li><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+control+of+cellular+life,+stress,+and+death.">Mitochondrial control of cellular life, stress, and death.</a> Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).</li><li>Kang, D., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mitochondrial+DNA+in+common+diseases+and+disease+states:+aging,+neurodegeneration,+heart+failure,+diabetes,+and+cancer.">Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer.</a> Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).</li><li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+basis+of+aging.">The mitochondrial basis of aging.</a> Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li><li>Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biology,+degenerative+diseases+and+aging.">Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging.</a> BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).</li><li>Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitohormesis.">Mitohormesis.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin.">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin.">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+the+banquet:+Mitochondrial+biogenesis,+mitophagy,+and+cell+survival.">After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival.</a> Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).</li><li>Um, J. H., Yun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+mitophagy+in+human+diseases+and+physiology.">Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology.</a> BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).</li><li>Al Rawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfertilization+autophagy+of+sperm+organelles+prevents+paternal+mitochondrial+DNA+transmission.">Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission.</a> Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).</li><li>Kim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SESN2/sestrin2+suppresses+sepsis+by+inducing+mitophagy+and+inhibiting+NLRP3+activation+in+macrophages.">SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages.</a> Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).</li><li>Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+A+balance+regulator+of+NLRP3+inflammasome+activation.">Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation.</a> BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).</li><li>Sandoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+Nix+in+autophagic+maturation+of+erythroid+cells.">Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells.</a> Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).</li><li>Sato, M., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+paternal+mitochondria+by+fertilization-triggered+autophagy+in+C.+elegans+embryos.">Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos.</a> Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).</li><li>Geisler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1/Parkin-mediated+mitophagy+is+dependent+on+VDAC1+and+p62/SQSTM1.">PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy.">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li><li>Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Kubli, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+Is+dispensable+for+mitochondrial+recruitment+of+Parkin+and+activation+of+mitophagy+in+cardiac+myocytes.">PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes.</a> PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).</li><li>Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+techniques+to+measure+mitophagy+using+fluorescence+microscopy.">Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy.</a> Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery.">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li><li>Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+links+between+sirtuins+and+autophagy.">The emerging links between sirtuins and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+vivo+Mitophagy.">Measuring In vivo Mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>Denison, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+common+fragile+site+gene+Parkin+in+ovarian+and+other+cancers.">Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers.</a> Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).</li><li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Basic+principles+and+applications.">Flow cytometry: Basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li><li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy.">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).</li><li>Burbulla, L. F., Kruger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+primary+human+fibroblasts+for+monitoring+mitochondrial+phenotypes+in+the+field+of+Parkinson's+disease.">The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).</li><li>Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+video+microscopy+for+assessment+of+EYFP-Parkin+aggregation+as+a+marker+for+cellular+mitophagy.">Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy.</a> Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).</li><li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+detection+of+mitophagy+in+human+cells,+C.+Elegans,+and+mice.">In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).</li></ol>

Her presenterer vi en raskere og følsom metode for å bruke flowcytometri til å måle mobilnettet mitophagy aktivitet i celler som uttrykker mt-Keima. Cellene gjennomgår høy mitophagy viser en økt andelen PE-CF594 (561 nm) / BV605 (405 nm) eksitasjon. Dermed kan mitophagy aktivitet uttrykkes som en prosentandel av celler viser høy 561/405 forholdet. Vi beregnet prosentandelen av celler i regionen "høy" porten på dot tomten av PE-CF594 (561 nm) kontra BV605 (405 nm), og resultatene viste at behandling med CCCP ind...

Mitokondrier er organelles som er viktig for celle spredning og fysiologi. Mitokondrier er ansvarlig for å generere mer enn 80% av ATP forsyning via oxidative fosforylering, og de tilbyr også ulike metabolske mellomprodukter for biosyntesen og metabolisme1,2. I tillegg til sine roller i energiforsyning og metabolisme spille mitokondrier sentrale roller i mange andre viktige prosesser, inkludert reaktive oksygen arter (ROS) generasjon, regulering av celledød og intracellulær Ca2 + dynamics3 . Endringer i mitokondrie funksjonen har vært forbundet med menneskelige sykdommer, inkludert kreft, diabetes mellitus og forskjellige nevrodegenerative sykdommer4,5. Økt mitokondrie dysfunksjon og Mitokondrielt DNA mutasjoner er også tenkt å bidra til normal aldring prosesser6,7,8. Kvalitetskontroll er derfor et viktig spørsmål i mitokondrier. Mitokondrier er svært dynamisk organelles som kan kontinuerlig endrer form mellom langstrakt nettverk og kort, fragmenterte form. Mitokondrier dynamics spiller en viktig rolle i å opprettholde funksjonen av mitokondrier samt deres fornedrelse til mitophagy9.
Mitophagy er en mekanisme som involverer selektiv nedbrytning av hele mitokondrier bruker autophagy maskiner. Mitophagy er prinsippet mekanisme underliggende mitokondrie omsetningen og fjerning av skadet eller dysfunksjonelle mitokondriene. I denne prosessen omgitt mitokondrier først av en membran, som resulterer i dannelsen av autophagosomes, som så smelter med lysosomer for hydrolytisk fornedrelse9. Tidligere genetiske studier i Drosophila har antydet at to Parkinsons sykdom-relaterte gener, PTEN-indusert antatte kinase 1 (PINK1) (PARK6) og Parkin (PARK2), i samme veien10,11. Rekkefølge studier har vist at PINK1-Parkin veien er ansvarlig for å fjerne skadet mitokondrier og mangler i denne veien resultatet i dysfunksjonelle mitophagy og kan bidra til menneskelige sykdommer12,13. Feil i mitophagy prosesser har nylig blitt funnet i ulike menneskelige sykdommer, inkludert kreft, hjertesykdommer, leversykdommer og nevrodegenerative sykdommer 14. I tillegg har studier også vist at mitophagy er kritisk til mange fysiologiske prosesser, for eksempel differensiering og utvikling av immunrespons15,16,17,18 ,19, antyder at mitophagy kan spille en mer aktiv rolle i å kontrollere celle funksjoner.
Til tross for siste bekreftelse at mitophagy spiller en viktig rolle i begge kvalitetskontroll i mitokondrier og menneskelig sykdom, molekylære mekanismer underliggende mitophagy fortsatt dårlig forstått. Selv om mitophagy-relaterte mekanismer har studert systematisk i gjær, fokusert studier for å utforske mitophagy-relaterte mekanismer i pattedyrceller hovedsakelig på PINK1-Parkin veien. Tidligere undersøkelser har vist at PINK1-Parkin veien er primært ansvarlig for selektiv fjerning av skadet mitokondrier via mitophagy12,20,21. Men har studier rapportert at i enkelte modeller kan mitophagy aktiveres selv i fravær av funksjonelle PINK122,23,24. Disse resultatene tyder på at i tillegg til PINK1-Parkin veien, der en ekstra uidentifisert veien som kan aktivere mitophagy.
Fraværet av en praktisk metode for å vurdere mitophagy aktivitet er en stor utfordring for å utforske veiene som regulerer mitophagy og dens rolle i patofysiologiske hendelser. Elektronmikroskop er et kraftig verktøy for å visualisere direkte autophagosome-omsluttet mitokondrier. Men har elektronmikroskop begrensninger i kvantifisere mitophagy aktivitet. Selv om strategier som bruker microtubule-assosiert protein-1 lys kjeden 3 (LC3)-konjugert fluorescerende sonder, for eksempel GFP-LC3, er de mest brukte tilnærminger25, forbigående natur LC3-baserte signalet og sin høyt antall falske positive signaler begrense sin følsomhet for å oppdage mitophagy i cellene26. En kombinasjon av vestlige blotting for å måle mitokondrie protein nivå, kvantifisering av Mitokondrielt DNA og fluorescens mikroskopi analyse colocalize mitokondrier autophagosomes eller lysosomer ville være en god tilnærming for å vurdere mitophagy. Imidlertid ringe kvantifisering begrensninger og mangel på bekvemmeligheten av eksisterende metoder for nye tilnærminger. Innføringen av en ny pH-avhengig fluorescerende protein, mitokondrie målet Keima (mt-Keima), forbedret evne til å oppdage mitophagy27. Kombinerer mitokondrie målretting sekvensen av cytochrome c oksidase delenhet VIII (COX VIII) i Keima, er mt-Keima rettet mot mitokondrie matrix. Stort skifte i eksitasjon toppen av Keima fra 440 nm 586 nm (tilsvarende pH 7 og pH 4, henholdsvis) kan brukes til å vurdere mitophagy med gode varsomt i både i vitro og vivo eksperimenter28,29 . Enda viktigere, forårsaker motstanden av mt-Keima til lysosomale fornedrelse integrering av mt-Keima signalet i lysosomer, muliggjør enkel kvantitativ måling av mitophagy aktivitet. Fluorescens endringen som oppstår i mt-Keima kan analyseres ved hjelp av enten AC confocal mikroskopi eller flow cytometri28,29. Men er en flyt cytometri-basert metode for å måle mitophagy aktivitet ved hjelp av mt-Keima ikke angitt i detalj ennå.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for en flyt cytometri-basert metode for å måle mitophagy aktivitet i celler ved hjelp av mt-Keima. Selv om vi har vist her at flyt cytometri analyse ble oppdaget CCCP-indusert mitophagy i HeLa celler uttrykke Parkin, kan denne teknikken brukes til en rekke celletyper.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">poly-L-lysine</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:133px;">wellgene</td>
			<td style="width:119px;">LS202-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:133px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30013.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293T</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPTI-MEM&#160;</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbofect</td>
			<td style="width:133px;">Thermos scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.45 &#956;m syringe filter</td>
			<td style="width:133px;">sartorius</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polybrene</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9268</td>
			<td>8 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">puromycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8833</td>
			<td>2 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:133px;">wellgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EQUIPMENTS</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:133px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSDIVA</td>
			<td style="width:133px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">FACSDIVA (v8.0.1)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive measurement of mitophagy by flow cytometry using the ph-dependent fluorescent reporter mt-keima

Mitophagy er en prosess av selektive fjerning av skadet eller unødvendige mitokondrier bruker autophagy maskiner. Nære bånd er funnet mellom defekt mitophagy og ulike menneskelige sykdommer, inkludert nevrodegenerative sykdommer, kreft og metabolske sykdommer. I tillegg har studier vist at mitophagy er involvert i normal cellulære prosesser, som differensiering og utvikling. Men krever nøyaktig rolle og molekylære mekanismer underliggende mitophagy videre studier. Derfor er det avgjørende å utvikle en robust og praktisk metode for å måle endringer i mitophagy aktivitet. Her beskriver vi en detaljert protokoll for kvantitativt vurdere mitophagy aktivitet gjennom flowcytometri bruker mitokondrier målrettede fluorescerende protein Keima (mt-Keima). Denne flyten cytometri analysen kan analysere mitophagy aktivitet mer raskt og følsomt enn konvensjonelle mikroskopi - eller immunoblotting-baserte metoder. Denne protokollen kan brukes for å analysere mitophagy aktivitet i ulike celletyper.

Et eksempel på flyt cytometri analyse av CCCP-indusert mitophagy i jakten-Parkin celler vises i Figur 4. Bruke flyt cytometri analyse metoden beskrevet ovenfor, kan vi oppdage en dramatisk økning i mitophagic celler i "høy" porten. Prosentandelen av celler i "høy" porten ble økt mer enn 10-fold sammenlignet med ubehandlet kontroll celler (figur 4A). Denne økningen i mitophagy aktivitet var helt avskaffet av co behandling me...

Watch this Scientific Journal Video about Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima at JoVE.com

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy, selektiv nedbrytning av mitokondriene, har vært innblandet i mitokondrie homeostase og er deregulert i ulike menneskelige sykdommer. Men er praktisk eksperimentelle metoder for måling av mitophagy aktivitet svært begrenset. Her gir vi en følsom analysen for å måle mitophagy aktivitet ved hjelp av flowcytometri.

Følsom måling av Mitophagy av Flow cytometri ved hjelp av pH-avhengig fluorescerende Reporter mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Immunodeteksjonsprosedyren av yttermembran Proteiner med flowcytometri av Isolated Mitokondrier

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Teknikker for analyse av Ekstracellulær Blemmer ved hjelp av flowcytometri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Måle Endoreduplication av flowcytometri av isolerte Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Høy gjennomstrømming-måling av Dictyostelium discoideum Macropinocytosis av Flow cytometri

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...