Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer o Dr. David Engelke por sua orientação e comentários úteis sobre este manuscrito. PJS - fundos de inicialização de laboratório Ball State University; DAB - conceder 1R15AI130950-01.

Nota: O protocolo foi adaptado de ref. 24.
1. obter o RNA e a enzima de interesse
<ol><li>Uso em vitro transcrito RNAs internamente rotulados com 32P, e His6-Mod5 recombinante expressa em e purificado de e. coli, como descrito anteriormente,24.<ol>
<li>Introduzir em vitro transcrito RNAs (seção 3) usando T7 RNA polimerase na presença de ATP sem rótulo, UTP, CTP, GTP e 10 µCi de gel-purificado, etanol-p...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. 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Modificações de RNA continuam a ser mostrado para desempenhar um papel cada vez mais importante e diverso no celular e a função. Como tal, o desenvolvimento de ensaios para interrogar o RNA enzimas de modificação é fundamental para compreender melhor os aspectos fundamentais da biologia. Este protocolo descreve um ensaio de alta resolução em vitro para caracterizar a atividade de modificação do tRNA do Mod5.
Este protocolo tem a vantagem de fornecer uma leitura direta e fac...

Foram identificadas pelo menos 163 modificações de RNA posttranscriptional distintas, com estas modificações conferem funções diversas e contexto-dependente de RNAs, directamente influenciam a estrutura do RNA e afetando interações de RNA com outros moléculas1,2. À medida que aumenta a apreciação para o número e variedade de modificações do RNA, é fundamental desenvolver ensaios que podem confiantemente interrogar tanto as modificações de RNA e as enzimas que catalisam a eles.
Dentre as modificações de RNA primeiras a identificação ocorre em 37 base em tRNAs, adjacente a anticódon no 3' lado3,4. Um grupo de isopentenilo é transferido de dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) para a posição N6 de adenosina 37 (eu6A37) 3,5 em um subconjunto dos tRNAs citoplasmática e mitocondrial. Eu6A37 melhora a fidelidade de tradução e eficiência, aumentando a afinidade do tRNA para o ribossoma4,6 e eu6A37 é importante para a resposta ao estresse em bactérias7. As enzimas que realizam essa modificação são denominadas transferases de isopentenilo tRNA e são altamente conservadas em bactérias8,9, fungos10, vermes11, plantas12e uns eukaryotes13 , incluindo os seres humanos14.
Mutações do gene humano que o tRNA isopentenilo transferase, TRIT1, estão associadas a doenças humanas. Por exemplo, uma mutação no TRIT1 está correlacionada com uma grave doença mitocondrial, provavelmente causada por um defeito na síntese de proteína mitocondrial15,16. Além disso, TRIT1 tem sido descrito como um tumor supressor gene17,18 e está implicada em vários tipos de cânceres, incluindo o melanoma19, mama20, gástrico21e cânceres de pulmão22 ,23. Finalmente, TRIT1 e Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenilo transferases são propensas a agregação de proteínas que formam o prião-como fibras de amiloides24,25,26. Estas observações potencialmente implicam transferases de isopentenilo tRNA em doenças neurodegenerativas, embora a evidência direta para isso ainda não foi mostrada.
Tendo em conta o papel que isopentenilo transferases na tradução e na doença, métodos que diretamente eu medir6uma atividade de transferase de isopentenilo são importantes para uma compreensão mecanicista destas enzimas sob o normal e a Estados de doença. Um número crescente de métodos está disponível para detectar as modificações A RNA6, incluindo em vitro isopentenylation ensaios, hibridização positiva na ausência de i6ensaios de um (PHA6), fino cromatografia em camada delgada (TLC), aminoácido ensaios de atividade de aceitação e abordagens de espectrometria de massa (revisado em ref. 4).
Um ensaio de isopentenylation em vitro tem sido descrito que utiliza 14C-DMAPP e tRNAs sem rótulo. Neste ensaio, carbono radioactivo é transferido para RNA de 14C-DMAPP pelo transferase de isopentenilo. Enquanto este ensaio é altamente sensível, muitas vezes é difícil determinar o resíduo específico que é modificado9,20,27. PHA6 ensaios dependem o volumoso eu6A modificação interferindo com hibridação de uma sonda P-etiquetada 32, abrangendo os resíduos modificados. Como tal, a hibridação é maior na ausência de um i6uma modificação18,28,29. Ensaios de PHA6 são altamente sensíveis e capazes de analisar o RNA total extraído de lisado celular. Além disso, a capacidade de projetar sondas específicas para o RNA de interesse dá essa flexibilidade de alvo substancial do método. No entanto, PHA6 ensaios são limitados para a caracterização das modificações que ocorrem na resíduos dentro da região de destino da sonda e, portanto, são menos propensos a identificar sites novel modificação. Além disso, como ausência de vinculação é indicativa de modificação, outras modificações ou mutações que afetam a ligação de RNA vão confundir a análise dos dados.
Outra abordagem combina cromatografia de celulose benzílico DEAE celulose (BD) com atividade de aceitação de aminoácidos como uma leitura de i6A modificações no tRNA30. Esta abordagem ensaios diretamente a função do i6A modificação, mas isso é uma abordagem indireta para eu detectar6A modificação e carece de resolução para mapear as modificações de um resíduo específico no ARN. Uma abordagem de TLC tem sido usada para detectar tRNA total eu6A modificações. Nesta abordagem, internamente 32P-rotulado os tRNAs são digeridos de nucleotídeos simples e análise bidimensional do TLC é usado para identificar o isopentenylation. Esta abordagem é altamente sensível na detecção de eu total6A uma determinada amostra de RNA, mas após a digestão, todas as informações de sequência serão perdidas; assim, o investigador não tem meios de determinar quais resíduos foram modificados31.
Mais recentemente, líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS) foram desenvolvidos métodos que comparar quantitativamente modificações de RNA totais entre espécies, tipos de células e condições experimentais32,33, 34. Uma limitação desta metodologia é que é menos capaz de determinar a identidade e a posição dentro do RNA do qual os nucleosídeos modificados foi derivada34. Além disso, os conhecimentos e equipamentos necessários à execução dessas experiências limitam a praticabilidade desta abordagem.
Além disso, desenvolveram-se várias tecnologias de sequenciamento de nova geração para mapear RNA modificações transcriptome nível34. Imunoprecipitação de RNAs com anticorpos específicos para uma determinada modificação (RIP-Seq) permitem que o investigador identificar todas as sequências contendo uma modificação específica35,36. Além disso, abordagens de transcriptase reversa como Chem-Seq e sequenciamento de incompatibilidade não-aleatória dependem de perturbações da reação de transcrição reversa nos resíduos modificados37,38,39. Apesar da vantagem destas técnicas para mapear todo o transcriptoma RNA modificações, RIP-seq e Chem-Seq tecnologias são limitadas pela falta de confiança anticorpos ou Reactivos químicos disponíveis para cada alteração específica, respectivamente,34. Além disso, as enzimas transcriptase reversa necessária para executar Chem-Seq e técnicas de sequenciamento de incompatibilidade não-aleatório podem ser impedidas por estruturas estáveis de RNA. A natureza altamente modificada e estruturalmente estável de tRNAs torná-los especialmente difícil para interrogar usando essas técnicas. Até à data, tecnologias de próxima geração baseadas em sequenciamento ainda não foram utilizadas para mapear eu6modificações34.
Aqui, descrevemos uma abordagem simples e direta para detectar6A tRNA modificações em vitro. Este método utiliza a incubação de RNAs com recombinante S. cerevisiae isopentenilo transferase (Mod5), seguido por digestão de RNase T1 e análise de eletroforese de gel 1-dimensional Mapear6A modificações. Esta abordagem é direta e requer pouco especializado para analisar os dados. Além disso, este método é adaptável a outro RNA modificando enzimas, incluindo enzimas que covalentemente mudam o peso molecular de RNA ou mobilidade de um RNA através de um gel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

N6- isopentenyladenosine do RNA modificações é funcionalmente diversificada e altamente conservadas entre procariontes e eucariontes. Dentre as modificações de isopentenyladenosine -6N mais altamente conservadas ocorre na posição A37 em um subconjunto dos tRNAs. Esta modificação melhora a eficiência de conversão e fidelidade, aumentando a afinidade do tRNA para o ribossoma. Mutação das enzimas responsáveis por essa modificação em eucariontes estão associados a vários Estados de doenças, incluindo câncer e disfunção mitocondrial. Portanto, compreender a especificidade de substrato e actividades bioquímicas destas enzimas é importante para a compreensão da biologia eucariótica normal e patológica. Um diversificado leque de métodos tem sido empregado para caracterizar eu6A modificações. Aqui é descrita uma abordagem direta para a detecção de isopentenylation por Mod5. Este método utiliza a incubação de RNAs com uma transferase de isopentenilo recombinantes, seguido por digestão de RNase T1 e análise de eletroforese de gel 1-dimensional eu detectar6A modificações. Além disso, a potencial capacidade de adaptação do presente protocolo para caracterizar outras enzimas RNA-modificando é discutida.

Mod5 foi incubado com uma tirosina tRNA ou serina tRNA na presença ou ausência de DMAPP. Após a reação de modificação, produtos foram RNase T1-digerido, que fende a extremidade 3' de todos os guanosines deixando um 3' guanosina (GMP) de monophosphates24 (Figura 1). Digestão completa dos RNAs produz um padrão previsível de radiolabeled fragmentos(Figura 2),que então são resolvid...

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Aqui, descrevemos um protocolo para a caracterização bioquímica de enzimas de RNA-modificando o fermento, Mod5 e discutir como este protocolo poderia ser aplicado a outras enzimas RNA-modificando.

Um ensaio In Vitro para detectar a atividade de Transferase de tRNA-isopentenilo

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

O objetivo geral deste protocolo é caracterizar bioquimicamente a atividade de transferência de tRNA-Isopentenyl In Vitro. Este método é útil para a detecção in vitro e caracterização da atividade de transferência tRNA-isopentenyl de enzimas recombinantes purificadas. A principal vantagem desta técnica é que é um ensaio simples e direto usado para detectar uma modificação covalente de RNA.Embora este método forneça insights sobre a atividade de transferência isoolínica tRNA, ele é potencialmente adaptável para a caracterização bioquímica de enzimas modificadoras de RNA ou RNA. O primeiro passo neste procedimento é limpar completamente as placas de vidro que serão usadas para lançar o gel. Lave as placas com água e sabão, enxágue bem com água desionizada e, em seguida, limpe as placas com isopropanol e lenços sem fiapos.Em seguida, monte as placas e espaçadores. Misture os seguintes reagentes para fazer um 100 mililitros 20% de acrilamida, 7,5 ureia molar, 1x gel TBE. 80 mililitros de concentrado de gel de ureia, 10 mililitros de diluente de gel de ureia e 10 mililitros de tampão de gel de ureia.Adicione 40 microliters de T-med e 800 microliters de persulfito de amônio recém-preparado 10% à mistura. Desenhe a solução de gel em uma grande seringa e dispense a solução de gel entre as placas de vidro que batem no vidro enquanto dispensa a solução para evitar a formação de bolhas. Deixe o gel solidificar à temperatura ambiente por 30 minutos.Depois que o gel se solidificar, plante o gel em um aparelho de gel vertical. Encha as câmaras tampão superior e inferior com 1x TBE. Duas horas antes de carregar o gel, pré-execute o gel a 20 miliamperes por duas horas para permitir que o limite do buffer saia dos menores oligonucleotídeos.Prepare cada reação para o ensaio de isoocultura de RNA em um volume final de 17 microliters. Adicione a cada tubo 50 mililitros Tris-HCl, pH 7.2, 1,2 mililitro ATP, 5,8 mililitro de magnésio, 0,2 mililitro DMAPP, 10 unidades Inibidor RNase, 40, 000 CPM internamente 32P rotulado RNA, 5.3 micromolar Mod5, e 1,2 milimolar 2-mercaptool. Incubar as reações a 37 graus Celsius por uma hora.Após uma hora, o etanol precipita o RNase usando 2,5 volume de 100% etanol e 1/10 de volume de 3,5 acetato de sódio molar pH 5,5, e colocá-lo negativo 20 graus Celsius por uma hora durante a noite. Em seguida, centrifugar as amostras de RNA a 15, 400 g's e 4 graus Celsius por 20 minutos. Remova cuidadosamente o supernascer e lave cada pelota de RNA com 500 microliters de 70% de etanol.Centrifugar as amostras a 15,400 g's e 4 graus Celsius por cinco minutos. Remova cuidadosamente o supernasce e o ar seque as pelotas de RNA por 15 minutos ou até que todo o etanol tenha evaporado. Em seguida, suspenda cada pelota de RNA em 10 microlitres de oito ureias molares.Adicione 150 unidades de RNase T1 a cada amostra e incubar a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, adicione dois microliters de 6x tampão de carga a cada amostra. Carregue 10 microliters de cada amostra de RNA em um pré-executado, 20% poliacrilamida, 7,5 gel de ureia molar.Execute o gel a 25 miliamperes por duas horas. Depois de duas horas, pare a eletroforese e remova o gel do aparelho. Quebre o selo entre as duas placas de vidro e remova cuidadosamente uma das placas de vidro com o gel restante em qualquer placa.Coloque uma camada de plástico sobre o gel e exponha em uma tela de fósforo por três horas. Este protocolo detecta de forma confiável a isoocização de resíduos de tRNA canônicos e não triônicos modificados pelo S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. Neste exemplo, o tRNA de tirasina foi rotulado internamente com 32P-adenosina e Mod5 foi incubado com RNase na presença ou ausência de DMAPP.Os RNAs foram digeridos com RNase T1 e resolvidos em um gel de poliacrilamida desnaturação. Mod5 modifica o resíduo previsto na presença de DMAPP e indicado pelo nucleotídeo deslocado 10, adenosina tripla contendo fragmento nas posições nucleosídeos 36 a 38 contêm fragmento no tRNA de tirasina. A adenosina modificada 37 reside é indicada com um asterisco.Da mesma forma, quando o tRNA serino é incubado com Mod5 e DMAPP, observa-se uma mudança completa da adenosina tripla de nucleotídeo contendo fragmento na posição nucleosídea 36 a 38. Curiosamente, observa-se uma mudança parcial de um fragmento de sete nucleotídeos que não contém a tríplice adenosina contendo fragmento nas posições nucleosídeos 36 a 38, sugerindo que a adenosina tripla contendo fragmento na posição nucleosídea 36 a 38 sequência e estrutura pode não ser necessária para a atividade in vitro mod5. Uma vez dominada, essa técnica levará de dois, quatro a seis horas por dia, se for realizada corretamente.Bem, ao tentar este procedimento é importante lembrar de manter e monitorar a integridade do RNA, pois a degradação do RNA pode afetar a modificação do RNA e confundir a interpretação dos dados. Seguindo este procedimento estudos mutacionais usando sua enzima de interesse, poderia ser feito para determinar resíduos ou domínios específicos necessários para a atividade enzimática. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da biologia do RNA, para dizer atividades de transferência de tRNA-isoentnol de enzimas procarióticas e eucarióticas.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o protocolo para a detecção da atividade de transferência isoentada da sua enzima de interesse. Não se esqueça que trabalhar com radioatividade pode ser extremamente perigoso e precauções como usar EPI adequado, usar blindagem adequada e descartar a radioatividade adequadamente deve ser sempre tomada durante a realização deste procedimento.

Research

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