Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

Nous tenons à remercier le Dr. David Engelke pour ses conseils et commentaires utiles sur ce manuscrit. PJS - des fonds de démarrage de laboratoire de Ball State University ; DAB - accorder 1R15AI130950-01.

Remarque : Le protocole a été adapté du Réf. 24.
1. obtention de l’ARN et enzymes d’intérêt
<ol><li>Usage in vitro transcrit les ARN marqué en interne avec 32P, et His6-Mod5 recombinant exprimée en et purifié à partir de e. coli, comme précédemment décrit24.<ol>
<li>Introduire dans vitro transcrit RNAs (section 3) à l’aide d’ARN polymérase T7 en présence d’ATP sans étiquette, UTP...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. 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Modifications de RNA continuent de figurer à jouer un rôle toujours plus important et diversifié dans la fonction cellulaire et organismique. Ainsi, le développement des tests d’interroger RNA modification des enzymes est central pour mieux comprendre les aspects fondamentaux de la biologie. Ce protocole décrit une analyse haute résolution in vitro afin de caractériser l’activité de modification tRNA de Mod5.
Ce protocole a l’avantage d’offrir une lecture directe et fa...

Au moins 163 modifications de RNA post-transcriptionnel distinctes ont été identifiées, avec ces modifications conférant des fonctions variées et contextuelle à RNAs, directement influencer la structure d’ARN et qui touchent de l’ARN, des interactions avec d’autres molécules1,2. Que l’appréciation par le nombre et la variété de modifications de RNA augmente, il est essentiel d’élaborer des tests qui peuvent interroger fiable tant les modifications de RNA et les enzymes qui catalysent les.
Une des premières modifications RNA d’identifier se produit à base 37 dans les ARNt, adjacent à l’anti-codon sur les 3' côté3,4. Un groupe d’isopentényl est transféré de diméthylallylpyrophosphate (DMAPP) sur la position N6 d’adénosine 37 (j’ai6A37) 3,5 sur un sous-ensemble des ARNt cytoplasmiques et mitochondriale. J’ai6A37 améliore la fidélité de la traduction et l’efficacité en augmentant d’affinité de l’ARNt pour le ribosome4,6 et j’ai6A37 est importante pour la réponse au stress en bactéries7. Les enzymes qui effectuent cette modification sont appelés transférases isopentényl tRNA et sont hautement conservées chez les bactéries8,9, champignons10, vers11, plantes12et chez les eucaryotes supérieurs13 , y compris les humains,14.
Des mutations dans le gène humain de transférase isopentenyl de tRNA, TRIT1, sont associées à des maladies humaines. Par exemple, une mutation dans TRIT1 est corrélée avec une grave maladie mitochondriale, probablement causée par un défaut de synthèse de protéines mitochondriales15,16. Par ailleurs, TRIT1 a été décrit comme un suppresseur de tumeur gène17,18 et est impliquée dans plusieurs types de cancers dont le mélanome19, poitrine20, gastrique21et cancers du poumon22 ,,23. Enfin, TRIT1 et Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentényl transférase est sujettes à l’agrégation de protéines qui forment prion comme fibres amyloïdes24,25,26. Ces observations impliquent potentiellement transférases isopentényl tRNA dans les maladies neurodégénératives, même si une preuve directe pour que cela n’a pas encore été démontrée.
Compte tenu du rôle qu’isopentényl transférase joue dans la traduction et la maladie, les méthodes que j’ai mesurer directement6une activité d’isopentényl transférase sont importants pour une interprétation mécaniste de ces enzymes dans des conditions normales et états pathologiques. Un nombre croissant de méthodes est disponible pour détecter les adaptations de l’ARN de6, y compris en vitro isopentenylation essais, hybridation j’ai en l’absence d’i6A (PHA6) essais, mince chromatographie en couche (TLC), acides aminés tests d’activité acceptation et approches de la spectrométrie de masse (révision Réf. 4).
Une essai in vitro isopentenylation avec a été décrit qui utilise 14C-DMAPP et ARNt sans étiquette. Dans ce test, le carbone radioactif est transféré à l’ARN du 14C-DMAPP de l’isopentényl transférase. Bien que ce test est très sensible, il est souvent difficile de déterminer le résidu spécifique qui est modification9,20,27. PHA6 analyses reposent sur l’encombrant j’ai6A modification interférant avec l’hybridation d’une sonde marquée P 32, s’étendant sur le résidu mis à jour le. À ce titre, l’hybridation est plus grande en l’absence d’un i6une modification18,28,29. Les dosages de PHA6 sont très sensibles et capable d’analyser l’ARN total extrait de lysats cellulaires. En outre, la capacité de concevoir des sondes spécifiques de l’ARN d’intérêt permet cette méthode cible importante. Cependant, PHA6 tests sont limités à la caractérisation des modifications qui se produisent sur les résidus dans la région ciblée de la sonde et sont donc moins susceptibles d’identifier les sites de nouvelles modifications. En outre, comme l’absence de liaison est révélateur de la modification, autres modifications ou mutations qui affectent les ARN contraignantes confondre l’analyse des données.
Une autre approche combine chromatographie de cellulose de benzyle DEAE cellulose (BD) avec activité acceptation d’acides aminés comme une lecture de je6A des modifications dans le tRNA30. Cette approche tests directement la fonction du i modification6A, mais c’est une approche indirecte pour détecter j’ai6A modification et n’a pas de résolution pour mapper les modifications apportées à un résidu spécifique dans l’ARN. Une approche de TLC a été utilisée pour détecter les ARNt total j’ai6A modifications. Dans cette approche, en interne, 32P-étiqueté ARNt sont digérées en nucléotides simples et analyse bidimensionnelle de TLC est utilisé pour identifier des isopentenylation. Cette approche est très sensible dans la détection j’ai total6A dans un échantillon donné de RNA mais après digestion, toutes les informations de séquence sont perdues ; ainsi, le chercheur n’a aucun moyen de déterminer les résidus ont été mis à jour le31.
Plus récemment, les méthodes de spectrométrie de masse en tandem par chromatographie liquide (LC-MS/MS) ont été développés qui comparer quantitativement les modifications de RNA totales entre espèces, les types de cellules et conditions expérimentales32,33, 34. Une limitation de cette méthodologie est qu’il est moins en mesure de déterminer l’identité et la position au sein de l’ARN d'où le nucléoside modifié a été dérivé de34. De plus, l’expertise et l’équipement nécessaire pour exécuter ces expériences limitent l’aspect pratique de cette approche.
En outre, plusieurs technologies de séquençage de nouvelle génération ont été développés pour mapper les RNA modifications à l’échelle du transcriptome34. Immunoprécipitation d’ARN avec des anticorps spécifiques à une modification particulière (RIP-Seq) permettent à l’enquêteur d’identifier toutes les séquences contenant une modification spécifique35,36. En outre, approches axées sur la transcriptase inverse comme Chem-Seq et séquençage de décalage non aléatoire s’appuient sur les perturbations de la réaction de transcription inverse les résidus modifiés37,38,39. Malgré l’avantage de ces techniques pour mapper les modifications transcriptome-échelle de RNA, RIP-seq et Seq-Chem technologies sont limités par l’absence d’anticorps fiables ou de produits chimiques réactifs disponibles pour chaque modification spécifique, respectivement34. En outre, reverse transcriptase enzymes nécessaires à l’exécution de Chem-Seq et les techniques de séquençage de décalage non aléatoire peuvent être entravés par des structures d’ARN stables. Le caractère fortement modifié et structurellement stable des ARNt rendent particulièrement difficiles à interroger à l’aide de ces techniques. A ce jour, la nouvelle génération basée sur le séquençage des technologies n’ont pas encore été utilisés à carte j’ai6une modification34.
Ici, les auteurs décrivent une approche simple et directe pour détecter j’ai6un ARNt modifications in vitro. Cette méthode utilise l’incubation d’ARN avec recombinant S. cerevisiae isopentényl transférase (Mod5), suivie de la digestion de la RNase T1 et analyse par électrophorèse sur gel 1D à la carte j’ai6A modifications. Cette approche est directe et nécessite peu d’expertise pour analyser les données. En outre, cette méthode est adaptable aux autre RNA modification des enzymes, y compris les enzymes qui changent par covalence le poids moléculaire de l’ARN ou de mobilité d’un ARN à travers un gel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

Modifications de N6- isopentényl RNA sont fonctionnellement variées et hautement conservée chez les procaryotes et les eucaryotes. Une des plus hautement conservée N6- isopentényl modifications se produit à la position de A37 dans un sous-ensemble des ARNt. Cette modification améliore l’efficacité de la traduction et de la fidélité en augmentant l’affinité de l’ARNt pour le ribosome. Mutation des enzymes responsables de cette modification chez les eucaryotes sont associées à plusieurs états pathologiques, dont le cancer et dysfonctionnement mitochondrial. Par conséquent, comprendre la spécificité de substrat et l’activité biochimique de ces enzymes est important pour la compréhension de la biologie eucaryote normale et pathologique. Un large éventail de méthodes a été utilisé pour caractériser les modifications6A je. Dans les présentes est décrit une approche directe pour la détection des isopentenylation par Mod5. Cette méthode utilise l’incubation d’ARN avec une transférase isopentényl recombinante, suivie de la digestion de RNase T1 et l’analyse par électrophorèse sur gel 1D pour détecter les modifications de6A je. En outre, la capacité d’adaptation éventuelle du présent protocole pour caractériser d’autres enzymes de modification des RNA est discutée.

Mod5 est incubé avec une tyrosine ARNt ou sérine ARNt en présence ou en absence de DMAPP. Suite à la réaction de la modification, produits ont été digérés RNase T1, qui s’attache à l’extrémité 3' de tous les guanosines laissant un 3' guanosine monophosphates (GMP)24 (Figure 1). La digestion complète du RNAs produit un schéma prévisible des fragments radioactifs (Figure 2A</strong...

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Nous décrivons ici un protocole pour la caractérisation biochimique de l’enzyme de RNA-modification de la levure, Mod5 et discuter de comment ce protocole pourrait être appliqué à d’autres enzymes de modification des RNA.

Un test In Vitro pour détecter l’activité ARNt-isopentényl transférase

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

L’objectif global de ce protocole est de caractériser biochimiquement l’activité de transferase tRNA-Isopentenyl in vitro. Cette méthode est utile pour la détection in vitro et la caractérisation de l’activité de transferase tRNA-isopentenyl des enzymes recombinantes purifiées. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un essai simple et direct utilisé pour détecter une modification covalente de l’ARN.Bien que cette méthode donne un aperçu de l’activité de transferase tRNA-isopentenyl, elle est potentiellement adaptable pour la caractérisation biochimique d’enzymes modificables à large portée ou arn. La première étape de cette procédure consiste à nettoyer soigneusement les plaques de verre qui seront utilisées pour moulage du gel. Laver les assiettes avec du savon et de l’eau, bien rincer à l’eau déionisée, puis nettoyer les assiettes avec des lingettes sans isopropanol et sans peluche.Ensuite, assemblez les plaques et les entret spatiales. Mélanger les reagents suivants pour faire un 100 millilitres 20% acrylamide, 7,5 urée molaire, 1x gel TBE. 80 millilitres de concentré de gel d’urée, 10 millilitres de gel d’urée diluant, et 10 millilitres de tampon gel d’urée.Ajouter 40 microlitres de T-med et 800 microlitres de persulfate de 10% ammonium fraîchement préparé au mélange. Dessinez la solution de gel dans une grande seringue et distribuez la solution de gel entre les plaques de verre tapant sur le verre tout en distribuant la solution pour empêcher la formation de bulles. Laisser le gel se solidifier à température ambiante pendant 30 minutes.Une fois le gel solidifié, plantez le gel sur un appareil de gel vertical. Remplissez les chambres tampons supérieures et inférieures de 1x TBE. Deux heures avant le chargement du gel, pré-exécuter le gel à 20 milliamps pendant deux heures pour permettre à la limite tampon de sortir les plus petits oligonucléotides.Préparez chaque réaction pour l’essai d’isopentenylation d’ARN dans un volume final de 17 microlitres. Ajouter à chaque tube 50 millimolor Tris-HCl, pH 7.2, 1.2 millimolar ATP, chlorure de magnésium de 5.8 millimlaire, 0.2 millimolar DMAPP, inhibiteur de 10 unités de RNase, 40.000 CPM interne 32P étiqueté ARN, 5.3 micromolar Mod5, et 1.2 millimolar 2-mercaptoethanol. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant une heure.Après une heure, l’éthanol précipite le RNase en utilisant 2,5 volume de 100% éthanol et 1/10 volume de 3,5 molaire de pH d’acétate de sodium 5,5, et le placer négatif 20 degrés Celsius pendant une heure pendant la nuit. Ensuite, centrifugeuse les échantillons d’ARN à 15, 400 g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirez soigneusement le supernatant et lavez chaque granulé d’ARN avec 500 microlitres de 70 % d’éthanol.Centrifuger les échantillons à 15, 400 g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirer délicatement le surnatant et sécher à l’air les granulés d’ARN pendant 15 minutes ou jusqu’à ce que tout l’éthanol se soit évaporé. Ensuite, suspendez chaque granulé d’ARN dans 10 microlitres de huit urée molaire.Ajouter 150 unités de RNase T1 à chaque échantillon et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajouter deux microlitres de tampon de chargement 6x à chaque échantillon. Chargez 10 microlitres de chaque échantillon d’ARN sur un gel d’urée pré-exécuté, 20% polyacrylamide, 7,5 molaires d’urée.Faire fonctionner le gel à 25 milliamps pendant deux heures. Après deux heures, arrêter l’électrophorèse et retirer le gel de l’appareil. Casser le joint entre les deux plaques de verre et retirer soigneusement l’une des plaques de verre avec le gel restant sur l’une ou l’autre plaque.Placez une couche de pellicule plastique sur le gel et exposez-la sur un écran de phosphore pendant trois heures. Ce protocole détecte de manière fiable l’isopentenylation des résidus canoniques et noncanoniques d’ARN modifiés par le Mod5 d’isopentenyl d’isopentenyl de S.cerevisiae. Dans cet exemple tyrosine tRNA a été étiqueté à l’interne avec 32P-adénosine et Mod5 a été incubé avec RNase en présence ou en l’absence de DMAPP.Les ARN ont été digérés avec RNase T1 et résolus sur un gel de polyacrylamide dénaturant. Mod5 modifie le résidu prévu en présence de DMAPP et indiqué par le nucléotide décalé de 10, triple adénosine contenant le fragment aux positions nucléoside 36 à 38 contiennent le fragment dans le tRNA de tyrosine. L’adénosine modifiée 37 réside est indiquée avec un astérisque.De même, lorsque l’ARN trine est incubé avec Mod5 et DMAPP, un décalage complet de l’adénosine triple nucléotide contenant du fragment à la position nucléoside 36 à 38 est observé. Fait intéressant, on observe un déplacement partiel d’un fragment de sept nucléotides qui ne contient pas le triple adénosine contenant du fragment aux positions nucléoside 36 à 38, ce qui suggère que le triple adénosine contenant du fragment à la position nucléoside 36 à 38 séquence et structure peut ne pas être nécessaire pour l’activité in vitro mod5. Une fois maîtrisée, cette technique prendra deux, quatre à six jours d’heure si elle est effectuée correctement.Bien essayer cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir et de surveiller l’intégrité de l’ARN, parce que la dégradation de l’ARN pourrait effectuer la modification de l’ARN et confondre l’interprétation des données. Suite à cette procédure des études mutationnelles en utilisant votre enzyme d’intérêt, pourrait être fait pour déterminer les résidus spécifiques ou les domaines nécessaires pour l’activité enzymatique. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN, pour dire les activités de transferase tRNA-isopentenyl des enzymes procaryotes et eucaryotes.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer le protocole pour la détection de l’activité de transferase isopentenyl de votre enzyme d’intérêt. N’oubliez pas que le travail avec la radioactivité peut être extrêmement dangereux et des précautions telles que le port d’epi approprié, l’utilisation d’un blindage adéquat, et l’élimination de la radioactivité correctement devraient toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

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