Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

ברצוננו להודות ד ר דוד Engelke שלו הדרכה והערות מועילות על כתב היד הזה. פיג'מה - אוניברסיטת המדינה של הכדור מעבדה הפעלה כספים; כי אמחה קלות - להעניק 1R15AI130950-01.

הערה: הפרוטוקול הותאם מ הפניה למעורר 24.
1. לקבל RNA ואנזים עניין
<ol><li>השתמש במבחנה עיבד RNAs פנימי עם התווית עם 32P, His6 רקומביננטי-Mod5 לידי ביטוי וטיהרו מ- e. coli, כפי שתואר לעיל24.<ol>
<li>להציג במבחנה עיבד RNAs (סעיף 3) באמצעות T7 RNA פולימראז בנוכ?...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions.">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li><li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+modification+of+transfer+RNA.">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li><li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA.">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li><li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA.">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li><li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications.">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li><li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation.">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li><li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA.">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li><li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+MOD5,+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li><li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria.">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li><li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li><li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells.">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li><li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase.">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li><li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+(TRIT1)+gene.">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li><li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA.">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).</li><li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer.">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li><li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor.">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li><li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3'+untranslated+region+of+TRIT1.">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).</li><li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information.">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1,+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population.">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer.">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients'+survival.">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li><li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing.">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li><li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tRNA-modifying+protein,+TRIT1,+forms+amyloid+fibers+in+vitro.">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li><li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+prion,+Mod5,+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress.">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li><li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases.">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+tRNA+modification+isopentenyl-A37+alters+mRNA+decoding+and+causes+metabolic+deficiencies+in+fission+yeast.">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li><li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li><li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence.">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes.">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li><li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li><li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+modification+landscape+in+human+disease.">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+N(1)-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA.">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3'+UTRs+and+near+stop+codons.">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA.">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+reveals+a+conserved,+widespread,+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis.">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li><li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA.">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs.">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li></ol>

שינויים RNA להמשיך להציג את ממלאים תפקידים מגוונים וחשובים יותר בתפקוד הסלולר, organismal. ככזה, הפיתוח של מבחני לחקור RNA שינוי אנזימים הוא מרכזי כדי להבין טוב יותר את ההיבטים הבסיסיים של הביולוגיה. פרוטוקול זה מתאר assay ברזולוציה גבוהה במבחנה כדי לאפיין את פעילות שינוי tRNA Mod5.
?...

163. לפחות שינויים ברורים posttranscriptional RNA זוהו, עם שינויים אלה היוועצות פונקציות מגוונות and תלויי-ההקשר RNAs ישירות המשפיעים על מבנה רנ א, המשפיעים על האינטראקציות של RNA עם השני מולקולות1,2. הערכה ממגוון גדול של RNA שינויים גודלת, חיוני לפתח מבחני זה שניתן לחקור בצורה אמינה את השינויים RNA והן האנזימים לעודד אותם.
אחד השינויים RNA הראשון להיות מזוהה מתרחשת 37 בסיס ב- tRNAs, סמוך codon אנטי-3' צד3,4. קבוצת isopentenyl של dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) מועבר המיקום N6 של אדנוזין 37 (אני6A37) 3,5 ב תת-קבוצה של tRNAs cytoplasmic והן מיטוכונדריאלי. אני6A37 משפר את דיוק התרגום ועל יעילות על ידי הגדלת אהדה של tRNA ריבוזום4,6 ו אני6A37 חשוב לתגובת הלחץ בחיידקים7. האנזימים לבצע שינוי זה מכונים tRNA isopentenyl transferases, מאוד נשמרים חיידקים8,9, פטריות10, תולעים11, צמחים12ו גבוה פרוקריוטים13 , כולל בני14.
מוטציות בגן האנושי tRNA isopentenyl טרנספראז, TRIT1, קשורים עם מחלות אנושיות. לדוגמה, מוטציה בגן TRIT1 הוא מתואם עם מחלה מיטוכונדרית קשה, ככל הנראה נגרם על-ידי פגם חלבון מיטוכונדריאלי סינתזה15,16. יתר על כן, TRIT1 מתוארת כ הגידול משתיק קול ג'ין17,18 , הייתה שם מספר סוגי סרטן כולל מלנומה19, השד20, קיבה21וסרטן ריאות22 ,23. לבסוף, TRIT1, Mod5 transferases isopentenyl (האפייה) הם חלבונים צבירת נוטה היוצרים סיבי עמילואיד פריון דמוי24,25,26. תצפיות אלה שעלולים לסבך tRNA transferases isopentenyl מחלות ניווניות, למרות עדות ישירה לכך עדיין לא הוכח.
בהתחשב בתפקיד isopentenyl transferases לשחק ב תרגום ומחלות, שיטות ישירות למדוד לי6פעילות isopentenyl טרנספראז חשובות להבנה מכניסטית של אנזימים תחת נורמלי ועם מצבי מחלה אלה. מספר גדל והולך של שיטות זמינות לזהות אני6א RNA שינויים, כולל במבחנה isopentenylation מבחני, הכלאה חיובי בהעדר אני6מבחני (PHA6), דק שכבה כרומטוגרפיה (TLC), חומצת אמינו מבחני קבלה פעילות, גישות ספקטרומטר מסה (אירוע של יום שלם הפניה למעורר 4).
וזמינותו isopentenylation במבחנה תואר אשר מנצל 14C-DMAPP ו- tRNAs ללא תווית. ב הזה assay, פחמן רדיואקטיבי מועבר RNA מ 14C-DMAPP על ידי טרנספראז isopentenyl. בעוד assay זו היא רגישה מאוד, לעתים קרובות קשה לקבוע שאריות ספציפי זה שונה9,20,27. מבחני PHA6 להסתמך על מגושם אני6א שינוי המפריעים הכלאה של 32התווית על-ידי P החללית פורש את שאריות ששונה. ככזה, הכלאה גדול בהיעדר תמונה628,18,שינוי29. מבחני PHA6 הם רגישים, יכולת ניתוח הכולל RNA מופק lysates הסלולר. בנוסף, היכולת לעצב הגששים ספציפי הרנ א עניין נותן גמישות יעד משמעותי בשיטה זו. עם זאת, מבחני PHA6 מוגבלות אפיון שינויים העשויים להתרחש על שאריות בתוך אזור ממוקד של המכשיר, ולכן סביר פחות לזהות שינוי הרומן אתרים. בנוסף, כמו היעדר איגוד מעידה על השינוי, שינויים או מוטציות המשפיעות על ה-RNA מחייב אחרים וחיסול ניתוח נתונים.
גישה אחרת משלב בנזיל DEAE תאית (BD) תאית כרומטוגרפיה עם חומצת אמינו פעילות קבלה כמו readout אני6א שינויים ב- tRNA30. גישה זו assays ישירות את הפונקציה של i השינוי6א, אבל זה היא גישה עקיפה כדי לזהות אני6א שינוי ושל חסר רזולוציה למפות שינויים משקע ספציפי ב- RNA. בגישה TLC שימש כדי לזהות tRNA סה כ אני6א שינויים. בגישה זו, באופן פנימי 32tRNAs התווית על-ידי P מתעכלים כדי נוקלאוטידים בודדים, ניתוח TLC מימדי משמש לזיהוי isopentenylation. גישה זו היא רגישה מאוד באיתור סה כ אני6א במדגם RNA נתון אבל על העיכול, כל רצף מידע אובד; לפיכך, החוקר אין שום דרך לקבוע אילו שאריות היה שונה31.
לאחרונה, ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS) פותחו שיטות המשווים באופן כמותי הכולל שינויים RNA בין המינים, סוגי תאים תנאים ניסיוני32,33, 34. מגבלה של מתודולוגיה זו הוא כי הוא פחות מסוגל לקבוע זהותו ואת מיקום בתוך RNA שממנו היה nucleoside ששונה נגזר34. יתר על כן, הידע, הציוד הנדרש לביצוע ניסויים אלה מגבילות את המעשיות של גישה זו.
בנוסף, פותחו מספר טכנולוגיות הדור הבא רצפי למפות RNA שינויים transcriptome ברוחב34. Immunoprecipitation של RNAs עם נוגדנים ספציפיים שינוי מסוים (RIP-Seq) מאפשרים החוקר לזהות כל רצפי המכילה35,שינוי מסוים36. בנוסף, גישות רוורס טרנסקריפטאז כגון כימיה-Seq ורצף אי-התאמה שאינן אקראיות להסתמך על לפליטת התגובה שעתוק במהופך38,37,שאריות ששונה39. למרות היתרון של טכניקות אלה כדי למפות RNA שינויים transcriptome רחב, RIP-seq וטכנולוגיות כימית-Seq מוגבלים על ידי חוסר של נוגדנים אמין או זמין עבור כל שינוי מסוים, בהתאמה34תגובתי כימיקלים. יתר על כן, רוורס טרנסקריפטאז אנזימים הדרושים לביצוע כימית-Seq, אי התאמה שאינן אקראיות רצף טכניקות יכול להיות מובן מבנים RNA יציבה. הטבע ששונה מאוד ויציב מבחינה מבנית של tRNAs תגרום להם קשה במיוחד לחקור שיטות אלה. עד כה, טכנולוגיות מבוססות-רצף של הדור הבא שלא טרם נוצלו למפות אני6שינויים34.
במסמך זה, אנו מתארים גישה פשוטה וישירה כדי לזהות אני6א tRNA שינויים בתוך חוץ גופית. שיטה זו משתמשת דגירה של RNAs עם רקומביננטי cerevisiae ס isopentenyl טרנספראז (Mod5), ואחריו RNase T1 לעיכול, חד-מימדי ג'ל אלקטרופורזה ניתוח כדי למפות אני6א שינויים. גישה זו הוא ישיר ואינה דורשת מומחיות ייחודית קצת כדי לנתח את הנתונים. יתר על כן, שיטה זו ניתנת להתאמה אחרים RNA שינוי אנזימים, כולל אנזימים covalently לשנות את המשקל המולקולרי של RNA או הניידות של RNA באמצעות ג'ל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

N6- isopentenyladenosine RNA שינויים הינם מגוונים באופן פונקציונלי מאוד שנשמרת בין אאוקריוטים פרוקריוטים. אחד השינויים שנשמרת ביותר של - isopentenyladenosine6N מתרחשת במיקום A37 בקבוצת משנה של tRNAs. שינוי זה משפר את יעילות התרגום ונאמנות על ידי הגדלת את הקרבה של tRNA הריבוזום. מוטציה של אנזימים האחראים את השינוי בפרוקריוטים משויכות מספר מצבי מחלה, כולל תפקוד מיטוכונדריאלי וסרטן. לכן, הבנת את המצע ירידה לפרטים ופעילויות הביוכימי של אנזימים אלה חשוב להבנה של ביולוגיה האיקריוטים נורמלי, פיפטות. כבר מועסקים מערך מגוון של שיטות לאפיון אני6א שינויים. בזאת הוא תיאר גישה ישירה של איתור isopentenylation על ידי Mod5. שיטה זו משתמשת דגירה של RNAs עם טרנספראז isopentenyl רקומביננטי, ואחריו RNase T1 עיכול, וניתוח חד-מימדי ג'ל אלקטרופורזה לזהות אני6א שינויים. בנוסף, נדון על הסתגלות פוטנציאלי של הפרוטוקול לאפיין אנזימים אחרים שינוי RNA.

Mod5, נדגרה עם טירוזין tRNA או סרין tRNA, נוכחות או היעדרות של DMAPP. בעקבות התגובה השינוי, מוצרים היית RNase T1-מעוכלים, אשר cleaves 3' סוף כל guanosines עוזב בגודל 3' guanosine monophosphates (GMP)24 (איור 1). עיכול מלא של RNAs מפיק דפוס צפוי של שברי radiolabeled (איור 2א<...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול עבור האפיון הביוכימי של שמרים שינוי RNA האנזים, Mod5, ונדון כיצד פרוטוקול זה יכול לחול על אנזימים אחרים שינוי RNA.

Assay ב Vitro לגילוי פעילות טרנספראז tRNA-Isopentenyl

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לאפיין ביוכימית tRNA-Isopentenyl Transferase פעילות במבחנה. שיטה זו שימושית עבור זיהוי ואפיון במבחנה של פעילות tRNA-isopentenyl transferase של אנזימים רקומביננטיים מטוהרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזה חקירה פשוטה וישירה המשמשת לגילוי שינוי RNA קווולנטי.למרות שיטה זו מספקת תובנה לפעילות tRNA-isopentenyl transferase, זה פוטנציאל הסתגלות לאפיון ביוכימי של מגוון רחב או RNA שינוי אנזימים. הצעד הראשון בהליך זה הוא לנקות ביסודיות את צלחות הזכוכית שישמשו ליציקת הג'ל. לשטוף את הצלחות עם מים וסבון, לשטוף היטב עם מים deionized, ולאחר מכן לנקות את הצלחות עם isopropanol ומגבונים ללא מוך.לאחר מכן, להרכיב את הצלחות ואת הרווחים. מערבבים את הבאים reagents לעשות 100 מיליליטר 20%אקרילאמיד, 7.5 אוריאה טוחנת, 1x ג'ל TBE. 80 מיליליטר של תרכיז ג'ל אוריאה, 10 מיליליטר של דילואנט ג'ל אוריאה, ו -10 מיליליטר של חיץ ג'ל אוריאה.הוסיפו לתערובת 40 מיקרוליטרים של T-med ו-800 מיקרוליטרים של 10%אמוניום. משוך את פתרון הג'ל למזרק גדול וחלוק את ת פתרון הג'ל בין צלחות הזכוכית הקשה על הזכוכית תוך חלוקת הפתרון למניעת היווצרות בועה. אפשרו לג'ל להתגבש בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.לאחר הג'ל התגבש, לשתול את הג'ל על מנגנון ג'ל אנכי. מלא את תאי המאגר העליונים והתחתון ב- TBE אחד. שעתיים לפני טעינת הג'ל, יש להפעיל מראש את הג'ל ב-20 מיליאמפר למשך שעתיים כדי לאפשר לגבול החיץ לצאת ולהפעיל את האויגונוקלאוטידים הקטנים ביותר.הכינו כל תגובה למבחן isopentenylation RNA בנפח סופי של 17 מיקרוליטרים. הוסף לכל צינור 50 מילימול טריס-HCl, pH 7.2, 1.2 מילימולאר ATP, 5.8 מילימולר מגנזיום כלוריד, 0.2 מילימולאר DMAPP, 10 יחידות מעכב RNase, 40, 000 CPM פנימי 32P שכותרתו RNA, 5.3 מיקרומולרי Mod5, ו 1.2 מילימולר 2-mercapetol. דגירה התגובות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר שעה אחת, אתנול לזרז את RNase באמצעות 2.5 נפח של 100%אתנול ו 1/10 נפח של 3.5 נתרן טוחן אצטט pH 5.5, ומניחים אותו שלילי 20 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת בלילה. לאחר מכן, צנטריפוגה דגימות RNA ב 15, 400 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. בזהירות להסיר את supernatant ולשטוף כל גלולת RNA עם 500 microliters של 70% אתנול.צנטריפוגה הדגימות ב15, 400 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. בזהירות להסיר את supernatant ואוויר לייבש את כדורי RNA במשך 15 דקות או עד שכל אתנול התאדה. הבא להשעות מחדש כל גלולת RNA ב 10 microliters של שמונה אוריאה טוחנת.הוסיפו 150 יחידות של RNase T1 לכל דגימה ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס במהלך הלילה. ביום שלמחרת, הוסף שני מיקרוליטרים של מאגר טעינה פי 6 לכל דגימה. טען 10 מיקרוליטרים של כל דגימת RNA על ג'ל אוריאה טרום ריצה, 20% פוליאקרילמיד, 7.5 ג'ל אוריאה טוחן.תריץ את הג'ל ב-25 מיליאמפר למשך שעתיים. לאחר שעתיים, להפסיק את האלקטרופורזה ולהסיר את הג'ל מן המנגנון. שוברים את החותם בין שתי צלחות הזכוכית ומסירים בזהירות את אחת מצלחות הזכוכית עם הג'ל שנותר על כל אחת מהצלחות.מניחים שכבה של ניילון נצמד מעל הג'ל וחושפים על מסך זרחן במשך שלוש שעות. פרוטוקול זה מזהה באופן אמין isopentenylation של שאריות tRNA קנוניות ולא קאנוניות ששונו על ידי S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. בדוגמה זו טירוסין tRNA היה מסומן באופן פנימי עם 32P-אדנוסין ו Mod5 היה דגירה עם RNase בנוכחות או היעדר DMAPP.RNAs מתעכלים עם RNase T1 ונפתרו על ג'ל פוליאקרילמיד denaturing. Mod5 משנה את השאריות החזויות בנוכחות DMAPP ומצוין על ידי 10 נוקלאוטיד שהוזז, אדנוסין משולש המכיל שבר בעמדות נוקליאוסיד 36 עד 38 מכילים שבר בטירוסין tRNA. Adenosine שונה 37 מתגורר מצוין עם כוכבית.באופן דומה כאשר tRNA סרין הוא דגירה עם Mod5 ו DMAPP, משמרת מלאה של 10 אדנוסין משולש נוקלאוטיד המכיל שבר בעמדת נוקליאוסייד 36 עד 38 הוא ציין. מעניין, תזוזה חלקית של שבר נוקלאוטיד שבע הוא ציין כי אינו מכיל את אדנוזין משולש המכיל שבר בעמדות nucleoside 36 עד 38, מה שמרמז כי אדנוסין משולש המכיל שבר במיקום nucleoside 36 עד 38 רצף ומבנה לא יכול להידרש עבור Mod5 פעילות במבחנה. לאחר השליטה בטכניקה זו ייקח שעתיים, ארבע עד שש שעות ימים אם היא מבוצעת כראוי.ובכן מנסה הליך זה חשוב לזכור לשמור ולפקח על השלמות של RNA, כי השפלה RNA יכול להשפיע על שינוי RNA יהיה לבלבל פרשנות נתונים. בעקבות הליך זה מחקרים מוטציה באמצעות האנזים שלך של עניין, ניתן לעשות כדי לקבוע שאריות ספציפיות או תחומים הדרושים לפעילות אנזימטית. לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הביולוגיה של RNA, לומר פעילויות tRNA-isopentenyl transferase של אנזימים פרוקריוטיים ואיקריוטיים.לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך לבצע את הפרוטוקול לגילוי של פעילות isopentenyl transferase של האנזים שלך של עניין. אל תשכח כי עבודה עם רדיואקטיביות יכול להיות מסוכן מאוד אמצעי זהירות כגון לבישת PPE תקין, באמצעות מיגון נאות, סילוק רדיואקטיביות כראוי תמיד צריך להילקח בעת ביצוע הליך זה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

איתור של הפעילות תלויה pH של<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Assay מבוסס-הקרינה של פעילות פוספוליפידים Scramblase

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

כימות של היפופיגמנטציה הפעילות במבחנה

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

מטריקה שיטת הצביעה של פעילות ציטראט סינתאז בדרוזופילה מלאנוסטר

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

מבחני הדמיה של מולקולות בודדות במבחנה לניתוח קינטיקה של תרגום תלוי-כובע

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: שיטה פלואורסצנטית מהירה ובלתי משוחדת לזיהוי שינויים בצפיפות הסינפסה

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...