Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

Wij wil Dr. David Engelke bedanken voor zijn begeleiding en nuttige opmerkingen op dit manuscript. PJS - Ball State University laboratorium opstarten middelen; SCHAR - 1R15AI130950-01 verlenen.

Opmerking: Het protocol werd aangepast van Ref. 24.
1. verkrijgen van RNA en enzym van belang
<ol><li>Gebruik in vitro getranscribeerd RNAs intern aangeduid met 32P en recombinant His6-Mod5 uitgedrukt in en gezuiverd van E. coli, als eerder beschreven24.<ol>
<li>Voeren in vitro getranscribeerd RNAs (sectie 3) met behulp van T7 RNA polymerase in aanwezigheid van labelloze ATP, UTP, CTP, GTP en 10 µCi van ge...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions.">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li><li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+modification+of+transfer+RNA.">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li><li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA.">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li><li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA.">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li><li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications.">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li><li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation.">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li><li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA.">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li><li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+MOD5,+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li><li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria.">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li><li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li><li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells.">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li><li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase.">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li><li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+(TRIT1)+gene.">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li><li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA.">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).</li><li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer.">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li><li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor.">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li><li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3'+untranslated+region+of+TRIT1.">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).</li><li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information.">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1,+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population.">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer.">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients'+survival.">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li><li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing.">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li><li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tRNA-modifying+protein,+TRIT1,+forms+amyloid+fibers+in+vitro.">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li><li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+prion,+Mod5,+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress.">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li><li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases.">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+tRNA+modification+isopentenyl-A37+alters+mRNA+decoding+and+causes+metabolic+deficiencies+in+fission+yeast.">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li><li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li><li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence.">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes.">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li><li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li><li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+modification+landscape+in+human+disease.">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+N(1)-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA.">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3'+UTRs+and+near+stop+codons.">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA.">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+reveals+a+conserved,+widespread,+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis.">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li><li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA.">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs.">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li></ol>

RNA wijzigingen blijven aan steeds meer belangrijke en gevarieerde rol spelen in de cellulaire en organisch functie getoond. Als zodanig, staat de ontwikkeling van tests te ondervragen van RNA wijzigen enzymen centraal in het meer inzicht te krijgen in de fundamentele aspecten van de biologie. Dit protocol beschrijft een hoge resolutie in vitro assay karakteriseren de tRNA wijziging activiteit van Mod5.
Dit protocol heeft het duidelijk voordeel van het verstrekken van een directe, en ...

Ten minste 163 verschillende posttranscriptional RNA wijzigingen zijn geïdentificeerd, met deze wijzigingen verlenen divers en context-afhankelijke functies aan RNAs direct RNA structuur te beïnvloeden en op het gebied van interacties van RNA met andere moleculen1,2. Naarmate de waardering voor het aantal en de verscheidenheid van RNA wijzigingen toeneemt, is het essentieel om te testen dat betrouwbaar ondervragen kunnen zowel de RNA-wijzigingen en de enzymen die hen katalyseren ontwikkelen.
Een van de eerste wijzigingen van het RNA kan worden geïdentificeerd optreedt bij base 37 in tRNAs, grenzend aan de anti-codon op de 3' kant3,4. Een groep isopentenyl wordt overgedragen van dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) naar de positie van de N6 van adenosine 37 (ik6A37) 3,,5 op een subset van zowel de cytoplasmatische en de mitochondriale tRNAs. Ik6A37 verbetert vertaling trouw en efficiëntie door het verhogen van het tRNA affiniteit voor het ribosoom4,6 en ik6A37 is belangrijk voor de stressrespons bij bacteriën7. De enzymen die het uitvoeren van deze wijziging tRNA isopentenyl enzym worden genoemd en zijn zeer geconserveerd in bacteriën8,9, schimmels10wormen11, planten12en hogere eukaryoten13 , met inbegrip van mensen14.
Mutaties in het menselijk tRNA isopentenyl transferase gen, TRIT1, worden geassocieerd met ziekten bij de mens. Bijvoorbeeld, is een mutatie in TRIT1 gecorreleerd met een ernstige Mitochondriale ziekte, waarschijnlijk veroorzaakt door een defect in de mitochondriële eiwit synthese15,16. Verder TRIT1 is beschreven als een tumor suppressor gen17,18 en is betrokken bij verschillende soorten kanker, met inbegrip van melanoom19, borst20, maag21en longkankerziekten22 ,23. Tot slot, TRIT1 en Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl enzym zijn aggregatie-naar voren gebogen eiwitten die prion-achtige amyloïde vezels24,25,26 vormen. Deze opmerkingen betrekken mogelijk tRNA isopentenyl enzym in neurodegeneratieve ziekten, hoewel directe bewijs hiervoor is nog niet aangetoond.
Gezien de rol van dat isopentenyl enzym in vertaling en ziekte, methoden die direct meten ik6een isopentenyl transferase activiteit zijn belangrijk voor een mechanistische begrip van deze enzymen onder normale en ziekte staten. Een toenemend aantal methoden zijn beschikbaar om te detecteren ik6A RNA wijzigingen, met inbegrip van in vitro isopentenylation testen, positieve kruising bij gebrek aan ik6een (PHA6) testen, dunne laag chromatografie (TLC), amino acid aanvaarding activiteit testen en massaspectrometrie benaderingen (herzien in Ref. 4).
Een isopentenylation in vitro assay is beschreven dat gebruik maakt van de 14C-DMAPP en labelloze tRNAs. In deze test, wordt radioactieve koolstof overgebracht naar RNA van 14C-DMAPP door de isopentenyl transferase. Terwijl deze test zeer gevoelig is, is het vaak moeilijk om te bepalen de specifieke residu dat is gewijzigd9,20,27. PHA6 testen zijn afhankelijk van de omvangrijke ik6A wijziging kruising van een 32P-geëtiketteerden sonde verspreid over het gewijzigde residu verstoren. Als zodanig, hybridisatie is groter bij gebrek aan een i6een wijziging18,28,29. PHA6 testen zijn zeer gevoelig, en staat totaal RNA cellulaire lysates is onttrokken te analyseren. Bovendien geeft de mogelijkheid om het ontwerp van de sondes die specifiek zijn voor het RNA van belang deze methode aanzienlijke doel flexibiliteit. PHA6 tests zijn echter beperkt tot de karakterisering van de wijzigingen die optreden inzake residuen in het gerichte gebied van de sonde en zijn dus minder kans op identificatie van nieuwe wijziging sites. Bovendien, zoals gebrek aan bindende is een indicatie van de wijziging, zal andere wijzigingen of mutaties die invloed hebben op RNA-bindende verwarren gegevensanalyse.
Een andere benadering combineert benzyl DEAE cellulose (BD) cellulose chromatografie met aminozuur aanvaarding activiteit als een uitlezing van ik6A wijzigingen in tRNA30. Deze aanpak testen direct de functie van de i6A wijziging, maar het is een indirecte benadering te detecteren ik6A wijziging en mist resolutie om wijzigingen aan een specifiek residu in het RNA in kaart. Een TLC-aanpak is gebruikt voor het detecteren van totale tRNA ik6A wijzigingen. In deze benadering intern 32P-label tRNAs naar één nucleotiden worden verteerd en tweedimensionale TLC-analyse wordt gebruikt ter identificatie van de isopentenylation. Deze benadering is zeer gevoelig voor het opsporen van total ik6A in een RNA monster maar op de spijsvertering, alle opeenvolgingsinformatie verloren; de onderzoeker heeft dus geen enkele manier om te bepalen welke residuen geweest gewijzigde31.
Meer recentelijk, vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) methoden hebben ontwikkeld die kwantitatief vergelijk totale RNA wijzigingen tussen soorten, celtypes en proefomstandigheden32,33, 34. Een beperking van deze methode is dat het minder goed in staat om de identiteit en positie binnen het RNA waaruit de gemodificeerde nucleoside was afgeleid34. Bovendien, de deskundigheid en apparatuur die nodig is voor het uitvoeren van deze experimenten beperken de bruikbaarheid van deze aanpak.
Daarnaast zijn verschillende technologieën van de volgende generatie sequencing ontwikkeld om te kaart RNA wijzigingen transcriptome bestrijkende34. Immunoprecipitation van RNAs met antilichamen specifiek voor een bepaalde wijziging (RIP-Seq) kunnen de onderzoeker te identificeren alle sequenties met een specifieke wijziging35,36. Reverse-transcriptase-gebaseerde benaderingen zoals Chem-Seq en niet-random mismatch sequencing is bovendien afhankelijk van verstoringen van de omgekeerde transcriptie reactie op de gewijzigde residuen37,38,39. Ondanks het voordeel van deze technieken om de kaart van RNA wijzigingen transcriptome bestrijkende, worden RIP-seq en Chem-Seq technologieën beperkt door het gebrek aan betrouwbare antilichamen of reactieve chemicaliën beschikbaar voor elke specifieke modificatie, respectievelijk34. Bovendien, reverse-transcriptase enzymen moeten uitvoeren Chem-Seq en niet-random mismatch sequencing technieken kunnen worden belemmerd door stabiele RNA structuren. De sterk gewijzigde en structureel stabiele aard van tRNAs maken hen bijzonder moeilijk te ondervragen met behulp van deze technieken. Tot op heden, hebben next-generation sequencing gebaseerde technologieën niet nog is gebruikt om kaart ik6een wijzigingen-34.
Hierin beschrijven we een eenvoudige en directe aanpak om te detecteren ik6A tRNA wijzigingen in vitro. Deze methode maakt gebruik van incubatie van RNAs met recombinant S. cerevisiae isopentenyl transferase (Mod5), gevolgd door RNase T1 spijsvertering, en 1-dimensionale gel elektroforese analyse ik6A wijzigingen in kaart. Deze aanpak is direct en vereist weinig gespecialiseerde expertise om de gegevens te analyseren. Bovendien is deze methode kan worden aangepast aan andere RNA wijzigen van enzymen, met inbegrip van enzymen die covalent het molecuulgewicht van RNA of een RNA van mobiliteit door een gel veranderen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

N6- isopentenyladenosine RNA wijzigingen zijn functioneel divers en hoogst geconserveerde onder de prokaryoten en de eukaryoten. Een van de hoogst geconserveerde N6- isopentenyladenosine wijzigingen plaatsvindt aan de A37 positie in een subset van tRNAs. Deze wijziging verbetert vertaling efficiëntie en trouw doordat de affiniteit van het tRNA van het ribosoom. Mutatie van enzymen die verantwoordelijk zijn voor deze wijziging in eukaryoten zijn geassocieerd met verschillende staten van de ziekte, met inbegrip van mitochondriale dysfunctie en kanker. Daarom is het belangrijk voor begrip van de normale en pathologische eukaryotische biologie inzicht in de specificiteit van het substraat en biochemische activiteiten van deze enzymen. Veelzijdige methoden heeft tewerkgesteld te karakteriseren ik6A wijzigingen. Hierin is beschreven van een directe aanpak voor het opsporen van isopentenylation door Mod5. Deze methode maakt gebruik van incubatie van RNAs met een recombinant isopentenyl transferase, gevolgd door RNase T1 spijsvertering, en 1-dimensionale gel elektroforese analyse te detecteren ik6A wijzigingen. Bovendien, wordt het potentiële aanpassingsvermogen van dit protocol te karakteriseren van andere RNA-aanpassen-enzymen besproken.

Mod5 was geïncubeerd met een tyrosine tRNA of serine tRNA in de aanwezigheid of afwezigheid van DMAPP. Na de wijziging reactie waren producten RNase T1-verteerd, die cleaves het einde 3' van alle guanosines verlaten van een 3' calciumguanosine monophosphates (GMP)24 (Figuur 1). Volledige spijsvertering van de RNAs produceert een voorspelbaar patroon van radiolabeled fragmenten(Figuur 2),d...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Hier beschrijven we een protocol voor de Biochemische karakterisering van de gist RNA-aanpassen enzym, Mod5, en bespreken hoe dit protocol kan worden toegepast op andere RNA-aanpassen-enzymen.

Een In Vitro Assay tRNA-Isopentenyl Transferase activiteit detecteren

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Het algemene doel van dit protocol is om biochemisch te karakteriseren tRNA-Isopentenyl Transferase Activiteit In Vitro. Deze methode is nuttig voor de in-vitro detectie en karakterisering van tRNA-isopentenyl transferase activiteit van gezuiverde recombinante enzymen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een eenvoudige en directe test wordt gebruikt om een covalente RNA-modificatie te detecteren.Hoewel deze methode inzicht geeft in tRNA-isopentenyl transferase activiteit, is het potentieel aanpasbaar voor de biochemische karakterisering van breed scala of RNA wijzigenzymen. De eerste stap in deze procedure is om de glasplaten die zullen worden gebruikt voor het gieten van de gel grondig schoon te maken. Was de borden met zeep en water, spoel goed af met gedeïoniseerd water en maak de borden schoon met isopropanol en pluisvrije doekjes.Monteer vervolgens de platen en afstandhouders. Meng de volgende reagentia om een 100 milliliter 20% acrylamide, 7.5 molaire ureum, 1x TBE gel te maken. 80 milliliter ureum gelconcentraat, 10 milliliter ureum gel verdunningsmiddel en 10 milliliter ureumgelbuffer.Voeg 40 microliter T-med en 800 microliter vers bereide 10% ammoniumpersulfaat toe aan het mengsel. Trek de geloplossing in een grote spuit en doseer de geloplossing tussen de glasplaten die op het glas tikken terwijl de oplossing wordt afgegeven om bellenvorming te voorkomen. Laat de gel 30 minuten stollen bij kamertemperatuur.Nadat de gel is gestold, plant u de gel op een verticaal gelapparaat. Vul de bovenste en onderste bufferkamers met 1x TBE. Twee uur voor het laden van de gel, pre-run de gel op 20 milliampère gedurende twee uur om de buffer grens uit te lopen de kleinste oligonucleotiden.Bereid elke reactie voor op de RNA isopentenylation assay in een uiteindelijk volume van 17 microliters. Voeg aan elke buis 50 millimolor Tris-HCl, pH 7.2, 1.2 millimolar ATP, 5.8 millimolar magnesiumchloride, 0.2 millimolar DMAPP, 10 eenheden RNase remmer, 40, 000 CPM intern 32P geëtiketteerd RNA, 5.3 micromolar Mod5, en 1.2 millimolar 2-mercaptoethanol. Broed de reacties op 37 graden Celsius gedurende een uur.Na een uur, ethanol neerslaan de RNase met behulp van 2,5 volume van 100% ethanol en 1/10 volume van 3,5 molaire natrium acetaat pH 5,5, en plaats het negatief 20 graden Celsius voor een uur 's nachts. Vervolgens centrifugeren de RNA monsters op 15, 400 g's en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en was elke RNA-pellet met 500 microliter van 70% ethanol.Centrifugeren de monsters op 15, 400 g's en vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder voorzichtig de supernatant en de lucht drogen de RNA pellets gedurende 15 minuten of totdat alle ethanol is verdampt. Volgende opnieuw opschorten elke RNA pellet in 10 microliters van acht molaire ureum.Voeg 150 eenheden RNase T1 toe aan elk monster en broed 's nachts uit met 37 graden Celsius. Voeg de volgende dag twee microliters van 6x laadbuffer toe aan elk monster. Laad 10 microliter van elk RNA monster op een pre-run, 20%polyacrylamide, 7,5 molaire ureumgel.Voer de gel op 25 milliampère voor twee uur. Na twee uur stopt u de elektroforese en verwijdert u de gel uit het apparaat. Breek de afdichting tussen de twee glasplaten en verwijder voorzichtig een van de glazen platen met de gel die op beide platen achterblijft.Plaats een laag plastic folie over de gel en bloot op een fosfor scherm voor drie uur. Dit protocol detecteert op betrouwbare wijze isopentenylation van zowel canonieke als niet-canonische tRNA-residuen gewijzigd door de S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. In dit voorbeeld tyrosine tRNA werd intern gelabeld met 32P-adenosine en Mod5 werd geïncubeerd met RNase in de aanwezigheid of afwezigheid van DMAPP.De RNAs werden verteerd met RNase T1 en opgelost op een denaturering polyacrylamide gel. Mod5 wijzigt het voorspelde residu in aanwezigheid van DMAPP en wordt aangegeven door de verschoven 10 nucleotide, triple adenosine met fragment op nucleoside posities 36 tot en met 38 bevatten fragment in het tyrosine tRNA. De gewijzigde adenosine 37 verblijf is aangegeven met een sterretje.Ook wanneer de serine tRNA wordt geïncubeerd met Mod5 en DMAPP, wordt een volledige verschuiving van de 10 nucleotide triple adenosine met fragment op nucleoside positie 36 tot en met 38 waargenomen. Interessant is dat een gedeeltelijke verschuiving van een zeven nucleotide fragment wordt waargenomen dat niet de triple adenosine met fragment op nucleoside posities 36 tot en met 38 bevat, wat suggereert dat de drievoudige adenosine met fragment op nucleoside positie 36 tot en met 38 sequentie en structuur niet nodig is voor Mod5 in vitro activiteit. Eenmaal onder de knie deze techniek duurt twee, vier tot zes uur dagen als het goed wordt uitgevoerd.Nou proberen deze procedure is het belangrijk om te onthouden om te handhaven en de integriteit van het RNA te controleren, omdat RNA degradatie kan de RNA wijziging effect en zal verwarren interpretatie van gegevens. Na deze procedure mutatiestudies met behulp van uw enzym van belang, kan worden gedaan om specifieke residuen of domeinen die nodig zijn voor enzymatische activiteit te bepalen. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van RNA-biologie, om te zeggen dat tRNA-isopentenyl transferase activiteiten van prokaryotische en eukaryotische enzymen.Na het bekijken van deze video, moet u een goed begrip van hoe het protocol uit te voeren voor de detectie van isopentenyl transferase activiteit van uw enzym van belang. Vergeet niet dat het werken met radioactiviteit zeer gevaarlijk kan zijn en voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van de juiste BESCHERMINGSMIDDELEN, het gebruik van adequate afscherming en het goed verwijderen van radioactiviteit moet altijd worden genomen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detectie van de pH-afhankelijke activiteit van<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; en<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Een fluorescentie-gebaseerde test fosfolipide scramblase Activity

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identificatie van cycline-afhankelijk Kinase 1 specifieke fosforylatie Sites door een Kinase In Vitro Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kwantificering van hypopigmentatie activiteit In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Een colorimetrische assay van citraat synthase activiteit in Drosophila melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Een in vitro single-molecule imaging assay voor de analyse van cap-afhankelijke vertaalkinetiek

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: een snelle, onbevooroordeelde fluorescerende methode om veranderingen in synapsdichtheid te detecteren

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...