Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
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우리는 그의 지도 및 유용한 의견이이 원고에 대 한 박사 데이비드 Engelke 감사 하 고 싶습니다. 잠 옷-공 주립 대학 실험실 시작 자금; 소량-1R15AI130950-01을 부여.

참고: 프로토콜 참고. 24에서 적응 시켰다.
1. RNA와 관심의 효소를 얻을
<ol><li>사용에서 생체 외에서 복사할 RNAs 내부적으로 32P, 표시 된 재조합 His6-Mod5 표현 하 고 대장균, 앞에서 설명한24에서 정화.<ol>
<li>소개 생체 외에서 복사할 RNAs (제 3) 레이블이 ATP, UTP, CTP, GTP와 젤 정화, 에탄올 침전 α-ATP의 10 µCi의 T7 RNA 중...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. 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RNA 수정 계속 세포질 organismal 기능에 더 중요 하 고 다양 한 역할을 표시 합니다. 따라서, 수정 효소 RNA가 분석의 개발 생물학의 기본적인 측면을 이해 하는 더 나은 중심입니다. 이 프로토콜에는 고해상도 생체 외에서 분석 결과를 Mod5의 tRNA 수정 활동의 특성을 설명 합니다.
이 프로토콜 제공 하는 isopentenylation의 직접적인, 그리고 쉽게 해석할 판독의 뚜렷한 장점이 있?...

적어도 163 가지 posttranscriptional RNA 수정 확인 되었습니다, RNAs에 맞는 다양 한 기능을 부여, 직접 영향을 미치는 RNA 구조, 및 다른 RNA의 상호 작용에 영향을 미치는 이러한 수정 분자1,2. 수와 다양 한 RNA 수정에 대 한 감사는 증가, 그것은 안정적으로 RNA 수정 및 그들을 촉매 하는 효소를 심문 수 분석 실험 개발에 중요 한.
발견 될 첫번째 RNA 수정 중 기본 37 tRNAs, 3' 사이드3,4안티 codon에 인접 한에서 발생 합니다. Isopentenyl 그룹 dimethylallylpyrophosphate (DMAPP)에서 아데노신 37의 N6 위치 전송 됩니다 (난6A37) 세포질 및 미토 콘 드리 아 tRNAs의 하위 집합에 3,5 . 난6A37 번역 충실도 향상과6리보솜4,6 , tRNA의 선호도 증가 시켜 효율성 A37 박테리아7스트레스 반응에 대 한 중요 하다. 이 수정 수행 하는 효소 tRNA isopentenyl transferases 불린다 고 높은 박테리아8,9, 버섯10, 벌레11, 식물12및 높은 진핵생물13 보존 됩니다. , 인간14를 포함 하 여.
돌연변이 인간 tRNA의 isopentenyl 전이 효소 유전자, TRIT1에서 인간의 질병과 연결 되어 있습니다. 예를 들어 TRIT1 에 돌연변이 가능성이 미토 콘 드리 아 단백질 합성15,16결함으로 인 한 심각한 미토 콘 드 리아 질병으로 상관 된다. 또한, TRIT1 는 종양 억제기 유전자17,18 으로 설명 하고있다 고 암 흑색 종19, 유 방20, 위21, 폐 암22 등의 여러 종류에 연루 ,23. 마지막으로, TRIT1 및 Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferases 집계 경향이 단백질 프리온 같은 녹말 체 섬유24,,2526를 형성 하는. 이 관측은 잠재적으로 있지만이 대 한 직접적인 증거는 아직 표시 되지 tRNA isopentenyl transferases 신경 퇴행 성 질환에 연루.
Isopentenyl transferases 번역 및 질병, 직접 내가6측정 방법에서 isopentenyl 전이 효소 활동 재생 역할을 감안할 때 이러한 정상에서 효소와 질병 상태에 대 한 기계적 이해에 대 한 중요 하다. 방법의 증가 나6A RNA 수정, 포함 한 생체 외에서 isopentenylation 분석 실험, 긍정적인 교 잡 검출을 사용할 수 있습니다 나의 부재에6(PHA6) 분석 실험, 얇은 층 크로마토그래피 (TLC), 아미노산 수용 활동 분석 실험, 그리고 질량 분석 접근 (참고 4검토 됨).
생체 외에서 isopentenylation 분석 결과 활용 14C DMAPP 및 레이블이 tRNAs 설명 하고있다. 이 분석 결과에서 방사성 탄소 isopentenyl 전이 효소에 의해 14C DMAPP에서에서 RNA를 전송 됩니다. 이 분석 결과 매우 중요 한, 그것은 종종 특정 잔류물은9,,2027수정 확인 어렵다. PHA6 분석 실험에 의존 하는 부피 나6A 수정 수정 된 잔류물에 걸친 32P 표시 된 프로브의 교 잡에 방해가. 이와 같이, 교 잡 이다 i의 부재에서 더 큰6수정18,,2829. PHA6 분석 실험 매우 민감하고 세포 lysates에서 추출한 총 RNA를 분석 할 수 있습니다. 또한, 프로브 특정 관심의 RNA 설계 하는 능력이 방법은 상당한 대상 유연성을 제공 합니다. 그러나, PHA6 분석 실험의 수정 따라서 소설 수정 사이트를 식별 하는 조사의 대상된 지역 내에서 잔류물에 발생 하는 특성으로 제한 됩니다. 또한,로 바인딩의 부재는 수정, 다른 수정 또는 RNA 바인딩에 영향을 주는 돌연변이 데이터 분석을 혼동 됩니다.
또 다른 방법은 결합 벤 DEAE 셀 루 로스 (BD) 셀 루 로스 크로마토그래피 아미노산 수용 활동의 판독으로 tRNA306A 수정 합니다. 이 방법은 직접 기능을 분석 실험 i의6A 수정, 하지만 난6A 수정 감지 하는 간접 접근 이며 매핑하는 RNA에서 특정 잔류물에 수정 해상도 결여. TLC 접근 총 tRNA를 감지 하는 데 사용 되었습니다 내가6A 수정. 이 방법에서는, 내부적으로 32P 라는 tRNAs 단일 뉴클레오티드를 소화 하 고 2 차원 TLC 분석은 isopentenylation를 식별 하는 데 사용 됩니다. 이 방식은 매우 민감한 탐지에 나에 게 주어진 RNA 샘플에서6A 총 이지만, 소화 시 모든 시퀀스 정보 손실; 따라서, 조사는 잔류물 수정된31되었습니다 결정의 방법이 있다.
더 최근에, 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석 (LC-MS/MS) 방법은 개발 되었다 종, 세포 유형, 및 실험 조건32,33, 사이 총 RNA 수정 양적 비교 하 34. 이 방법론의 한계 덜 id와 위치를 수정된 nucleoside 했다 RNA 내에서 파생 된34확인할 수입니다. 또한, 전문성 및 장비 이러한 실험을 실행 하는 데 필요한이 방법의 실용성을 제한 합니다.
또한, 여러 가지 차세대 시퀀싱 기술은 매핑할 RNA 수정 transcriptome 전반34개발 되었습니다. 특정 수정 (RIP-Seq) 특정 항 체와 RNAs의 Immunoprecipitation 사용 특정 수정35,36를 포함 하는 모든 시퀀스를 식별 하는 탐정. 또한, 화학-Seq 등 비 무작위 불일치 시퀀싱 역전사-기반 접근 수정된 잔류물37,,3839에서 반전 녹음 방송 반응의 물결에 의존합니다. RNA 수정 transcriptome-넓은 지도를 이러한 기술의 장점에도 불구 하 고 RIP seq 시퀀스 (Seq) 화학 기술과 신뢰할 수 있는 항 체 또는 각 특정 수정, 각각34에 사용할 수 있는 반응 화학 물질의 부족에 의해 제한 됩니다. 또한, 역전사 효소 화학-Seq를 수행 하는 데 필요한 및 비-무작위 불일치 시퀀싱 기술을 안정 RNA 구조에 의해 장애가 수 있습니다. 높은 수정 하 고 구조적으로 안정적인 성격의 tRNAs 어려워질 그들 특히 이러한 기술을 사용 하 여가. 날짜 하려면, 다음-세대 시퀀싱 기반 기술은 하지 아직 이용 되어6수정34나을 지도.
여기, 내가6A tRNA 수정 체 외검출 하는 간단 하 고 직접적인 접근 방식을 설명 합니다. 이 방법은 RNAs 재조합 S. cerevisiae isopentenyl 전이 효소 (Mod5)와 RNase T1 소화 및 1 차원 젤 전기 이동 법 분석 나6A 수정 지도 하의 외피를 활용 합니다. 이 방법은 직접 이며 데이터를 분석 하는 작은 특수 전문 지식이 필요로. 또한,이 메서드는 다른 RNA 효소, RNA 또는 젤 통해 RNA의 이동성의 분자량 covalently 변경 효소를 포함 하 여 수정에.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

N6-isopentenyladenosine RNA 수정 기능 다양 하 고 높은 원핵생물과 진핵생물 사이에서 보존 있습니다. 가장 높은 보존된 N6-isopentenyladenosine 수정 중 tRNAs의 하위 집합에서 A37 위치에서 발생합니다. 이 수정 리보솜에는 tRNA의 선호도 증가 시켜 번역 효율성과 충실도 향상 시킵니다. 효소는 진핵생물에서이 수정에 대 한 책임의 돌연변이 미토 콘 드 리아 기능 장애, 암 등 여러 질병 상태와 연결 됩니다. 따라서, 기질 특이성 및 이러한 효소의 생 화 확 적인 활동 이해 정상과 pathologic 진 핵 생물의 이해를 위해 중요 하다. 방법의 다양 한 배열은6A 수정 난을 특성화 하기 위해 고용 되었다. 여기는 isopentenylation Mod5에 의해의 검출에 대 한 직접적인 접근을 설명. 이 방법은 재조합 isopentenyl 전이 효소, RNase T1 소화 및6A 수정 난을 검출 하기 위하여 1 차원 젤 전기 이동 법 분석 가진 RNAs의 외피를 사용 합니다. 또한, 잠재적인 적응성이의이 정서의 다른 RNA 수정 효소의 특성을 설명 합니다.

Mod5는 티로신과 알을 품는 tRNA 또는 떠들고 DMAPP의 유무에 tRNA. 수정 반응에 따라 제품 있었다 RNase T1 소화는 앞 3' guanosine monophosphates (GMP)24 (그림 1)을 떠나 모든 guanosines의 3' 끝. 전체 소화는 RNAs의 방사선된 파편 (그림 2A), 다음 20 %polyacrylamide 젤을 변성 시키기에 해결의 예측 가능한 패턴을 생성 합?...

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

우리가 효 모 RNA 수정 효소, Mod5, 생 화 확 적인 특성에 대 한 프로토콜을 설명 하는 여기,이 프로토콜 다른 RNA 수정 효소 적용할 수 토론.

TRNA Isopentenyl 전이 효소 활동을 감지 하는 체 외에서 분석 결과

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 생체 외에서 tRNA-Isopentenyl Transferase 활동을 생화학적으로 특성화하는 것입니다. 이 방법은 정제된 재조합 효소의 tRNA-isopentenyl 전달 활성의 체외 검출 및 특성화에 유용하다. 이 기술의 주요 장점은 공유 RNA 수정을 검출하는 데 사용되는 간단하고 직접적인 분석이라는 것입니다.이 방법은 tRNA-isopentenyl 전달 효소 활동에 대한 통찰력을 제공하지만, 넓은 범위 또는 RNA 변형 효소의 생화학적 특성화에 잠재적으로 적응할 수 있습니다. 이 절차의 첫 번째 단계는 젤을 주조하는 데 사용되는 유리 판을 철저히 청소하는 것입니다. 접시를 비누와 물로 씻고, 탈이온화된 물로 잘 헹구고, 이소프로파놀과 보풀이 없는 물티슈로 접시를 청소합니다.다음으로 플레이트와 스페이서를 조립합니다. 다음 시약을 섞어 100 밀리리터 20% 아크릴아미드, 7.5 어어 우레아, 1x TBE 젤을 만듭니다. 우레아 젤 농축액 80밀리리터, 우레아 젤 희석제 10밀리리터, 10밀리리터의 우레아 젤 버퍼.T-med 40 마이크로리터와 800 마이크로리터를 새로 준비한 10% 암모늄 과황을 혼합물에 넣습니다. 겔 용액을 큰 주사기로 끌어올려 유리를 두드리는 유리 판 사이에 젤 용액을 분배하면서 거품 형성을 방지하기 위한 용액을 분배합니다. 젤이 실온에서 30분 동안 고화되도록 합니다.젤이 고화된 후, 젤을 수직 젤 장치에 심습니다. 상부 및 하부 버퍼 챔버를 1x TBE로 채웁니다. 젤을 적재하기 2시간 전에, 완충 경계가 가장 작은 올리고뉴클레오티드를 실행할 수 있도록 2시간 동안 20 밀리암페어에서 젤을 미리 실행한다.RNA에 대한 각 반응을 17 마이크로리터의 최종 부피에서 opentenylation 분석체로 준비한다. 각 튜브 50 밀리몰러 트리스-HCl, pH 7.2, 1.2 밀리몰러 ATP, 염화 마그네슘 5.8개, 밀라 디엠앱 0.2개, RNase 억제제 10개, CPM 내부 32P, 5.3 마이크로모라 Mod5, 1.2.메르아갈라 에 추가 1 시간 동안 섭씨 37도에서 반응을 배양하십시오.1시간 후, 에탄올은 100%에탄올의 2.5부부와 1/10부로 1/10부로 1시간 동안 20도를 침전시키고, 하룻밤 사이에 마이너스 20도를 배치한다. 다음으로 RNA 샘플을 15, 400g, 섭씨 4도에서 20분 동안 원심분리합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 70 %의 마이크로 리터 500 마이크로 리터로 각 RNA 펠릿을 세척하십시오.샘플을 15, 400g, 섭씨 4도에서 5분간 원심분리합니다. 상체를 조심스럽게 제거하고 RNA 펠릿을 15분 동안 또는 모든 에탄올이 증발할 때까지 건조시다. 다음으로 8개의 어금니 우레아의 10마이크로리터에서 각 RNA 펠릿을 다시 중단한다.각 샘플에 150 단위의 RNase T1을 추가하고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오. 다음 날 각 샘플에 6x 로딩 버퍼의 마이크로리터 2개를 추가합니다. 사전 실행, 20% 폴리 아크릴라미드, 7.5 어어 우레아 젤에 각 RNA 샘플의 10 마이크로리터를 로드합니다.젤을 25 밀리암페어에서 2시간 동안 실행합니다. 2 시간 후, 전기 전도를 중지하고 장치에서 젤을 제거합니다. 두 유리 판 사이에 씰을 부수고 어느 접시에 젤이 남아 있는 유리 판 중 하나를 조심스럽게 제거합니다.젤 위에 플라스틱 랩을 놓고 인 스크린에 3시간 동안 노출합니다. 이 프로토콜은 S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5에 의해 수정된 정식 및 비관적 tRNA 잔류물의 개방성을 안정적으로 감지합니다. 이 예에서 티로신 tRNA는 내부적으로 32P-아데노신으로 표시되었고 Mod5는 DMAPP의 존재 또는 부재에서 RNase로 배양되었다.RNA는 RNase T1로 소화되었고, 탈질 폴리아크릴아미드 젤로 해결되었습니다. Mod5는 DMAPP의 존재에서 예측된 잔류물을 수정하고, 뉴클레오시드 위치에서 단편을 포함하는 10개의 뉴클레오티드, 삼중 아데노신이 티로신 tRNA에서 단편을 함유하고 있다. 수정된 아데노신(37)은 별표로 표시됩니다.유사하게 세린 tRNA가 Mod5 및 DMAPP로 배양될 때, 뉴클레오시드 위치에서 단편을 포함하는 10개의 뉴클레오티드 삼중 아데노신의 완전한 변화가 관찰된다 36~38. 흥미롭게도, 뉴클레오시드 위치(36~38)에서 단편을 함유하는 삼중 아데노신을 포함하지 않는 7개의 뉴클레오티드 단편의 부분적 변화는 뉴클레오시드 위치에서 단편을 포함하는 삼중 아데노신이 36~38개의 서열 및 구조가 Mod5 체외 활성에 필요하지 않을 수 있음을 시사한다. 이 기술을 익히면 제대로 수행되면 2일 에서 4~6시간이 소요됩니다.RNA 분해가 RNA 수정에 영향을 미치고 데이터 해석을 혼동할 수 있기 때문에 이 절차를 잘 시도하는 것은 RNA의 무결성을 유지하고 모니터링하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 관심있는 효소를 사용하여이 절차 돌연변이 연구에 따라 효소 활동에 필요한 특정 잔류물 또는 도메인을 결정하기 위해 수행 할 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 RNA 생물학 분야의 연구자들이 장핵 효소와 진핵 효소의 tRNA-isopentenyl 전달 활동을 말하는 길을 열었습니다.이 비디오를 시청한 후에는 관심 있는 효소의 isopentenyl transferase 활동을 감지하기 위한 프로토콜을 수행하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다. 방사능으로 작업하는 것은 매우 위험할 수 있으며 적절한 PPE 착용, 적절한 차폐 사용 및 방사능 폐기와 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

연구

생화학

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

인지질 Scramblase 활동의 형광 기반의 분석

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

생체 외에서 Hypopigmentation 활동의 정량화

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

초파리 멜라노가스터의 구연산 신타제 활동의 대색 분석

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

캡 의존형 번역 역학 분석을 위한 생체외 단일 분자 이미징 분석

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제를 스크리닝하기 위한 연속 형광 기반 엔도뉴클레아제 결합 DNA 메틸화 분석

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: Synapse 밀도의 변화를 감지하는 빠르고 편향되지 않은 형광 방법

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

형광 분석 또는 유세포분석을 사용한 카스파제 활성 측정

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...