Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

Vi vill tacka Dr David Engelke för hans vägledning och hjälpsamma kommentarer på detta manuskript. PJS - Ball State University laboratorium start medel. DAB - bevilja 1R15AI130950-01.

Obs: Protokollet var anpassad från Ref. 24.
1. Skaffa RNA och enzym av intresse
<ol><li>Användning i vitro transkriberas RNAs internt märkt med 32P, och rekombinant His6-Mod5 uttryckt i och renas från E. coli, som tidigare beskrivits24.<ol>
<li>Införa i vitro transkriberas RNAs (avsnitt 3) använder T7 RNA-polymeras i närvaro av omärkta ATP, UTP, CTP, GTP och 10 µCi av gel-renat, etanol-fällt α-AT...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions.">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li><li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+modification+of+transfer+RNA.">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li><li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA.">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li><li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA.">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li><li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications.">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li><li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation.">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li><li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA.">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li><li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+MOD5,+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li><li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria.">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li><li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li><li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells.">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li><li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase.">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li><li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+(TRIT1)+gene.">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li><li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA.">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).</li><li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer.">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li><li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor.">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li><li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3'+untranslated+region+of+TRIT1.">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).</li><li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information.">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1,+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population.">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer.">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients'+survival.">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li><li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing.">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li><li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tRNA-modifying+protein,+TRIT1,+forms+amyloid+fibers+in+vitro.">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li><li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+prion,+Mod5,+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress.">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li><li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases.">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+tRNA+modification+isopentenyl-A37+alters+mRNA+decoding+and+causes+metabolic+deficiencies+in+fission+yeast.">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li><li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li><li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence.">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes.">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li><li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li><li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+modification+landscape+in+human+disease.">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+N(1)-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA.">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3'+UTRs+and+near+stop+codons.">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA.">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+reveals+a+conserved,+widespread,+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis.">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li><li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA.">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs.">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li></ol>

RNA ändringar fortsätter att visas att spela allt mer viktiga och olikartade roller i cellulär och organismers funktion. Som sådan, är utvecklingen av analyser att förhöra RNA ändra enzymer central för att bättre förstå de grundläggande aspekterna av biologi. Det här protokollet beskriver en högupplöst in vitro- test för att karakterisera aktiviteten tRNA modifiering av Mod5.
Detta protokoll har den klara fördelen att ge en direkt och lätt tolkningsbara avläsning a...

Minst 163 distinkta postttransskriptionell RNA ändringar har identifierats, med dessa ändringar ger varierande och innehållsberoende funktioner till RNAs, direkt påverka RNA struktur, och som påverkar samspelet mellan RNA med andra molekyler1,2. Som uppskattning för antal och mängd RNA ändringar ökar, är det viktigt att utveckla analyser som tillförlitligt kan förhöra både RNA ändringarna och de enzymer som katalyserar dem.
En av de första RNA ändringarna identifieras uppstår vid basen 37 i tRNAs, intill den anti Codonen på 3' sida3,4. En isopentenyl grupp överförs från dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) till N6 position av adenosin 37 (jag6A37) 3,5 på en delmängd av både cytoplasmiska och mitokondrie tRNAs. Jag6A37 förbättrar översättning trohet och effektivitet genom att öka den tRNAen affinitet för de Ribosomen4,6 och jag6A37 är viktigt för stress i bakterier7. De enzymer som utför denna ändring kallas tRNA isopentenyl transferaser och är starkt konservativa i bakterier8,9, svampar10, maskar11, växter12och högre eukaryotes13 , inklusive människor14.
Mutationer i mänskliga tRNA isopentenyl transferas gen, TRIT1, är associerade med mänskliga sjukdomar. Exempelvis är en mutation i TRIT1 korrelerad med en svår mitokondriell sjukdom, troligen orsakad av en defekt i mitokondriell proteinsyntes15,16. Dessutom TRIT1 har beskrivits som en tumör suppressor genen17,18 och är inblandad i flera typer av cancer inklusive melanom19, bröst20, gastric21och lung cancer22 ,23. Slutligen TRIT1 och Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl transferaser är aggregation-benägen proteiner som bildar prion-liknande amyloid fibrer24,25,26. Dessa observationer implicerade potentiellt tRNA isopentenyl transferaser vid neurodegenerativa sjukdomar, även om direkta bevis för detta inte har ännu visats.
Givna roll att isopentenyl transferaser i översättning och sjukdom, metoder som direkt åtgärd jag6en isopentenyl transferas aktivitet är viktiga för en mekanistisk förståelse av dessa enzymer under normala och stater sjukdom. Det finns ett ökande antal metoder att upptäcka jag6A RNA ändringar, inklusive in vitro- isopentenylation analyser, positiva hybridisering i avsaknad av jag6en (PHA6)-analyser, tunna lager kromatografi (TLC), aminosyra acceptans aktivitet analyser och masspektrometri metoder (granskad i Ref. 4).
En in vitro- isopentenylation assay har beskrivits som använder 14C-DMAPP och omärkt tRNAs. I denna analys överförs radioaktivt kol till RNA från 14C-DMAPP av den isopentenyl-transferasen. Denna analys är mycket känslig, är det ofta svårt att avgöra särskilda restmängd som är modified9,20,27. PHA6 analyser lita på den skrymmande jag6A ändring stör hybridisering av en 32P-märkt sond som spänner över det modifierade rest. Som sådan hybridisering är större i avsaknad av ett i6en ändring18,28,29. PHA6 analyserna är mycket känsliga och kan analysera total-RNA extraherade från cellulära lysates. Dessutom ger möjligheten att designa sonder som är specifika för RNA av intresse denna metod betydande mål flexibilitet. PHA6 analyser är dock begränsade till karakterisering av ändringar som inträffar på rester inom den berörda regionen av sonden och är därför mindre sannolikt att identifiera roman modifiering platser. Dessutom, eftersom avsaknad av bindande är vägledande för modifiering, kommer andra modifieringar eller mutationer som påverkar RNA bindande förbrylla dataanalys.
En annan strategi kombinerar bensyl DEAE-cellulosa (BD) cellulosa kromatografi med aminosyran acceptans verksamhet en avläsning av i6A ändringar i tRNA30. Detta tillvägagångssätt analyser direkt funktion av i6A ändring, men det är en indirekt metod att upptäcka jag6A modifiering och saknar resolution att mappa ändringar av en specifik rester i RNA. En TLC tillvägagångssätt har använts att upptäcka totala tRNA jag6A modifieringar. I denna strategi, internt 32P-märkt tRNAs rötas till enstaka nukleotider och tvådimensionella TLC analys används för att identifiera isopentenylation. Detta tillvägagångssätt är mycket känsliga i upptäckande totalt jag6A i ett givet RNA-prov men vid matsmältning, alla sekvensinformation går förlorad; Utredaren har således, inget sätt att fastställa vilka rester har varit modifierad31.
Mer nyligen, liquid chromatography-tandem masspektrometri (LC-MS/MS) metoder har utvecklats som kvantitativt jämför totala RNA ändringar mellan arter, celltyper och experimentella förhållanden32,33, 34. En begränsning av denna metod är att det är mindre kunna fastställa identitet och ställning inom RNA som var den modifierade nukleosiden härrör34. Dessutom begränsa den expertis och utrustning som är nödvändiga för att genomföra dessa experiment praktiskhet i denna strategi.
Dessutom har flera nästa generations sekvensering teknik utvecklats för att mappa RNA ändringar transkriptom hela34. Immunoprecipitation av RNAs med antikroppar som är specifika för en viss modifiering (RIP-Seq) gör det möjligt för utredaren att identifiera alla sekvenser som innehåller en specifik ändring35,36. Omvänt transkriptas-baserade metoder såsom Chem-Seq och icke-slumpmässigt mismatch sekvensering är dessutom beroende av störningar av omvänd Transkription reaktionen vid den modifierade rester37,38,39. Trots fördelen med dessa tekniker för att mappa RNA ändringar transkriptom-wide, begränsas RIP-seq och Chem-Seq teknik av bristen på tillförlitliga antikroppar eller reaktiva kemikalier tillgänglig för varje specifik modifiering, respektive34. Dessutom omvänt transkriptas enzymer för att utföra Chem-Seq och icke-slumpmässigt mismatch sekvensering tekniker kan hindras genom stabila RNA strukturer. Den starkt modifierade och strukturellt stabil karaktären tRNAs gör dem särskilt svårt att förhöra använda dessa tekniker. Hittills har nästa generations sekvensering-baserad teknik inte ännu använts till karta jag6en ändringar34.
Häri, beskriver vi en enkel och direkt inställning till upptäcka jag6A tRNA ändringar in vitro. Denna metod använder tredjeparts inkubering av RNAs med rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferas (Mod5), följt av RNase T1 matsmältningen och 1-dimensionella gelelektrofores analys för att kartlägga jag6A modifieringar. Denna strategi är direkt och kräver lite specialiserad expertis för att analysera data. Dessutom är denna metod anpassas till andra RNA ändra enzymer, inklusive enzymer som kovalent ändrar den molekylära vikten av RNA eller en RNA rörlighet genom en gel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

N6- isopentenyladenosine RNA modifieringar är funktionellt mångsidig och mycket bevarat bland prokaryoter och Eukaryoter. En av de mest mycket N6- isopentenyladenosine ändringarna uppstår vid A37 position i en delmängd av tRNAs. Ändringen förbättrar översättning effektivitet och trohet genom att öka tRNAen affinitet för Ribosomen. Mutation av enzymer som ansvarar för denna ändring i Eukaryoter är associerade med flera sjukdomstillstånd, inklusive mitokondriell dysfunktion och cancer. Därför är det viktigt för förståelse av normal och patologisk eukaryota biologi att förstå substrat specificitet och biokemiska aktiviteter av dessa enzymer. En mångfald av metoder har använts för att karakterisera jag6A modifieringar. Är häri beskrivs en direkt metod för detektion av isopentenylation av Mod5. Denna metod använder tredjeparts inkubation av RNAs med en rekombinant isopentenyl transferas, följt av RNase T1 matsmältningen och 1-dimensionella gelelektrofores analys till upptäcka jag6A modifieringar. Dessutom diskuteras detta protokoll att karakterisera andra RNA-ändra enzymer potentiella anpassningsförmåga.

Mod5 var inkuberas med en tyrosin tRNA eller serine tRNA i närvaro eller frånvaro av DMAPP. Efter modifiering reaktionen var produkterna RNase T1-rötas, som klyver 3' ände alla guanosines lämnar en 3' guanosinmonofosfat monophosphates (GMP)24 (figur 1). Fullständig nedbrytning av RNASEN producerar ett förutsägbart mönster av radiomärkt fragment (figur 2A), som sedan löses på en...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Här beskriver vi ett protokoll för biokemisk karakterisering av jäst RNA-modifiera enzymet, Mod5, och diskutera hur detta protokoll skulle kunna tillämpas på andra RNA-ändra enzymer.

En In Vitro Assay att upptäcka tRNA-Isopentenyl transferas aktivitet

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Det övergripande målet för detta protokoll är att biokemiskt karakterisera tRNA-Isopentyl Transferase Activity In Vitro. Denna metod är användbar för in-vitro-detektion och karakterisering av tRNA-isopentenyl transferasaktivitet av renade rekombinanta enzymer. Den största fördelen med denna teknik är att det är en enkel och direkt analys som används för att upptäcka en kovalent RNA modifiering.Även om denna metod ger insikt i tRNA-isopentyl transferas aktivitet, det är potentiellt anpassningsbar för biokemisk karakterisering av brett spektrum eller RNA ändra enzymer. Det första steget i detta förfarande är att noggrant rengöra glasplattorna som kommer att användas för gjutning av gelen. Tvätta plattorna med tvål och vatten, skölj väl med avjoniserat vatten och rengör sedan plattorna med isopropanol och luddfria våtservetter.Därefter monterar du plattorna och distanserna. Blanda följande reagenser för att göra en 100 milliliter 20%akrylamid, 7,5 molar urea, 1x TBE gel. 80 milliliter urea gel koncentrat, 10 milliliter av urea gel spädningsmedel, och 10 milliliter av urea gel buffert.Tillsätt 40 mikroliter av T-med och 800 mikroliter av nyberedda 10%ammoniumpersulfierar till blandningen. Dra gellösningen upp i en stor spruta och dosera gellösningen mellan glasplattorna som knackar på glaset medan du doserar lösningen för att förhindra att bubbla bildas. Låt gelen stelna i rumstemperatur i 30 minuter.Efter att gelen har stelnat, plantera gelen på en vertikal gelapparat. Fyll de övre och nedre buffertkamrarna med 1x TBE. Två timmar före laddning av gelen, förhand ge gelen på 20 milliasor i två timmar så att buffertgränsen att ut köra de minsta oligonukleotiderna.Förbered varje reaktion för RNA isopentylationsanalysen i en slutvolym på 17 mikroliter. Lägg till varje rör 50 millimolor Tris-HCl, pH 7,2, 1,2 millimolar ATP, 5,8 millimolar magnesiumklorid, 0,2 millimolar DMAPP, 10 enheter RNase inhibitor, 40, 000 CPM internt 32P märkt RNA, 5.3 mikromolar Mod5, och 1,2 millimolar 2-merkaps etanoltill. Inkubera reaktionerna vid 37 grader Celsius i en timme.Efter en timme, etanol fällning RNase med 2,5 volym 100%etanol och 1/10 volym av 3,5 molar natriumacetat pH 5,5, och placera den negativa 20 grader Celsius för en timme över natten. Därefter centrifugera RNA-proverna vid 15, 400 g och fyra grader Celsius i 20 minuter. Ta försiktigt bort supernatanten och tvätta varje RNA-pellet med 500 mikroliter 70%etanol.Centrifugera proverna vid 15, 400 g och fyra grader Celsius i fem minuter. Tag försiktigt bort supernatanten och lufttorka RNA-pelletsen i 15 minuter eller tills all etanol har avdunstat. Nästa åter upphäva varje RNA pellet i 10 mikroliter av åtta molar urea.Tillsätt 150 enheter RNase T1 till varje prov och inkubera vid 37 grader Celsius över natten. På följande dag, lägg till två mikroliter av 6x lastning buffert till varje prov. Ladda 10 mikroliter av varje RNA-prov på en förkörning, 20%polyakrylamid, 7,5 molar urea gel.Kör gelen på 25 milliass i två timmar. Efter två timmar, stoppa elektroforesen och ta bort gelen från apparaten. Bryt tätningen mellan de två glasplattorna och ta försiktigt bort en av glasplattorna med gelen kvar på endera plattan.Placera ett lager av plastfolie över gelen och exponera på en fosfor skärm i tre timmar. Detta protokoll på ett tillförlitligt sätt upptäcker isopentenylation av både kanoniska och noncanonical tRNA rester som modifierats av S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5. I detta exempel tyrosin tRNA var internt märkt med 32P-adenosin och Mod5 inkuberades med RNase i närvaro eller frånvaro av DMAPP.RNAs var smält med RNase T1 och löst på en denaturering polyakrylamid gel. Mod5 modifierar den förutsagda rester i närvaro av DMAPP och indikeras av den förskjutna 10 nukleotid, trippel adenosin som innehåller fragment vid nukleosid positioner 36 till 38 innehåller fragment i tyrosin tRNA. Den modifierade adenosin 37 bosatt anges med en asterisk.På samma sätt när serin tRNA inkuberas med Mod5 och DMAPP, observeras en fullständig förskjutning av de 10 nukleotid trippel adenosin som innehåller fragment vid nukleosid position 36 till 38. Intressant nog observeras en partiell förskjutning av en sju nukleotid fragment som inte innehåller trippel adenosin som innehåller fragment vid nukleosid positioner 36 till 38, vilket tyder på att trippel adenosin som innehåller fragment vid nukleosid position 36 genom 38 sekvens och struktur får inte krävas för Mod5 in vitro-aktivitet. När behärskar denna teknik kommer att ta två, fyra till sex timmar dagar om det utförs på rätt sätt.Brunnförsök detta tillvägagångssätt är det viktigt att minnas för att underhålla och övervaka fullständigheten av RNAEN, därför att RNAförsbrytning kunde verkställa RNAmodifikationen och ska confound datatolkning. Efter detta förfarande mutational studier med hjälp av ditt enzym av intresse, skulle kunna göras för att fastställa specifika rester eller domäner som krävs för enzymatisk verksamhet. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom RNA-biologi, att säga tRNA-isopentyl transferas verksamhet av prokaryota och eukaryota enzymer.Efter att ha sett den här videon, bör du ha en god förståelse för hur man genomför protokollet för detektering av isopentyl transferas aktivitet av ditt enzym av intresse. Glöm inte att arbeta med radioaktivitet kan vara extremt farligt och försiktighetsåtgärder som att bära korrekt personlig skyddsutrustning, använda adekvat skärmning, och kassera radioaktivitet på rätt sätt bör alltid vidtas när du utför denna procedur.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detektering av den pH-beroende aktivitet för<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; och<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

En fluorescensbaserad analys av Phospholipid Scramblase Aktivitet

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifiering av cyklin-beroende Kinase 1 särskilda fosforylering platser av ett In Vitro -Kinas Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Kvantifiering av hypopigmentering aktivitet In Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

En kolorimetrisk analys av Citratsyntas aktivitet i Drosophila melanogaster

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

En in vitro-analys för enmolekylsavbildning för analys av cap-beroende översättningskinetik

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuerlig fluorescensbaserad endonukleaskopplad DNA-metyleringsanalys för att screena för DNA-metyltransferashämmare

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: En snabb, opartisk fluorescerande metod för att upptäcka förändringar i synapsdensitet

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Mätning av kaspasaktivitet med hjälp av en fluorometrisk analys eller flödescytometri

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...