Name: sensitive measurement of mitophagy by flow cytometry using the ph-dependent fluorescent reporter mt-keima
Uploaded: 2018-08-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima at JoVE.com

Эта работа была поддержана грант от Национальный исследовательский фонд Кореи (2016R1D1A1B03931949) (на ю. д.) и Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF) Грант, финансируемого Кореи government(MSIT) (№ 2016R1A2B2008887, № 2016R1A5A2007009) (для J.Y .)

1. поколение клеток HeLa, выражая mito-Keima (mt-Keima)
<ol><li>
Подготовка человека mt-Keima
	<ol>
<li>Слой 100-мм культуры блюдо, добавив 2 мл 0,001% поли L-лизин/фосфат амортизированное saline (PBS) и дайте ему постоять 5 мин при комнатной температуре.</li>
		<li>Удаление поли L-лизин решения с помощью стеклянной пи?...

<ol>
	<li>McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+More+than+just+a+powerhouse.">Mitochondria: More than just a powerhouse.</a> Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).</li><li>Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+revisited.+Alternative+functions+of+mitochondria.+Bioscience+Reports.">Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports.</a> Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).</li><li>Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+in+human+disease.">Mitochondrial DNA mutations in human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (5), 389-402 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Kepp, O., Trojel-Hansen, C., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+control+of+cellular+life,+stress,+and+death.">Mitochondrial control of cellular life, stress, and death.</a> Circulation Research. 111 (9), 1198-1207 (2012).</li><li>Kang, D., Hamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+of+mitochondrial+DNA+in+common+diseases+and+disease+states:+aging,+neurodegeneration,+heart+failure,+diabetes,+and+cancer.">Alterations of mitochondrial DNA in common diseases and disease states: aging, neurodegeneration, heart failure, diabetes, and cancer.</a> Current Medicinal Chemistry. 12 (4), 429-441 (2005).</li><li>Sun, N., Youle, R. J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+basis+of+aging.">The mitochondrial basis of aging.</a> Molecular Cell. 61 (5), 654-666 (2016).</li><li>Wallace, D. C., Brown, M. D., Melov, S., Graham, B., Lott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+biology,+degenerative+diseases+and+aging.">Mitochondrial biology, degenerative diseases and aging.</a> BioFactors. 7 (3), 187-190 (1998).</li><li>Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitohormesis.">Mitohormesis.</a> Cell Metabolism. 19 (5), 757-766 (2014).</li><li>Ashrafi, G., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathways+of+mitophagy+for+quality+control+and+clearance+of+mitochondria.">The pathways of mitophagy for quality control and clearance of mitochondria.</a> Cell Death and Differentiation. 20 (1), 31-42 (2013).</li><li>Clark, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+pink1+is+required+for+mitochondrial+function+and+interacts+genetically+with+parkin.">Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1162-1166 (2006).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+Drosophila+PINK1+mutants+is+complemented+by+parkin.">Mitochondrial dysfunction in Drosophila PINK1 mutants is complemented by parkin.</a> Nature. 441 (7097), 1157-1161 (2006).</li><li>Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkin+is+recruited+selectively+to+impaired+mitochondria+and+promotes+their+autophagy.">Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 183 (5), 795-803 (2008).</li><li>Zhu, J., Wang, K. Z., Chu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After+the+banquet:+Mitochondrial+biogenesis,+mitophagy,+and+cell+survival.">After the banquet: Mitochondrial biogenesis, mitophagy, and cell survival.</a> Autophagy. 9 (11), 1663-1676 (2013).</li><li>Um, J. H., Yun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+mitophagy+in+human+diseases+and+physiology.">Emerging role of mitophagy in human diseases and physiology.</a> BMB Reports. 50 (6), 299-307 (2017).</li><li>Al Rawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postfertilization+autophagy+of+sperm+organelles+prevents+paternal+mitochondrial+DNA+transmission.">Postfertilization autophagy of sperm organelles prevents paternal mitochondrial DNA transmission.</a> Science. 334 (6059), 1144-1147 (2011).</li><li>Kim, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SESN2/sestrin2+suppresses+sepsis+by+inducing+mitophagy+and+inhibiting+NLRP3+activation+in+macrophages.">SESN2/sestrin2 suppresses sepsis by inducing mitophagy and inhibiting NLRP3 activation in macrophages.</a> Autophagy. 12 (8), 1272-1291 (2016).</li><li>Kim, M. J., Yoon, J. H., Ryu, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitophagy:+A+balance+regulator+of+NLRP3+inflammasome+activation.">Mitophagy: A balance regulator of NLRP3 inflammasome activation.</a> BMB Reports. 49 (10), 529-535 (2016).</li><li>Sandoval, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+for+Nix+in+autophagic+maturation+of+erythroid+cells.">Essential role for Nix in autophagic maturation of erythroid cells.</a> Nature. 454 (7201), 232-235 (2008).</li><li>Sato, M., Sato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Degradation+of+paternal+mitochondria+by+fertilization-triggered+autophagy+in+C.+elegans+embryos.">Degradation of paternal mitochondria by fertilization-triggered autophagy in C. elegans embryos.</a> Science. 334 (6059), 1141-1144 (2011).</li><li>Geisler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1/Parkin-mediated+mitophagy+is+dependent+on+VDAC1+and+p62/SQSTM1.">PINK1/Parkin-mediated mitophagy is dependent on VDAC1 and p62/SQSTM1.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 119-131 (2010).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy.">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li><li>Allen, G. F., Toth, R., James, J., Ganley, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+iron+triggers+PINK1/Parkin-independent+mitophagy.">Loss of iron triggers PINK1/Parkin-independent mitophagy.</a> EMBO Reports. 14 (12), 1127-1135 (2013).</li><li>Chu, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+externalization+to+the+outer+mitochondrial+membrane+acts+as+an+elimination+signal+for+mitophagy+in+neuronal+cells.">Cardiolipin externalization to the outer mitochondrial membrane acts as an elimination signal for mitophagy in neuronal cells.</a> Nature Cell Biology. 15 (10), 1197-1205 (2013).</li><li>Kubli, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+Is+dispensable+for+mitochondrial+recruitment+of+Parkin+and+activation+of+mitophagy+in+cardiac+myocytes.">PINK1 Is dispensable for mitochondrial recruitment of Parkin and activation of mitophagy in cardiac myocytes.</a> PloS One. 10 (6), e0130707 (2015).</li><li>Dolman, N. J., Chambers, K. M., Mandavilli, B., Batchelor, R. H., Janes, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tools+and+techniques+to+measure+mitophagy+using+fluorescence+microscopy.">Tools and techniques to measure mitophagy using fluorescence microscopy.</a> Autophagy. 9 (11), 1653-1662 (2013).</li><li>Kuma, A., Matsui, M., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3,+an+autophagosome+marker,+can+be+incorporated+into+protein+aggregates+independent+of+autophagy:+caution+in+the+interpretation+of+LC3+localization.">LC3, an autophagosome marker, can be incorporated into protein aggregates independent of autophagy: caution in the interpretation of LC3 localization.</a> Autophagy. 3 (4), 323-328 (2007).</li><li>Katayama, H., Kogure, T., Mizushima, N., Yoshimori, T., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+quantitative+technique+for+detecting+autophagic+events+based+on+lysosomal+delivery.">A sensitive and quantitative technique for detecting autophagic events based on lysosomal delivery.</a> Chemistry &amp; Biology. 18 (8), 1042-1052 (2011).</li><li>Lee, I. H., Yun, J., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+links+between+sirtuins+and+autophagy.">The emerging links between sirtuins and autophagy.</a> Methods in Molecular Biology. 1077, 259-271 (2013).</li><li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+In+vivo+Mitophagy.">Measuring In vivo Mitophagy.</a> Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).</li><li>Denison, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+the+common+fragile+site+gene+Parkin+in+ovarian+and+other+cancers.">Alterations in the common fragile site gene Parkin in ovarian and other cancers.</a> Oncogene. 22 (51), 8370-8378 (2003).</li><li>Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry:+Basic+principles+and+applications.">Flow cytometry: Basic principles and applications.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).</li><li>Bingol, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+deubiquitinase+USP30+opposes+parkin-mediated+mitophagy.">The mitochondrial deubiquitinase USP30 opposes parkin-mediated mitophagy.</a> Nature. 510 (7505), 370-375 (2014).</li><li>Burbulla, L. F., Kruger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+primary+human+fibroblasts+for+monitoring+mitochondrial+phenotypes+in+the+field+of+Parkinson's+disease.">The use of primary human fibroblasts for monitoring mitochondrial phenotypes in the field of Parkinson's disease.</a> Journal of Visualized Experiments. 68, e4228 (2012).</li><li>Di Sante, G., Casimiro, M. C., Pestell, T. G., Pestell, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+video+microscopy+for+assessment+of+EYFP-Parkin+aggregation+as+a+marker+for+cellular+mitophagy.">Time-lapse video microscopy for assessment of EYFP-Parkin aggregation as a marker for cellular mitophagy.</a> Journal of Visualized Experiments. 111, e53657 (2016).</li><li>Fang, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+detection+of+mitophagy+in+human+cells,+C.+Elegans,+and+mice.">In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. Elegans, and mice.</a> Journal of Visualized Experiments. 129, e56301 (2017).</li></ol>

Здесь мы представляем быстрый и чувствительных метод использования проточной цитометрии для измерения активности клеточных mitophagy в клетках, выражая МТ Keima. Клетки, переживает высокий уровень mitophagy демонстрируют увеличение соотношения между объемом PE-CF594 (561 Нм) / BV605 (405 нм) возбуждения. Т?...

Митохондрии являются органеллы, которые необходимы для пролиферации клеток и физиологии. Митохондрии отвечают за создание более чем 80% поставок СПС через окислительное фосфорилирование, и они также предоставляют различные метаболические интермедиатов для биосинтеза и метаболизм1,2. Помимо их роли в энергоснабжении и метаболизм митохондрии играют центральную роль во многих других важных процессах, включая реактивнооксигенных видов (ров) поколения, регулирование клеточной смерти и внутриклеточных Ca2 + динамики3 . Изменения в митохондриальной функции были связаны с человека болезней, включая рак, сахарный диабет и различных нейродегенеративных заболеваний4,5. Увеличение митохондриальной дисфункции и митохондриальных мутаций ДНК также думал вносить нормального старения процессов6,,78. Таким образом контроль качества является ключевым вопросом в митохондриях. Митохондрии являются высокодинамичные органеллы, которые непрерывно можно изменить их форму между удлиненным сетей и короткие, раздробленной формой. Митохондрии динамики играет важную роль в поддержании функции митохондрий, а также их деградации через mitophagy9.
Mitophagy — это механизм, который включает селективного деградации всего митохондрий, с использованием механизма autophagy. Mitophagy является принцип механизма основной митохондриальную оборот и удаление поврежденных или неблагополучных митохондрий. В этом процессе митохондрии окружены сначала мембраны, что приводит к формированию autophagosomes, которые затем сливаются с лизосомы гидролитическая деградации9. Предыдущих генетические исследования в дрозофилы предложили что два генов, связанных с болезнью Паркинсона, PTEN-индуцированной предполагаемого киназы 1 (PINK1) (PARK6) и Паркин (PARK2), функционировать в том же пути10,11. Самой длинной общей подпоследовательности исследования показали, что путь PINK1-Паркин отвечает за устранение повреждения митохондрий и дефектов в результате этот путь в неблагополучных mitophagy и может способствовать болезни человека12,13. Дефекты в mitophagy процессах были недавно найдены в различных человеческих заболеваний, включая рак, болезни сердца, заболевания печени и нейродегенеративные болезни 14. Кроме того недавние исследования также показали, что mitophagy имеет решающее значение для многих физиологических процессов, например дифференциация, развития и иммунный ответ15,16,17,18 ,19, предполагая, что mitophagy могут играть более активную роль в управлении функции клеток.
Несмотря на недавнее подтверждение, что mitophagy играет важную роль в обоих качества управления в митохондриях и болезней человека, лежащие в основе mitophagy молекулярные механизмы остаются плохо понимают. Хотя механизмы, связанные с mitophagy систематически исследованы в дрожжи, исследования, направленные на изучение механизмов, связанных с mitophagy, в клетках млекопитающих главным образом на PINK1-Паркин путь. Предыдущие исследования установили, что путь PINK1-Паркин отвечает главным образом за селективное удаление поврежденных митохондрий через mitophagy12,,2021. Однако недавние исследования сообщили, что в некоторых моделях, mitophagy может быть активирован даже в отсутствие функциональных PINK122,,23-24. Эти результаты показывают, что в дополнение к PINK1-Паркин путь, там еще неопознанных путь, который может активировать mitophagy.
Отсутствие удобного метода для оценки деятельности mitophagy является серьезным препятствием для изучения путей, которые регулируют mitophagy и его роль в патофизиологической событий. Электронная микроскопия является мощным инструментом непосредственно визуализировать охватил autophagosome митохондрий. Однако электронная микроскопия имеет ограничения в количественном определении mitophagy активность. Хотя стратегии, которые используют связанные микротрубочек белка-1 легкая цепь 3 (LC3)-конъюгированных флуоресцентных зондов, например GFP-LC3, в настоящее время наиболее широко используемых подходов25, преходящий характер на основе LC3 сигнала и его высокий уровень ложно положительных сигналов ограничивают его чувствительность обнаружения mitophagy в клетки26. Сочетание Западный blotting для измерения уровня митохондриальных белок, количественная оценка митохондриальной ДНК и анализ микроскопии флуоресцирования colocalize митохондрий с autophagosomes или лизосомы будет хорошим подходом для оценки mitophagy. Однако количественная оценка ограничений и отсутствия удобства существующих методологий требуют новых подходов. Введение новой рН зависимых флуоресцентный белок, митохондриальных целевой Keima (mt-Keima), значительно улучшить способность обнаруживать mitophagy27. Смешав последовательности митохондриальной ориентации цитохрома с-оксидазы субъединицы VIII (Кокс VIII) в Keima, mt-Keima направлена на митохондриальной матрицы. Большой сдвиг в пик возбуждения Keima от 440 Нм до 586 Нм (соответствует рН 7 и pH 4, соответственно) могут быть использованы для оценки mitophagy с хорошим чутко в как in vitro и in vivo эксперименты28,29 . Что еще более важно сопротивление МТ Keima лизосомальных деградации вызывает интеграции МТ Keima сигнала в лизосомы, позволяя легко количественного измерения активности mitophagy. Флуоресценции изменение, которое происходит в МТ Keima могут быть проанализированы с использованием либо конфокальная микроскопия поток или цитометрии28,29. Однако на основе цитометрии метод потока для определения mitophagy активности с использованием МТ Keima не обеспечивается в деталях на сегодняшний день.
Здесь мы описываем подробный протокол для потока на основе цитометрии техники для измерения mitophagy активность в клетках, использование МТ Keima. Хотя мы показали здесь, что cytometry анализ потока успешно обнаружен CCCP-индуцированной mitophagy в клетки HeLa, выражая Паркин, этот метод может быть применен к широкий спектр типов клеток.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:635px;" width="635">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">poly-L-lysine</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P2636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:133px;">wellgene</td>
			<td style="width:119px;">LS202-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:133px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SH30013.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEK293T</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CRL-3216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">12800-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OPTI-MEM&#160;</td>
			<td style="width:133px;">GIBCO</td>
			<td style="width:119px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Turbofect</td>
			<td style="width:133px;">Thermos scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.45 &#956;m syringe filter</td>
			<td style="width:133px;">sartorius</td>
			<td align="right" style="width:119px;">16555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HeLa</td>
			<td style="width:133px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">polybrene</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9268</td>
			<td>8 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">puromycin</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P8833</td>
			<td>2 mg/ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazine (CCCP)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C2759</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:133px;">wellgene</td>
			<td style="width:119px;">LS015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EQUIPMENTS</td>
			<td style="width:133px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">BD LSRFortessa</td>
			<td style="width:133px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">LSRFortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSDIVA</td>
			<td style="width:133px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">FACSDIVA (v8.0.1)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sensitive measurement of mitophagy by flow cytometry using the ph-dependent fluorescent reporter mt-keima

Mitophagy представляет собой процесс селективного удаления поврежденных или ненужные митохондрий, с использованием машин autophagy. Тесные связи были найдены между дефектных mitophagy и различных заболеваний человека, включая нейродегенеративные заболевания, рак и болезни обмена веществ. Кроме того недавние исследования показали, что mitophagy участвует в нормальных клеточных процессах, например дифференциация и развития. Однако конкретная роль и лежащих в основе mitophagy молекулярные механизмы требуют дальнейшего изучения. Таким образом крайне важно разработать надежный и удобный способ для измерения изменений в mitophagy деятельности. Здесь мы описываем подробный протокол для количественной оценки mitophagy деятельность через проточной цитометрии, с помощью ориентированных на митохондрии флуоресцентный белок Keima (mt-Keima). Этот assay цитометрии потока можно анализировать mitophagy более быстро и деликатно, чем обычные микроскопия - или immunoblotting-на основе методов. Этот протокол может применяться для анализа mitophagy активности в различных типах клеток.

Пример анализа потока цитометрии CCCP-индуцированной mitophagy в клетки HeLa Паркин показан на рисунке 4. Использование метода анализа цитометрии потока, описанных выше, мы можем обнаружить резкое увеличение в mitophagic клетках в ворота «высокий». Процент клеток в...

Watch this Scientific Journal Video about Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima at JoVE.com

Sensitive Measurement of Mitophagy by Flow Cytometry Using the pH-dependent Fluorescent Reporter mt-Keima

Mitophagy, селективный деградации митохондрий, был вовлечен в митохондриальной гомеостаза и дерегулирование в различных заболеваний человека. Однако удобный экспериментальные методы для измерения активности mitophagy весьма ограничены. Здесь мы предоставляем чувствительных анализа для определения mitophagy активности с помощью проточной цитометрии.

Чувствительным измерение Mitophagy, поток цитометрии с помощью РН зависимых флуоресцентные репортер mt-Keima

Mitophagy is a process of selective removal of damaged or unnecessary mitochondria using autophagy machinery. Close links have been found between ...

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

IP-FCM: Иммунопреципитация обнаружен с помощью проточной цитометрии

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Проточной цитометрии Очистка мыши мейоза клетки

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Иммунологический из белков наружной мембраны с помощью проточной цитометрии из изолированных митохондрий

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Методы анализа внеклеточной везикул с использованием проточной цитометрии

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Измерение Endoreduplication подачей Cytometry изолированных клубней протопласта

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Высок объём измерение сапротрофные discoideum макропиноцитозом, поток цитометрии

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...