Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Dr. David Engelke por su orientación y comentarios sobre este manuscrito. Pijamas - fondos de puesta en marcha de laboratorio de Ball State University; DAB - concesión 1R15AI130950-01.

Nota: El protocolo fue adaptado de la ref. 24.
1. obtener el ARN y la enzima de interés
<ol><li>Uso en vitro transcribe ARN marcado internamente con 32P y Mod5 de His6 recombinante expresada en y purificado de la e. coli, como se describió anteriormente24.<ol>
<li>Introducir en vitro transcritos RNAs (sección 3) utilizando T7 ARN polimerasa en presencia de ATP sin etiqueta, UTP, CTP, GTP y 10 μCi de gel...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. 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Modificaciones de RNA continúan ser demostrado que desempeñan un papel cada vez más importantes y diversas en función celular y organismo. Como tal, el desarrollo de ensayos para interrogar RNA enzimas modificadoras es central para comprender mejor los aspectos fundamentales de la biología. Este protocolo describe un análisis de alta resolución de vitro para caracterizar la actividad de modificación de tRNA de Mod5.
Este protocolo tiene la clara ventaja de proporcionar una lec...

Se han identificado al menos 163 distinta modificación postranscripcional de RNA, con estas modificaciones confieren funciones diversas y contextual para RNAs directamente influir en la estructura del RNA y que afectan a las interacciones de RNA con otros las moléculas1,2. A medida que aumenta la apreciación de la cantidad y variedad de modificaciones de RNA, es fundamental para desarrollar ensayos que pueden interrogar confiablemente las modificaciones del RNA y las enzimas que catalizan los.
Una de las primeras modificaciones de RNA para identificarse se produce en 37 base en tRNAs, adyacente al anti-codon en el 3' parte3,4. Un grupo de isopentenyl se transfiere del dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) en la posición N6 de la adenosina 37 (me6A37) 3,5 en un subconjunto de tRNAs citoplásmica y mitocondrial. i6A37 mejora la fidelidad de la traducción y eficiencia aumentando la afinidad del ARNt por el ribosoma4,6 y yo6A37 es importante para la respuesta de estrés en las bacterias7. Las enzimas que realizan esta modificación se denominan transferasas de isopentenyl tRNA y están muy conservadas en bacterias8,9, hongos10, gusanos11, plantas12y eucariotas superiores13 , incluyendo los seres humanos14.
Las mutaciones en el gene humano de tRNA isopentenyl transferasa, TRIT1, están asociadas con enfermedad humana. Por ejemplo, una mutación en el TRIT1 se correlaciona con una severa enfermedad mitocondrial, probablemente causada por un defecto en la síntesis de proteínas mitocondriales15,16. Además, TRIT1 ha sido descrito como un tumor supresor genes17,18 y está implicada en varios tipos de cáncer incluyendo melanoma19, mama20, gástrico21y cánceres de pulmón22 ,23. Finalmente, TRIT1 y Mod5 transferasas de isopentenyl (Saccharomyces cerevisiae) son propensas a la agregación de proteínas que forman las fibras de amiloide-como prión24,25,26. Estas observaciones implican potencialmente transferasas de isopentenyl tRNA en enfermedades neurodegenerativas, aunque todavía no se ha demostrado evidencia directa para esto.
Dado el papel que isopentenyl transferasas en traducción y la enfermedad, métodos que directamente me miden6una actividad de transferasa de isopentenyl son importantes para una comprensión mecanicista de estas enzimas bajo normal y Estados de la enfermedad. Un número creciente de métodos está disponible para detectar modificaciones de una RNA6, incluyendo en vitro isopentenylation ensayos, hibridación positivo en ausencia de6ensayos (PHA6), delgada cromatografía (TLC), aminoácido ensayos de actividad de aceptación y métodos de espectrometría de masas (revisado en Ref. 4).
Un ensayo de isopentenylation en vitro se ha descrito que utiliza 14C-DMAPP y tRNAs sin etiqueta. En este ensayo, carbono radiactivo se transfiere al ARN de 14C-DMAPP por la transferasa de isopentenyl. Mientras que este ensayo es altamente sensible, a menudo es difícil determinar el residuo concreto que es modificada9,20,27. PHA6 ensayos dependen de la voluminosa me modificación6A interferir con la hibridación de una sonda marcada con P 32, que abarca el residuo modificado. Como tal, la hibridación es mayor en la ausencia de una i6una modificación18,28,29. PHA6 ensayos son muy sensibles y capaces de análisis de ARN total extraído de Lisados celulares. Además, la habilidad de diseñar sondas específicas de RNA de interés ofrece esta flexibilidad de método objetivo sustancial. Sin embargo, ensayos de PHA6 se limitan a la caracterización de las modificaciones que se producen en los residuos dentro de la región específica de la sonda y por lo tanto son menos propensos a identificar sitios de modificación novedosa. Además, como falta de Unión es indicativa de la modificación, otras modificaciones o mutaciones que afectan la Unión de la RNA se confundir análisis de datos.
Otro enfoque combina cromatografía de celulosa bencílico DEAE celulosa (BD) con actividad de aceptación de aminoácidos como una lectura de lo6A modificaciones en el tRNA30. Este enfoque ensayos directamente la función de la i modificación de6A, pero es una aproximación indirecta a detectar i6A modificación y carece de resolución para mapear modificaciones a un residuo específico en el ARN. Un enfoque del TLC se ha utilizado para detectar total tRNA i6A modificaciones. En este enfoque, internamente 32tRNAs P etiquetados son digeridos a nucleótidos individuales y análisis TLC bidimensional se utilizan para identificar el isopentenylation. Este enfoque es altamente sensible en la detección de i total6A en una muestra determinada de RNA pero sobre digestión, toda la información de secuencia se pierde; así, el investigador no tiene forma de determinar que los residuos han sido modificados31.
Más recientemente, se han desarrollado métodos líquido cromatografía-tandem espectrometría de masas (LC-MS/MS) que comparar cuantitativamente la total modificación de RNA entre especies, tipos celulares y condiciones experimentales32,33, 34. Una limitación de esta metodología es que es menos capaz de determinar la identidad y posición en el ARN que los nucleósidos modificados fue derivan34. Además, la experiencia y el equipo necesario para ejecutar estos experimentos limitan la utilidad de este enfoque.
Además, se han desarrollado varias tecnologías de secuenciación de próxima generación para RNA modificaciones todo el transcriptoma34. Inmunoprecipitación de RNAs con anticuerpos específicos a una modificación especial (RIP-Seq) permiten al investigador a identificar todas las secuencias que contiene una modificación específica35,36. Además, enfoques basados en la transcriptasa reversa como Chem-Seq y secuencia del desajuste no aleatoria se basan en las perturbaciones de la reacción de transcripción inversa en los residuos modificados37,38,39. A pesar de la ventaja de estas técnicas para asignar todo el RNA modificaciones transcriptoma, RIP-seq y Chem-Seq tecnologías están limitadas por la falta de anticuerpos confiables o disponible para cada modificación específica, respectivamente34reactivos químicos. Además, las enzimas transcriptasa reversa necesaria para realizar Chem-Seq y técnicas de secuenciación de desajuste no aleatoria pueden verse obstaculizadas por las estructuras de RNA estables. La naturaleza altamente modificada y estructuralmente estable de tRNAs hacen especialmente difíciles de interrogar utilizando estas técnicas. Hasta la fecha, tecnologías de secuenciación de próxima generación no se han utilizado todavía para mapa i6una modificaciones34.
Adjunto, describimos un enfoque simple y directo detectar6un tRNA modificaciones in vitro. Este método utiliza incubación de RNAs con recombinante S. cerevisiae isopentenyl transferasa (Mod5), seguido por digestión Rnasa T1 y el análisis de electroforesis de gel de 1 dimensión para mapa i6A modificaciones. Este enfoque es directo y requiere poco especializados para analizar los datos. Además, este método es adaptable a otros RNA modificación de enzimas, incluyendo enzimas que modifican covalentemente el peso molecular del ARN o movilidad de un RNA a través de un gel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

N6- isopentenyladenosine RNA modificaciones son funcionalmente diverso y altamente conservado entre procariotas y eucariotas. Una de las más altamente conservado N6- isopentenyladenosine modificaciones se produce en la posición de A37 en un subconjunto de tRNAs. Esta modificación mejora la eficiencia de la traducción y fidelidad mediante el aumento de la afinidad de los tRNA por el ribosoma. Mutación de las enzimas responsables de esta modificación en eucariotas están asociados con varios Estados de enfermedad, incluyendo cáncer y la disfunción mitocondrial. Por lo tanto, comprender la especificidad de sustrato y las actividades bioquímicas de estas enzimas es importante para la comprensión de la biología de eucariota normal y patológica. Una gran variedad de métodos se ha empleado para caracterizar i6A modificaciones. Es en este documento se describe un enfoque directo para la detección de isopentenylation por Mod5. Este método utiliza incubación de RNAs con recombinante isopentenyl transferasa, seguida por digestión Rnasa T1 y el análisis de electroforesis de gel 1-dimensional detectar modificaciones6A. Además, se discute la adaptabilidad potencial de este protocolo para caracterizar otras enzimas de modificación de RNA.

Mod5 fue incubado con una tirosina tRNA o serina tRNA en la presencia o ausencia de DMAPP. Tras la reacción de modificación, productos fueron digeridos ARNasa T1, que separa el extremo 3' de todos guanosines dejando una 3' guanosina (GMP) de Unión24 (figura 1). Digestión completa de los RNAs produce un patrón predecible de los fragmentos radiactivos (figura 2A), que luego se resolvió...

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An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Aquí, describimos un protocolo para la caracterización bioquímica de la enzima de modificación de RNA de la levadura, Mod5 y discutir cómo este protocolo podría aplicarse a otras enzimas de modificación de RNA.

Un ensayo In Vitro para detectar actividad de transferasa de Isopentenyl tRNA

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

El objetivo general de este protocolo es caracterizar bioquímicamente la actividad de la tRNA-Isopentenyl Transferase In Vitro. Este método es útil para la detección in vitro y la caracterización de la actividad de tRNA-isopentenyl transferase de enzimas recombinantes purificadas. La principal ventaja de esta técnica es que es un ensayo simple y directo utilizado para detectar una modificación covalente del ARN.Aunque este método proporciona información sobre la actividad de tRNA-isopentenyl transferase, es potencialmente adaptable para la caracterización bioquímica de enzimas modificadoras de ARN o de amplio rango. El primer paso en este procedimiento es limpiar a fondo las placas de vidrio que se utilizarán para la fundición del gel. Lave las placas con agua y jabón, enjuague bien con agua desionizada y luego limpie las placas con isopropanol y toallitas sin pelusas.A continuación, montar las placas y espaciadores. Mezclar los siguientes reactivos para hacer un gel de 100 mililitros 20%acrilamida, 7,5 molares, 1x gel TBE. 80 mililitros de concentrado de gel de urea, 10 mililitros de diluyente de gel de urea y 10 mililitros de tampón de gel de urea.Añadir 40 microlitros de T-med y 800 microlitros de 10% de persulfato de amonio recién preparado a la mezcla. Dibuje la solución de gel en una jeringa grande y dispense la solución de gel entre las placas de vidrio que se roscan en el vidrio mientras dispensa la solución para evitar la formación de burbujas. Deje que el gel se solidifique a temperatura ambiente durante 30 minutos.Después de que el gel se haya solidificado, planta el gel en un aparato de gel vertical. Llene las cámaras tampón superior e inferior con 1x TBE. Dos horas antes de cargar el gel, pre-ejecutar el gel a 20 miliamperios durante dos horas para permitir que el límite del búfer se ejecuten los oligonucleótidos más pequeños.Preparar cada reacción para el ensayo de isopentenilación de ARN en un volumen final de 17 microlitros. Añadir a cada tubo 50 milivolor Tris-HCl, pH 7,2, 1,2 ATP milimiolar, 5,8 cloruro de magnesio milimiolar, 0,2 DMAPP milimétrica, inhibidor de 10 unidades de lana, 40, 000 CPM internamente 32P etiquetado ARN, 5,3 micromolar Mod5, y 1,2 milimolar 2-mercptoetanol. Incubar las reacciones a 37 grados centígrados durante una hora.Después de una hora, el etanol precipita la RNase usando 2,5 volumen de 100%etanol y 1/10 volumen de 3,5 molar de acetato de sodio pH 5.5, y lo coloca negativo 20 grados Celsius durante una hora durante la noche. A continuación, centrifugar las muestras de ARN a 15, 400 g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante y lave cada pellet de ARN con 500 microlitros de 70% etanol.Centrifugar las muestras a 15, 400 g y cuatro grados celsius durante cinco minutos. Retire cuidadosamente el sobrenadante y seque al aire los pellets de ARN durante 15 minutos o hasta que todo el etanol se haya evaporado. A continuación, vuelva a suspender cada pellet de ARN en 10 microlitros de ocho urea molares.Añadir 150 unidades de RNase T1 a cada muestra e incubar a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, agregue dos microlitros de búfer de carga 6x a cada muestra. Cargue 10 microlitros de cada muestra de ARN en un gel de urea precocida, 20% poliacrilamida y 7,5 molares.Ejecuta el gel a 25 miliamperios durante dos horas. Después de dos horas, detenga la electroforesis y retire el gel del aparato. Romper el sello entre las dos placas de vidrio y retirar cuidadosamente una de las placas de vidrio con el gel restante en cualquiera de las placas.Coloque una capa de envoltura de plástico sobre el gel y exponga en una pantalla de fósforo durante tres horas. Este protocolo detecta de forma fiable la isopentenilación de residuos de ARN no canónico y no canónico modificados por la S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. En este ejemplo tyrosina tRNA fue etiquetado internamente con 32P-adenosina y Mod5 fue incubado con RNase en presencia o ausencia de DMAPP.Los ARN se digerieron con RNase T1 y se resolvieron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante. Mod5 modifica el residuo predicho en presencia de DMAPP e indicado por el 10 nucleótido desplazado, triple adenosina que contiene fragmento en las posiciones de nucleósidos 36 a 38 contienen fragmento en el TRNA tirosina. La adenosina modificada 37 reside se indica con un asterisco.Del mismo modo, cuando el ARN de serina se incuba con Mod5 y DMAPP, se observa un desplazamiento completo de los 10 nucleótidos triple adenosina que contiene fragmento en la posición de nucleósido 36 a 38. Curiosamente, se observa un desplazamiento parcial de un fragmento de siete nucleótidos que no contiene el triple adenosina que contiene fragmento en las posiciones de nucleósidos 36 a 38, lo que sugiere que el fragmento de adenosina triple que contiene en la posición del nucleósido 36 a 38 secuencia y la estructura puede no ser necesaria para la actividad in vitro Mod5. Una vez dominada esta técnica tomará de dos, cuatro a seis horas días si se realiza correctamente.Al intentar bien este procedimiento es importante recordar mantener y monitorear la integridad del ARN, porque la degradación del ARN podría afectar la modificación del ARN y confundirá la interpretación de los datos. Después de este procedimiento, se podrían realizar estudios mutacionales con la enzima de interés para determinar los residuos o dominios específicos necesarios para la actividad enzimática. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología del ARN, digan las actividades de tRNA-isopentenyl transferase de enzimas procarióticas y eucariotas.Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo llevar a cabo el protocolo para la detección de la actividad de la isopentenyl transferase de su enzima de interés. No olvide que trabajar con radiactividad puede ser extremadamente peligroso y las precauciones tales como usar un EPP adecuado, usar un blindaje adecuado y eliminar la radiactividad correctamente siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

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Detección de la actividad dependiente del pH de<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Acompañante HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; y<em&gt; En Vivo</em

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