Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

Wir möchten Dr. David Engelke für seine Führung und hilfreichen Kommentare auf dieser Handschrift zu danken. PJS - Ball State University Labor Start Mittel; DAB - 1R15AI130950-01 zu gewähren.

Hinweis: Das Protokoll wurde vom Ref. 24angepasst.
1. besorgen Sie RNA und Enzym von Interesse
<ol><li>Einsatz in Vitro transkribiert RNAs intern mit 32P gekennzeichnet, und rekombinante His6-Mod5 ausgedrückt und von E. Coli, wie zuvor beschrieben24gereinigt.<ol>
<li>Einführung in Vitro transkribiert RNAs (Abschnitt 3) T7-RNA-Polymerase im Beisein von unbeschrifteten ATP, UTP, CTP, GTP und 10 µCi Gel ger...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. 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RNA-Änderungen weiterhin nachgewiesen werden, dass immer mehr wichtige und vielfältige Rollen in zellulären und organismal Funktion zu spielen. Als solche ist die Entwicklung von Assays RNA ändern Enzyme Verhören zentral zu einem besseren Verständnis der grundlegenden Aspekte der Biologie. Dieses Protokoll beschreibt einen hochauflösende in Vitro Assay zur Charakterisierung der tRNA Modifikation Aktivität von Mod5.
Dieses Protokoll hat den entscheidenden Vorteil bietet eine di...

Mindestens 163 verschiedene posttranskritionelle RNA Modifikationen wurden identifiziert, mit diesen Änderungen Übertragung vielfältige und Kontext-abhängige Funktionen RNAs direkt RNA-Struktur zu beeinflussen und Auswirkungen auf die Beziehungen der RNA Moleküle1,2. Mit zunehmender Wertschätzung für die Anzahl und Vielfalt der RNA Änderungen ist es wichtig, Tests zu entwickeln, die zuverlässig zu verhören kann die RNA-Modifikationen und die Enzyme, die sie katalysieren.
Eine der ersten RNA Änderungen identifiziert werden erfolgt auf Basis 37 in tRNAs, angrenzend an das Anti-Codon auf 3' Seite3,4. Eine Isopentenyl-Gruppe von Dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) auf die N6-Position von Adenosin 37 übertragen (ich6A37) 3,5 auf eine Teilmenge der zytoplasmatischen und mitochondriale tRNAs. Ich6A37 verbessert die Übersetzung Treue und Effizienz durch eine Erhöhung der tRNA-Affinität für das Ribosom4,6 und ich6A37 ist wichtig für die Stress-Reaktion in Bakterien7. Die Enzyme, die diese Änderung durchführen werden tRNA Isopentenyl Transferasen bezeichnet und sind hoch konserviert in Bakterien8,9, Pilze10Würmer11, Pflanzen12und höheren Eukaryoten13 , einschließlich Menschen14.
Mutationen im menschlichen tRNA Isopentenyl Transferase Gens, TRIT1, sind menschliche Krankheiten zugeordnet. Zum Beispiel ist eine Mutation im TRIT1 mit einer schweren mitochondrialen Erkrankung, wahrscheinlich verursacht durch einen Defekt im mitochondrialen Protein Synthese15,16korreliert. Darüber hinaus TRIT1 wurde beschrieben als ein Tumorsuppressor Gen17,18 und ist in verschiedene Arten von Krebs einschließlich Melanom19, Brust20, Magen-21und Lungenkrebs22 verwickelt ,23. Zu guter Letzt TRIT1 und Mod5 (Saccharomyces Cerevisiae) Isopentenyl Transferasen sind Aggregation neigen Proteine, die Prion-wie Amyloid Fasern24,25,26bilden. Diese Beobachtungen implizieren potenziell tRNA Isopentenyl Transferasen bei neurodegenerativen Erkrankungen, obwohl direkte Beweise für diese noch nicht gezeigt wurde.
Angesichts der Rolle, dass Isopentenyl Transferasen in Übersetzung und Krankheit, Methoden, mit denen direkt ich6Messen spielen eine Isopentenyl-Transferase-Aktivität sind wichtig für ein mechanistisches Verständnis dieser Enzyme unter normalen Bedingungen und Krankheitszustände. Eine wachsende Zahl von Methoden stehen zur Erkennung ich6A RNA Änderungen, einschließlich der in-vitro- Isopentenylation-Assays, positive Hybridisierung in Ermangelung von i6(PHA6) Tests, thin Layer Chromatography (TLC), Aminosäure Akzeptanz-Aktivität-Assays und Massenspektrometrie Ansätze (bewertet in Ref. 4).
Ein in-vitro- Isopentenylation-Assay ist beschrieben worden, die 14C-DMAPP und unbeschriftete tRNAs verwendet. In diesem Test wird radioaktiven Kohlenstoff an RNA von 14C-DMAPP durch Isopentenyl-Transferase übertragen. Während dieses Tests sehr empfindlich ist, ist es oft schwierig zu bestimmen, dass bestimmte Rückstände, die9,20,27geändert. PHA6 Assays verlasse ich mich auf die sperrigen6A Änderung Hybridation von 32P-markierten Sonden überspannt die modifizierte Rückstände zu stören. Als solche Hybridisierung ist größer bei fehlender ein i6eine Änderung18,28,29. PHA6-Assays sind hochsensible und geeignet zur Analyse von Gesamt-RNS von zellulären Lysates extrahiert. Darüber hinaus bietet die Möglichkeit, Sonden spezifisch auf die RNA von Interesse zu entwerfen diese Methode wesentliche Ziel Flexibilität. PHA6-Assays sind jedoch beschränkt auf die Charakterisierung der Änderungen, die auf Rückstände in der gezielten Region der Sonde auftreten und sind daher weniger wahrscheinlich neue Modifikation Websites identifizieren. Darüber hinaus fehlen verbindliche Richtwerte der Änderung ist, werden andere Veränderungen oder Mutationen, die RNA-bindende beeinflussen Datenanalyse verwechseln.
Ein weiterer Ansatz verbindet Benzyl DEAE Zellulose (BD) Zellulose Chromatographie mit Aminosäure Akzeptanz Aktivität als ein Auslesen von i6A Modifikationen in tRNA30. Dieser Ansatz Proben direkt die Funktion des i6A Änderung, sondern es ist eine indirekte Annäherung an erkennen ich6A Änderung und Auflösung zuordnen Änderungen an eine bestimmte Rückstände in der RNA fehlt. Ein TLC-Ansatz verwendet wurde, um insgesamt tRNA erkennen ich6A Modifikationen. Bei diesem Ansatz intern 32P-Label tRNAs werden einzelne Nukleotide verdaut und zweidimensionale TLC-Analyse wird verwendet, um Isopentenylation zu identifizieren. Dieser Ansatz ist sehr empfindlich bei der Aufdeckung von total ich6A in einer bestimmten RNA-Probe aber auf Verdauung, alle sequenzinformation ist verloren; So hat der Prüfer keineswegs zur Bestimmung, welche Rückstände veränderter31gewesen sein.
Vor kurzem sind flüssige Chromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) Methoden entwickelt worden, die total RNA-Änderungen zwischen Arten, Zelltypen und Versuchsbedingungen32,33quantitativ zu vergleichen, 34. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass es weniger in der Lage zu bestimmen, dass die Identität und die Position innerhalb der RNA aus dem modifizierten Nukleosid war34abgeleitet. Darüber hinaus begrenzen das Know-how und die notwendige Ausrüstung für diese Experimente führen die Praktikabilität dieses Ansatzes.
Darüber hinaus entstanden mehrere Next Generation Sequencing Technologien um RNA Modifikationen Transkriptom-weite34zuzuordnen. Immunopräzipitation RNAs mit Antikörpern, die spezifisch für eine bestimmte Änderung (RIP-Seq) ermöglichen die Ermittler alle Sequenzen mit einer spezifischen Änderung35,36zu identifizieren. Darüber hinaus setzen Reverse-Transkriptase-basierte Ansätze wie Chem-Seq und nicht-zufällige Abweichung Sequenzierung auf Störungen der reversen Transkription Reaktion bei der modifizierten Rückstände37,38,39. Trotz der Vorteil dieser Techniken RNA Modifikationen Transkriptom-weiten zuordnen sind RIP-Seq und Chem-Seq-Technologien durch den Mangel an zuverlässigen Antikörper oder reaktiven Chemikalien für jede gezielte Modifizierung bzw.34begrenzt. Darüber hinaus Enzyme Reverse Transkriptase verpflichtet, Chem-Seq durchführen und nicht-zufällige Abweichung Sequenzierung Techniken können durch stabile RNA-Strukturen behindert werden. Die stark veränderte und strukturell stabile Natur der tRNAs machen sie besonders schwierig, mit diesen Techniken zu befragen. Bisher wurden Sequenzierung-basierten Technologien der nächsten Generation nicht noch auf Karte ich6Modifikationen34genutzt.
Hier beschreiben wir einen einfachen und direkten Ansatz, ich6A tRNA Änderungen in Vitrozu erkennen. Diese Methode nutzt Inkubation von RNAs mit rekombinanten S. Cerevisiae Isopentenyl-Transferase (Mod5), gefolgt von RNase T1 Verdauung und 1-dimensionale Elektrophorese Gelanalyse zuordnen ich6A Modifikationen. Dieser Ansatz ist direkt und erfordert wenig Fachwissen zum Analysieren der Daten. Darüber hinaus ist diese Methode anpassungsfähig an andere RNA, Enzyme, einschließlich Enzyme, die das Molekulargewicht der RNA oder einer RNA Mobilität durch ein Gel kovalent ändern ändern.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

N6- Isopentenyladenosine RNA Modifikationen sind funktional vielfältig und hoch konservierte zwischen Prokaryoten und Eukaryoten. Eine der am meisten hoch konservierten N6- Isopentenyladenosine Änderungen tritt an der A37 Position in eine Teilmenge der tRNAs. Diese Änderung verbessert Übersetzung Effizienz und Genauigkeit durch die Erhöhung der Affinität der tRNA für das Ribosom. Mutation von Enzymen verantwortlich für diese Änderung in den Eukaryotes sind mit verschiedenen Krankheitszuständen, einschließlich mitochondriale Dysfunktion und Krebs in Verbindung gebracht. Daher ist es wichtig für das Verständnis der normalen und pathologischen eukaryotic Biologie, Verständnis für die Substratspezifität und biochemischen Aktivitäten dieser Enzyme. Eine Vielfalt von Methoden wurde eingesetzt, um ich6A Modifikationen zu charakterisieren. Hierin wird einen direkten Zugang zur Erkennung von Isopentenylation durch Mod5 beschrieben. Diese Methode nutzt Inkubation von RNAs mit einem rekombinanten Isopentenyl-Transferase, gefolgt von RNase T1 Verdauung und 1-dimensionale Elektrophorese Gelanalyse ich6A Änderungen zu erkennen. Darüber hinaus ist die mögliche Anpassungsfähigkeit dieses Protokolls zum anderen RNA-modifizierende Enzyme charakterisieren diskutiert.

Mod5 wurde mit einem Tyrosin inkubiert tRNA oder Serin tRNA in der Anwesenheit oder Abwesenheit von DMAPP. Im Anschluss an die Änderung Reaktion waren die RNase T1 verdaut, die bindet des 3'-Ende von allen Guanosines ein 3' Guanosin Monophosphates (GMP)24 (Abbildung 1) verlassen. Vollständige Verdauung des RNAs produziert einem vorhersagbaren Muster der radioaktiven Fragmente (Abb. 2A), ...

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Hier haben wir ein Protokoll für die biochemische Charakterisierung der Hefe RNA-modifizierende Enzym, Mod5, beschreiben und diskutieren, wie dieses Protokoll auf andere RNA-modifizierende Enzyme angewendet werden könnte.

Ein In vitro- Test zur Erkennung der tRNA-Isopentenyl-Transferase-Aktivität

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die tRNA-Isopentenyl Transferase Activity In Vitro biochemisch zu charakterisieren. Diese Methode ist nützlich für den In-vitro-Nachweis und die Charakterisierung der tRNA-isopentenyltransferase Aktivität von gereinigten rekombinanten Enzymen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es sich um einen einfachen und direkten Assay handelt, der verwendet wird, um eine kovalente RNA-Modifikation zu detektieren.Obwohl diese Methode Einblicke in die tRNA-isopentenyl transferase Aktivität bietet, ist es potenziell anpassungsfähig für die biochemische Charakterisierung von breiten Spektrum oder RNA modifizierenden Enzymen. Der erste Schritt in diesem Verfahren ist die gründliche Reinigung der Glasplatten, die zum Gießen des Gels verwendet werden. Waschen Sie die Platten mit Seife und Wasser, spülen Sie gut mit entionisiertem Wasser, und reinigen Sie dann die Platten mit Isopropanol und fusselfreien Tüchern.Als nächstes montieren Sie die Platten und Abstandshalter. Mischen Sie die folgenden Reagenzien, um ein 100 Milliliter 20%Acrylamid, 7,5 Molarenharnstoff, 1x TBE-Gel herzustellen. 80 Milliliter Harnstoffgelkonzentrat, 10 Milliliter Harnstoffgelverdünnung und 10 Milliliter Harnstoffgelpuffer.40 Mikroliter T-med und 800 Mikroliter frisch zubereitetes 10%Ammoniumpersulfat in die Mischung geben. Ziehen Sie die Gellösung in eine große Spritze und geben Sie die Gellösung zwischen den Glasplatten, die auf das Glas tippen, während Sie die Lösung ausgeben, um Blasenbildung zu verhindern. Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur 30 Minuten erstarren.Nachdem das Gel erstarrt ist, pflanzen Sie das Gel auf ein vertikales Gelgerät. Füllen Sie die oberen und unteren Pufferkammern mit 1x TBE. Zwei Stunden vor dem Laden des Gels, führen Sie das Gel mit 20 Milliampern für zwei Stunden vor, damit die Puffergrenze die kleinsten Oligonukleotide auslaufen lässt.Bereiten Sie jede Reaktion für die RNA isopentenylation Assay in einem endigen Volumen von 17 Mikrolitern vor. Fügen Sie zu jeder Tube 50 Millimolor Tris-HCl, pH 7.2, 1.2 Millimolar ATP, 5.8 Millimolar Magnesiumchlorid, 0,2 Millimolar DMAPP, 10 Einheiten RNase-Hemmer, 40, 000 CPM intern 32P beschriftet ERNA, 5,3 mikromolar Mod5 und 1,2 Millimolar 2-Mercaptoethanol. Inkubieren Sie die Reaktionen bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Nach einer Stunde fällt Ethanol die RNase mit 2,5 Volumen von 100% Ethanol und 1/10 Volumen von 3,5 Mol-Natriumacetat pH 5,5 aus und platziert sie eine Stunde lang negativ 20 Grad Celsius über Nacht. Anschließend zentrieren Sie die RNA-Proben 20 Minuten lang bei 15, 400 g und vier Grad Celsius. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und waschen Sie jedes RNA-Pellet mit 500 Mikrolitern 70%Ethanol.Zentrifugieren Sie die Proben bei 15, 400 g und vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und trocknen Sie die RNA-Pellets 15 Minuten lang an der Luft oder bis das gesamte Ethanol verdampft ist. Als nächstes wird jedes RNA-Pellet in 10 Mikrolitern von acht Molharnstoff wieder ausgesetzt.Fügen Sie 150 Einheiten RNase T1 zu jeder Probe hinzu und brüten Sie bei 37 Grad Celsius über Nacht. Am nächsten Tag zwei Mikroliter 6x Ladepuffer zu jeder Probe hinzufügen. 10 Mikroliter jeder RNA-Probe auf ein vorlaufendes, 20%Polyacrylamid, 7,5 Molharnstoffgel laden.Führen Sie das Gel mit 25 Milliampere für zwei Stunden. Nach zwei Stunden die Elektrophorese anhalten und das Gel aus dem Gerät entfernen. Brechen Sie die Dichtung zwischen den beiden Glasplatten und entfernen Sie vorsichtig eine der Glasplatten mit dem Gel auf beiden Platten verbleiben.Legen Sie eine Schicht Plastikfolie über das Gel und setzen Sie auf einem Phosphor-Bildschirm für drei Stunden. Dieses Protokoll erkennt zuverlässig die Isopentenylierung sowohl kanonischer als auch nichtkanonischer tRNA-Rückstände, die durch die S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5 modifiziert wurden. In diesem Beispiel wurde Tyrosin tRNA intern mit 32P-Adenosin beschriftet und Mod5 wurde mit RNase in Gegenwart oder Abwesenheit von DMAPP inkubiert.Die RNAs wurden mit RNase T1 verdaut und auf einem denaturierenden Polyacrylamid-Gel aufgelöst. Mod5 modifiziert den vorhergesagten Rückstand in Gegenwart von DMAPP und wird durch das verschobene 10 Nukleotid angezeigt, dreifaches Adenosin, das Fragment an Nukleosidpositionen 36 bis 38 enthält, das Fragment in der Tyrosin-tRNA enthält. Das modifizierte Adenosin 37 befindet sich mit einem Sternchen angegeben.In ähnlicher Weise, wenn die serine tRNA mit Mod5 und DMAPP inkubiert wird, wird eine vollständige Verschiebung der 10 Nukleotid-Dreifachadenosin beobachtet, die Fragment an Nukleosidposition 36 bis 38 enthält. Interessanterweise wird eine partielle Verschiebung eines sieben Nukleotidfragments beobachtet, das das dreifache Adenosin enthält, das Fragment an Nukleosidpositionen 36 bis 38 enthält, was darauf hindeutet, dass das dreifache Adenosin, das Fragment an Nukleosidposition 36 bis 38 Sequenz und Struktur enthält, für Mod5 in vitro aktivität möglicherweise nicht erforderlich ist. Einmal gemeistert wird diese Technik dauert zwei, vier bis sechs Stunden Tage, wenn es richtig durchgeführt wird.Nun, wenn man dieses Verfahren versucht, ist es wichtig, sich daran zu erinnern, die Integrität der RNA zu erhalten und zu überwachen, da der RNA-Abbau die RNA-Modifikation beeinträchtigen und die Dateninterpretation verwirren könnte. Nach diesem Verfahren könnten Mutationsstudien mit Ihrem Enzym von Interesse durchgeführt werden, um spezifische Rückstände oder Domänen zu bestimmen, die für die enzymatische Aktivität erforderlich sind. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der RNA-Biologie, um zu sagen, tRNA-isopentenyl transferase Aktivitäten von prokaryotischen und eukaryotischen Enzymen.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Protokoll zum Nachweis der Isopentenyltransferase-Aktivität Ihres Enzyms von Interesse durchführen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität extrem gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen einer richtigen PSA, die Verwendung einer angemessenen Abschirmung und die ordnungsgemäße Entsorgung von Radioaktivität sollten immer während der Durchführung dieses Verfahrens getroffen werden.

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