Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Dr. David Engelke for hans veiledning og nyttige kommentarer på dette manuskriptet. PJS - Ball State University laboratorium oppstart kapital; DAB - gi 1R15AI130950-01.

Merk: Protokollen ble tilpasset fra Ref. 24.
1. få RNA og enzym rundt
<ol><li>Bruk i vitro transkribert RNAs internt merket med 32P, og rekombinant His6-Mod5 uttrykt i og renset fra E. coli, som beskrevet tidligere24.<ol>
<li>Introdusere i vitro transkribert RNAs (del 3) bruker T7 RNA polymerase i nærvær av umerkede ATP, UTP, CTP, GTP og 10 µCi gel-renset, etanol-igangsatte α-ATP, resuspended i 1 x TE ...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions.">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li><li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+modification+of+transfer+RNA.">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li><li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA.">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li><li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA.">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li><li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications.">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li><li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation.">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li><li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA.">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li><li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+MOD5,+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li><li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria.">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li><li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li><li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells.">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li><li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase.">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li><li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+(TRIT1)+gene.">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li><li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA.">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).</li><li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer.">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li><li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor.">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li><li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3'+untranslated+region+of+TRIT1.">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).</li><li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information.">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1,+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population.">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer.">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients'+survival.">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li><li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing.">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li><li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tRNA-modifying+protein,+TRIT1,+forms+amyloid+fibers+in+vitro.">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li><li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+prion,+Mod5,+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress.">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li><li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases.">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+tRNA+modification+isopentenyl-A37+alters+mRNA+decoding+and+causes+metabolic+deficiencies+in+fission+yeast.">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li><li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li><li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence.">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes.">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li><li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li><li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+modification+landscape+in+human+disease.">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+N(1)-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA.">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3'+UTRs+and+near+stop+codons.">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA.">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+reveals+a+conserved,+widespread,+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis.">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li><li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA.">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs.">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li></ol>

RNA modifikasjoner fortsette å vises å spille stadig mer viktig og ulike roller i mobilnettet og organismebiologi funksjon. Slik er utvikling av analyser avhøre RNA endre enzymer sentralt for bedre forstå de grunnleggende sidene ved biologi. Denne protokollen beskriver en høy oppløsning i vitro analysen betegner tRNA endring aktiviteten til Mod5.
Denne protokollen har klar fordel av å gi en direkte og enkelt interpretable avlesning av isopentenylation. Protokollen beskrevet gir...

Minst 163 distinkte posttranscriptional RNA endringer har blitt identifisert, med disse endringene overdragelse varierte og kontekst-avhengige funksjoner til RNAs direkte påvirke RNA struktur og påvirker interaksjoner av RNA med andre molekyler1,2. Som anerkjennelse for antallet og variasjonen av RNA modifikasjoner øker, er det avgjørende å utvikle analyser som kan pålitelig forhøre både RNA endringene og enzymer som katalysere dem.
En av de første RNA modifikasjonene identifiseres skjer ved base 37 i tRNAs, ved siden av anti-codon på 3 side3,4. En isopentenyl gruppe er overført fra dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) til N6 stillingen adenosin 37 (jeg6hovedvei A37) 3,5 på et delsett av både cytoplasmatiske og mitokondrie tRNAs. Jeg6hovedvei A37 forbedrer oversettelse kvalitet og effektivitet ved å øke den tRNA affinitet for ribosom4,6 og jeg6hovedvei A37 er viktig for stressrespons i bakterier7. Enzymer som utfører denne endringen kalles tRNA isopentenyl transferases og er svært bevart i bakterier8,9, sopp10, ormer11, planter12og høyere eukaryoter13 , inkludert mennesker14.
Mutasjoner i menneskelig tRNA isopentenyl transferase genet, TRIT1, er tilknyttet for menneskelig sykdom. For eksempel er en mutasjon i TRIT1 korrelert med en alvorlig mitokondrie sykdom, trolig forårsaket av en feil i mitokondrie protein syntese15,16. Videre TRIT1 har blitt beskrevet som en tumor suppressor genet17,18 og er involvert i flere typer kreft inkludert melanom19, bryst20, mage21og lunge kreft22 ,23. Til slutt, TRIT1 og Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferases er utsatt for aggregering proteiner som danner prion-lignende amyloid fiber24,25,26. Disse observasjonene implisere potensielt tRNA isopentenyl transferases i nevrodegenerative sykdommer, selv om direkte bevis for dette ikke har ennå vist.
Gitt rollen som isopentenyl transferases spiller i oversettelse og sykdom, metoder som direkte måler jeg6en isopentenyl transferase aktivitet er viktig for en mekanistisk forståelse av disse enzymer under normal og sykdomstilstander. Et økende antall metoder er tilgjengelige til å oppdage6A RNA endringer, inkludert i vitro isopentenylation analyser, positiv hybridisering i fravær av jeg6en (PHA6) søk, tynne lag kromatografi (TLC), aminosyre aksept aktivitet analyser og massespektrometri tilnærminger (anmeldt i Ref. 4).
I vitro isopentenylation analysen har blitt beskrevet som benytter 14C-DMAPP og umerkede tRNAs. I denne analysen overføres radioaktivt karbon til RNA fra 14C-DMAPP av isopentenyl-transferase. Denne analysen er svært følsom, er det ofte vanskelig å fastslå den spesifikke resten som er endret9,20,27. PHA6 analyser stole på den store jeg6en endring forstyrrer blanding av en 32P-merket probe spenner endret rester. Slik hybridisering er større i fravær av en jeg6en endring18,28,29. PHA6 analyser er svært følsomme og i stand til å analysere total RNA utvunnet fra mobilnettet lysates. I tillegg gir muligheten til å utforme sonder spesielt for RNA rundt denne metoden betydelig målet fleksibilitet. PHA6 analyser er imidlertid begrenset til karakterisering av endringer som skjer på rester i målrettede området av sonden og er derfor mindre sannsynlig å identifisere romanen endring områder. I tillegg som fravær av binding er et tegn på endring, vil andre endringer eller mutasjoner som påvirker RNA bindende forvirre dataanalyse.
En annen tilnærming kombinerer benzyl DEAE cellulose (BD) cellulose kromatografi med aminosyre aksept aktivitet som en presentasjon av jeg6en endringer i tRNA30. Denne tilnærmingen direkte søk funksjonen av i6en endring, men det er en indirekte oppdage6en endring og mangler oppløsning å kartlegge endringer i en bestemt rester i RNA. En TLC tilnærming er brukt til å oppdage totalt tRNA jeg6en modifikasjoner. I denne tilnærmingen, internt 32P-merket tRNAs er fordøyd å enkelt nukleotider og todimensjonal TLC analyse brukes til å identifisere isopentenylation. Denne fremgangsmåten er svært følsom oppdage totalt jeg6en i en gitt RNA prøve men på fordøyelsen, alle oppstartsrekkefølgen er tapt; Dermed har etterforskeren ingen måte å bestemme hvilke rester er endret31.
Flere nylig, flytende kromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS/MS) metoder har blitt utviklet som kvantitativt sammenligner totalt RNA endringer mellom arter, celletyper og eksperimentelle forhold32,33, 34. En begrensning av denne metoden er at det er mindre i stand til å bestemme identiteten og posisjon i RNA som den endrede nukleosid var avledet34. Videre begrense kompetanse og utstyr som er nødvendig for å utføre disse eksperimentene praktisk bruk av denne tilnærmingen.
I tillegg er flere neste generasjons sekvensering teknologi utviklet for å tilordne RNA endringer transcriptome hele34. Immunoprecipitation av RNAs med antistoffer spesifikke for en bestemt endring (RIP-Seq) aktiverer etterforskeren å identifisere alle sekvenser som inneholder en bestemt endring35,36. I tillegg stole revers transkriptase tilnærminger som Chem-Seq og ikke tilfeldig konflikt sekvensering på forstyrrelser av omvendt transkripsjon reaksjon på endrede rester37,38,39. Til tross for fordelen av disse teknikkene til å tilordne RNA endringer transcriptome hele, er RIP-seq og Chem-Seq teknologier begrenset av mangel på pålitelige antistoffer eller reaktive kjemikalier tilgjengelig for hver bestemte endringer, henholdsvis34. Videre revers transkriptase enzym kreves for å utføre Chem-Seq og ikke tilfeldig konflikt sekvensering teknikker kan hindres av stabil RNA. TRNAs svært modifisert og strukturelt stabil natur gjør dem spesielt vanskelig å forhøre disse teknikkene. Hittil har neste generasjons sekvensering-baserte teknologier ikke ennå blitt benyttet til map6en modifikasjoner34.
Her beskriver vi en enkel og direkte tilnærming til å oppdage6en tRNA endringer i vitro. Denne metoden bruker inkubasjonstiden for RNAs med rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferase (Mod5), etterfulgt av RNase T1 fordøyelsen og 1-dimensjonal geleelektroforese analyse til map6en modifikasjoner. Denne tilnærmingen er direkte og krever lite spesialisert kompetanse til å analysere dataene. Videre, denne metoden er tilpasningsdyktig til andre RNA endre enzymer, inkludert enzymer som covalently endrer molekylvekt av RNA eller en RNA mobilitet gjennom en gel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

N6- isopentenyladenosine RNA modifikasjoner er funksjonelt varierte og høyt konservert blant prokaryoter og eukaryoter. En av de mest høyt konservert N6- isopentenyladenosine modifikasjonene oppstår ved hovedvei A37 plassering i et delsett av tRNAs. Denne endringen forbedrer oversettelse effektivitet og kvalitet ved å øke affinitet av tRNA for ribosomet. Mutasjon av enzymer som er ansvarlig for denne endringen i eukaryoter er forbundet med flere sykdom stater, inkludert mitokondrie dysfunksjon og kreft. Forstå substrat spesifisitet og biokjemiske aktiviteter av disse enzymer er derfor viktig for forståelse av normal og patologisk eukaryote biologi. Et variert utvalg av metoder har vært ansatt som karakteriserer jeg6en modifikasjoner. Her er beskrevet en direkte tilnærming for påvisning av isopentenylation av Mod5. Denne metoden bruker inkubasjonstiden for RNAs med en rekombinant isopentenyl transferase, etterfulgt av RNase T1 fordøyelsen og 1-dimensjonal geleelektroforese analyse for å oppdage6en modifikasjoner. I tillegg drøftes potensielle tilpasningsevne denne protokollen til å beskrive andre RNA-modifisere enzymer.

Mod5 ble inkubert med en tyrosin tRNA eller serine tRNA i tilstedeværelse eller fravær av DMAPP. Etter modifisering reaksjonen var produkter RNase T1-fordøyd, som innstiftet 3 slutten av alle guanosines forlate en 3 guanosine monophosphates (GMP)24 (figur 1). Full fordøyelsen av RNAs produserer et forutsigbart mønster av radiolabeled fragmenter (figur 2A), som er så løst på en 20% ...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Her beskriver vi en protokoll for biokjemiske karakterisering av gjær RNA-modifisere enzym, Mod5, og diskutere hvordan denne protokollen kan brukes til andre RNA-modifisere enzymer.

I Vitro analysen å oppdage tRNA-Isopentenyl Transferase aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Det overordnede målet med denne protokollen er å biokjemisk karakterisere tRNA-Isopentenyl Transferase Activity In Vitro. Denne metoden er nyttig for in-vitro deteksjon og karakterisering av tRNA-isopentenyl transferase aktivitet av rensede rekombinante enzymer. Den største fordelen med denne teknikken er at det er en enkel og direkte analyse som brukes til å oppdage en kovalent RNA-modifikasjon.Selv om denne metoden gir innsikt i tRNA-eopentenyl transferase aktivitet, det er potensielt tilpasningsdyktig for biokjemisk karakterisering av bredt spekter eller RNA modifisere enzymer. Det første trinnet i denne prosedyren er å rengjøre glassplatene som skal brukes til støping av gelen grundig. Vask platene med såpe og vann, skyll godt med avionisert vann, og rengjør deretter platene med isopropanol og lofrie kluter.Deretter monterer platene og avstandsslene. Bland følgende reagenser for å lage en 100 milliliter 20% akrylamid, 7,5 molar urea, 1x TBE gel. 80 milliliter urea gel konsentrat, 10 milliliter urea gel fortynningsmiddel, og 10 milliliter urea gel buffer.Tilsett 40 mikroliter T-med og 800 mikroliter nylaget 10% ammoniumpersulfat til blandingen. Trekk geloppløsningen opp i en stor sprøyte og dispenser geloppløsningen mellom glassplatene som banker på glasset mens du dispenserer oppløsningen for å forhindre bobledannelse. La gelen stivne ved romtemperatur i 30 minutter.Etter at gelen har størknet, plant gelen på et vertikalt gelapparat. Fyll de øvre og nedre bufferkamrene med 1x TBE. To timer før du laster gelen, forhåndsdrevne gelen på 20 milliamps i to timer for å tillate buffergrensen å kjøre ut de minste oligonukleotider.Forbered hver reaksjon for RNA-ekfentenyleringsanalysen i et endelig volum på 17 mikroliter. Legg til hvert rør 50 millimolor Tris-HCl, pH 7.2, 1.2 millimolar ATP, 5.8 millimolar magnesiumklorid, 0,2 millimolar DMAPP, 10 enheter RNase hemmer, 40, 000 CPM internt 32P merket RNA, 5.3 micromolar Mod5, og 1.2 millimolar 2-mercaptoethanol. Inkuber reaksjonene ved 37 grader Celsius i en time.Etter en time, etanol utløse RNase ved hjelp av 2,5 volum på 100% etanol og 1/10 volum på 3,5 molar natriumacetat pH 5,5, og plassere den negativ 20 grader Celsius i en time over natten. Deretter sentrifugere RNA-prøvene ved 15, 400 g og fire grader Celsius i 20 minutter. Fjern forsiktig supernatanten og vask hver RNA pellet med 500 mikroliter på 70% etanol.Sentrifuger prøvene ved 15, 400 g og fire grader Celsius i fem minutter. Fjern forsiktig supernatanten og lufttørke RNA pellets i 15 minutter eller til alt etanol har fordampet. Deretter suspenderer hver RNA pellet i 10 mikroliter med åtte molar urea.Tilsett 150 enheter RNase T1 i hver prøve og inkuber ved 37 grader Celsius over natten. Dagen etter legger du til to mikroliter med 6x lastbuffer i hver prøve. Legg 10 mikroliter av hver RNA-prøve på en pre-run, 20% polyakrylamid, 7,5 molar urea gel.Kjør gelen på 25 milliamps i to timer. Etter to timer, stopp elektroforesen og fjern gelen fra apparatet. Bryt forseglingen mellom de to glassplatene og fjern forsiktig en av glassplatene med gelen igjen på begge platene.Legg et lag plastfolie over gelen og utsett på en fosforskjerm i tre timer. Denne protokollen oppdager pålitelig isopentenylering av både kanoniske og ikke-kanoniske tRNA-rester modifisert av S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. I dette eksemplet ble tyrosintRNA internt merket med 32P-adenosin og Mod5 ble inkubert med RNase i nærvær eller fravær av DMAPP.RNAs ble fordøyd med RNase T1 og løst på en denaturing polyakrylamid gel. Mod5 endrer den forventede rester i nærvær av DMAPP og indikert av forskjøvet 10 nukleotid, trippel adenosin som inneholder fragment ved kjernestilling 36 til 38 inneholder fragment i tyrosintRNA. Den modifiserte adenosin 37 bor er indikert med en stjerne.På samme måte når serinen tRNA inkuberes med Mod5 og DMAPP, observeres et fullstendig skifte av 10 nukleotid trippel adenosin som inneholder fragment i kjernestilling 36 til 38. Interessant, en delvis skifte av en syv nukleotid fragment observeres som ikke inneholder trippel adenosin som inneholder fragment i kjernestilling 36 til 38, noe som tyder på at trippel adenosin som inneholder fragment i nukleosidposisjon 36 til 38 sekvens og struktur kan ikke være nødvendig for Mod5 in vitro aktivitet. Når mestret denne teknikken vil ta to, fire til seks timers dager hvis det utføres riktig.Vel forsøk på denne prosedyren er det viktig å huske å opprettholde og overvåke integriteten til RNA, fordi RNA-nedbrytning kan påvirke RNA-endringen og vil forvirre datatolkning. Etter denne prosedyren mutasjonsstudier ved hjelp av enzymet av interesse, kan gjøres for å bestemme bestemte rester eller domener som kreves for enzymatisk aktivitet. Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen RNA-biologi, for å si tRNA-isopentenyl transferase aktiviteter av prokaryotiske og eukaryotiske enzymer.Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du utfører protokollen for påvisning av isopentenyl transferase aktivitet av ditt enzym av interesse. Ikke glem at det å arbeide med radioaktivitet kan være ekstremt farlig, og forholdsregler som bruk av riktig PPE, bruk av tilstrekkelig skjerming og avhending av radioaktivitet bør alltid tas mens du utfører denne prosedyren.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning av pH-avhengig aktivitet av<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Anstand HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; og<em&gt; I Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

En fluorescens-baserte analysen av fosfolipid Scramblase aktivitet

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifisering av Hypopigmentation aktivitet i Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

En fargemetrisk analysen av citrate syntase aktivitet i Drosophila Melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En In Vitro single-molecule imaging assay for analyse av cap-avhengig oversettelse kinetikk

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbasert endonukleasekoblet DNA-metyleringsanalyse for å screene for DNA-metyltransferasehemmere

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: En rask, objektiv fluorescerende metode for å oppdage endringer i synapsetetthet

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Måling av kaspaseaktivitet ved hjelp av fluorometrisk analyse eller flowcytometri

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...