Name: an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity
Uploaded: 2018-10-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

Dr David Engelke onun rehberlik ve bu el yazması üzerinde yararlı yorumlar için teşekkür etmek istiyorum. PİJAMA - Ball State University laboratuvar başlangıç fonlar; DAB - 1R15AI130950-01 vermek.

Not: Protokol Ref. 24uyarlanmıştır.
1. RNA ve enzim ilgi elde etmek
<ol><li>Kullanım vitro dahili 32ile P etiketli RNA transkripsiyonu ve rekombinant His6-Mod5 ifade ve E. coli, yukarıda açıklanan24olarak gelen saf.<ol>
<li>Tanıtmak vitro transkripsiyonu RNA'ların (Bölüm 3) T7 RNA polimeraz etiketlenmemiş ATP, UTP, CTP, GTP ve jel saf, etanol çöktürülmüş α-ATP, 10 µCi huzurunda kullanara...

<ol>
	<li>Boccaletto, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MODOMICS:+a+database+of+RNA+modification+pathways.+2017+update.">MODOMICS: a database of RNA modification pathways. 2017 update.</a> Nucleic Acids Research. 46 (D1), 303-307 (2018).</li><li>Lewis, C. J., Pan, T., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+modifications+and+structures+cooperate+to+guide+RNA-protein+interactions.">RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions.</a> Nature Reviews: Molecular and Cellular Biology. 18 (3), 202-210 (2017).</li><li>Soll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+modification+of+transfer+RNA.">Enzymatic modification of transfer RNA.</a> Science. 173 (3994), 293-299 (1971).</li><li>Schweizer, U., Bohleber, S., Fradejas-Villar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+modified+base+isopentenyladenosine+and+its+derivatives+in+tRNA.">The modified base isopentenyladenosine and its derivatives in tRNA.</a> RNA Biology. 14 (9), 1197-1208 (2017).</li><li>Persson, B. C., Esberg, B., Olafsson, O., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+function+of+isopentenyl+adenosine+derivatives+in+tRNA.">Synthesis and function of isopentenyl adenosine derivatives in tRNA.</a> Biochimie. 76 (12), 1152-1160 (1994).</li><li>Urbonavicius, J., Qian, Q., Durand, J. M., Hagervall, T. G., Bjork, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+reading+frame+maintenance+is+a+common+function+for+several+tRNA+modifications.">Improvement of reading frame maintenance is a common function for several tRNA modifications.</a> EMBO Journal. 20 (17), 4863-4873 (2001).</li><li>Aubee, J. I., Olu, M., Thompson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+i6A37+tRNA+modification+is+essential+for+proper+decoding+of+UUX-Leucine+codons+during+rpoS+and+iraP+translation.">The i6A37 tRNA modification is essential for proper decoding of UUX-Leucine codons during rpoS and iraP translation.</a> RNA. 22 (5), 729-742 (2016).</li><li>Caillet, J., Droogmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+cloning+of+the+Escherichia+coli+miaA+gene+involved+in+the+formation+of+delta+2-isopentenyl+adenosine+in+tRNA.">Molecular cloning of the Escherichia coli miaA gene involved in the formation of delta 2-isopentenyl adenosine in tRNA.</a> Journal of Bacteriology. 170 (9), 4147-4152 (1988).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+essential+elements+for+recognition+of+tRNA+substrates+within+the+anticodon+stem-loop.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: essential elements for recognition of tRNA substrates within the anticodon stem-loop.</a> Biochemistry. 39 (21), 6546-6553 (2000).</li><li>Dihanich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+MOD5,+a+gene+required+for+isopentenylation+of+cytoplasmic+and+mitochondrial+tRNAs+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isolation and characterization of MOD5, a gene required for isopentenylation of cytoplasmic and mitochondrial tRNAs of Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 7 (1), 177-184 (1987).</li><li>Lemieux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+physiological+rates+in+Caenorhabditis+elegans+by+a+tRNA-modifying+enzyme+in+the+mitochondria.">Regulation of physiological rates in Caenorhabditis elegans by a tRNA-modifying enzyme in the mitochondria.</a> Genetics. 159 (1), 147-157 (2001).</li><li>Golovko, A., Sitbon, F., Tillberg, E., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tRNA+isopentenyltransferase+gene+from+Arabidopsis+thaliana.">Identification of a tRNA isopentenyltransferase gene from Arabidopsis thaliana.</a> Plant Molecular Biology. 49 (2), 161-169 (2002).</li><li>Warner, G. J., Rusconi, C. P., White, I. E., Faust, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sequencing+of+two+isopentenyladenosine-modified+transfer+RNAs+from+Chinese+hamster+ovary+cells.">Identification and sequencing of two isopentenyladenosine-modified transfer RNAs from Chinese hamster ovary cells.</a> Nucleic Acids Research. 26 (23), 5533-5535 (1998).</li><li>Golovko, A., Hjalm, G., Sitbon, F., Nicander, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning+of+a+human+tRNA+isopentenyl+transferase.">Cloning of a human tRNA isopentenyl transferase.</a> Gene. 258 (1-2), 85-93 (2000).</li><li>Kernohan, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matchmaking+facilitates+the+diagnosis+of+an+autosomal-recessive+mitochondrial+disease+caused+by+biallelic+mutation+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+(TRIT1)+gene.">Matchmaking facilitates the diagnosis of an autosomal-recessive mitochondrial disease caused by biallelic mutation of the tRNA isopentenyltransferase (TRIT1) gene.</a> Human Mutations. 38 (5), 511-516 (2017).</li><li>Yarham, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+i6A37+modification+of+mitochondrial+and+cytosolic+tRNAs+results+from+pathogenic+mutations+in+TRIT1+and+its+substrate+tRNA.">Defective i6A37 modification of mitochondrial and cytosolic tRNAs results from pathogenic mutations in TRIT1 and its substrate tRNA.</a> PLoS Genetics. 10 (6), 1004424 (2014).</li><li>Smaldino, P. J., Read, D. F., Pratt-Hyatt, M., Hopper, A. K., Engelke, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoplasmic+and+nuclear+populations+of+the+eukaryote+tRNA-isopentenyl+transferase+have+distinct+functions+with+implications+in+human+cancer.">The cytoplasmic and nuclear populations of the eukaryote tRNA-isopentenyl transferase have distinct functions with implications in human cancer.</a> Gene. 556 (1), 13-18 (2015).</li><li>Lamichhane, T. N., Mattijssen, S., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cells+have+a+limited+set+of+tRNA+anticodon+loop+substrates+of+the+tRNA+isopentenyltransferase+TRIT1+tumor+suppressor.">Human cells have a limited set of tRNA anticodon loop substrates of the tRNA isopentenyltransferase TRIT1 tumor suppressor.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (24), 4900-4908 (2013).</li><li>Swoboda, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimelanoma+CTL+recognizes+peptides+derived+from+an+ORF+transcribed+from+the+antisense+strand+of+the+3'+untranslated+region+of+TRIT1.">Antimelanoma CTL recognizes peptides derived from an ORF transcribed from the antisense strand of the 3' untranslated region of TRIT1.</a> Molecular Therapy Oncolytics. 1, 14009 (2015).</li><li>Yue, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+breast+cancer+candidate+genes+using+gene+co-expression+and+protein-protein+interaction+information.">Identification of breast cancer candidate genes using gene co-expression and protein-protein interaction information.</a> Oncotarget. 7 (24), 36092-36100 (2016).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+polymorphisms+and+haplotype+in+the+region+of+TRIT1,+MYCL1+and+MFSD2A+with+the+risk+and+clinicopathological+features+of+gastric+cancer+in+a+southeast+Chinese+population.">Association of polymorphisms and haplotype in the region of TRIT1, MYCL1 and MFSD2A with the risk and clinicopathological features of gastric cancer in a southeast Chinese population.</a> Carcinogenesis. 34 (5), 1018-1024 (2013).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+the+candidate+tumor+suppressor+gene+TRIT1+in+human+lung+cancer.">Identification and functional characterization of the candidate tumor suppressor gene TRIT1 in human lung cancer.</a> Oncogene. 24 (35), 5502-5509 (2005).</li><li>Spinola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethnic+differences+in+frequencies+of+gene+polymorphisms+in+the+MYCL1+region+and+modulation+of+lung+cancer+patients'+survival.">Ethnic differences in frequencies of gene polymorphisms in the MYCL1 region and modulation of lung cancer patients' survival.</a> Lung Cancer. 55 (3), 271-277 (2007).</li><li>Read, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aggregation+of+Mod5+is+affected+by+tRNA+binding+with+implications+for+tRNA+gene-mediated+silencing.">Aggregation of Mod5 is affected by tRNA binding with implications for tRNA gene-mediated silencing.</a> FEBS Letters. 591 (11), 1601-1610 (2017).</li><li>Waller, T. J., Read, D. F., Engelke, D. R., Smaldino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+tRNA-modifying+protein,+TRIT1,+forms+amyloid+fibers+in+vitro.">The human tRNA-modifying protein, TRIT1, forms amyloid fibers in vitro.</a> Gene. 612, 19-24 (2017).</li><li>Suzuki, G., Shimazu, N., Tanaka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+prion,+Mod5,+promotes+acquired+drug+resistance+and+cell+survival+under+environmental+stress.">A yeast prion, Mod5, promotes acquired drug resistance and cell survival under environmental stress.</a> Science. 336 (6079), 355-359 (2012).</li><li>Soderberg, T., Poulter, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+dimethylallyl+diphosphate:tRNA+dimethylallyltransferase:+site-directed+mutagenesis+of+highly+conserved+residues.">Escherichia coli dimethylallyl diphosphate:tRNA dimethylallyltransferase: site-directed mutagenesis of highly conserved residues.</a> Biochemistry. 40 (6), 1734-1740 (2001).</li><li>Lamichhane, T. N., Blewett, N. H., Maraia, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+and+diversity+of+tRNA+anticodon+determinants+of+substrate+recognition+by+eukaryotic+A37+isopentenyltransferases.">Plasticity and diversity of tRNA anticodon determinants of substrate recognition by eukaryotic A37 isopentenyltransferases.</a> Rna. 17 (10), 1846-1857 (2011).</li><li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+tRNA+modification+isopentenyl-A37+alters+mRNA+decoding+and+causes+metabolic+deficiencies+in+fission+yeast.">Lack of tRNA modification isopentenyl-A37 alters mRNA decoding and causes metabolic deficiencies in fission yeast.</a> Molecular and Cellular Biology. 33 (15), 2918-2929 (2013).</li><li>Laten, H., Gorman, J., Bock, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isopentenyladenosine+deficient+tRNA+from+an+antisuppressor+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Isopentenyladenosine deficient tRNA from an antisuppressor mutant of Saccharomyces cerevisiae.</a> Nucleic Acids Research. 5 (11), 4329-4342 (1978).</li><li>Etcheverry, T., Colby, D., Guthrie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+precursor+to+a+minor+species+of+yeast+tRNASer+contains+an+intervening+sequence.">A precursor to a minor species of yeast tRNASer contains an intervening sequence.</a> Cell. 18 (1), 11-26 (1979).</li><li>Yan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-throughput+quantitative+approach+reveals+more+small+RNA+modifications+in+mouse+liver+and+their+correlation+with+diabetes.">A high-throughput quantitative approach reveals more small RNA modifications in mouse liver and their correlation with diabetes.</a> Analytical Chemistry. 85 (24), 12173-12181 (2013).</li><li>Su, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+ribonucleoside+modifications+in+tRNA+by+HPLC-coupled+mass+spectrometry.">Quantitative analysis of ribonucleoside modifications in tRNA by HPLC-coupled mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 9 (4), 828-841 (2014).</li><li>Jonkhout, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+modification+landscape+in+human+disease.">The RNA modification landscape in human disease.</a> Rna. 23 (12), 1754-1769 (2017).</li><li>Dominissini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dynamic+N(1)-methyladenosine+methylome+in+eukaryotic+messenger+RNA.">The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA.</a> Nature. 530 (7591), 441-446 (2016).</li><li>Meyer, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+mRNA+methylation+reveals+enrichment+in+3'+UTRs+and+near+stop+codons.">Comprehensive analysis of mRNA methylation reveals enrichment in 3' UTRs and near stop codons.</a> Cell. 149 (7), 1635-1646 (2012).</li><li>Squires, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+occurrence+of+5-methylcytosine+in+human+coding+and+non-coding+RNA.">Widespread occurrence of 5-methylcytosine in human coding and non-coding RNA.</a> Nucleic Acids Research. 40 (11), 5023-5033 (2012).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+mapping+reveals+widespread+dynamic-regulated+pseudouridylation+of+ncRNA+and+mRNA.">Transcriptome-wide mapping reveals widespread dynamic-regulated pseudouridylation of ncRNA and mRNA.</a> Cell. 159 (1), 148-162 (2014).</li><li>Schwartz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+mapping+reveals+a+conserved,+widespread,+dynamic+mRNA+methylation+program+in+yeast+meiosis.">High-resolution mapping reveals a conserved, widespread, dynamic mRNA methylation program in yeast meiosis.</a> Cell. 155 (6), 1409-1421 (2013).</li><li>Behm-Ansmant, I., Helm, M., Motorin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+specific+chemical+reagents+for+detection+of+modified+nucleotides+in+RNA.">Use of specific chemical reagents for detection of modified nucleotides in RNA.</a> Journal of Nucleic Acids. 2011, 408053 (2011).</li><li>Novikova, I. V., Hennelly, S. P., Sanbonmatsu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+structures+of+long+noncoding+RNAs.">Tackling structures of long noncoding RNAs.</a> International Journal of Molecular Sciences. 14 (12), 23672-23684 (2013).</li></ol>

Hücresel ve organizma işlevinde her zamankinden daha fazla önemli ve farklı rolleri oynamak için gösterilecek RNA değişiklikler devam. Bu nedenle, enzimler değiştirme RNA sorgulamaya deneyleri gelişimi biyoloji temel yönlerini daha iyi anlamak için merkezi bir noktada bulunuyor. Bu iletişim kuralı Mod5 tRNA değişiklik etkinliği karakterize etmek için yüksek çözünürlüklü vitro tahlil açıklar.
Bu iletişim kuralının isopentenylation bir doğrudan ve kolay y...

En azından 163 ayrı posttranscriptional RNA değişiklikler, farklı ve içerik bağımlı işlevler için RNA'ların veriyor, doğrudan RNA yapısını etkileyen ve diğer RNA'ın etkileşimleri etkileyen bu değişiklikler ile tespit edilmiştir molekülleri1,2. Sayısı ve çeşitliliği RNA değişiklikler için takdir arttıkça, güvenilir bir şekilde RNA Modifikasyon ve onları katalizler enzimler sorguya çekebiliriz deneyleri geliştirmek için önemlidir.
TRNA, bitişik Anti-kodonu 3' yan3,4temel 37 at tespit edilmesi için ilk RNA değişiklikler oluşur. Bir isopentenyl grubu dimethylallylpyrophosphate (DMAPP) adenozin 37 N6 konuma aktarılır (ben6A37) bir alt kümesi sitoplazmik ve mitokondrial tRNA 3,5 . Ben6A37 geliştirir çeviri sadakat ve verimliliği artırarak tRNA'ın benzeşme ribozom4,6 ve6A37 stres tepkisi bakteri7için önemli. Bu değişikliği gerçekleştirmek enzim tRNA isopentenyl Transferazlar denir ve bakteri8,9, mantarlar10, solucanlar11, bitkiler12ve daha yüksek Ökaryotlar13 son derece korunmuş , insanlar14dahil olmak üzere.
İnsan tRNA isopentenyl transferaz gen, TRIT1, mutasyonların insan hastalığı ile ilişkilidir. Örneğin, TRIT1 bir mutasyon büyük olasılıkla mitokondrial protein sentez15,16bir kusur nedeniyle şiddetli bir mitokondriyal hastalığı ile ilişkilidir. Ayrıca, TRIT1 bir tümör baskılayıcı gen17,18 açıklanan ve melanom19, meme20, gastrik21ve akciğer kanserleri22 de dahil olmak üzere kanserlerinin bazı türleri karıştığı ,23. Son olarak, TRIT1 ve Mod5 (Saccharomyces cerevisiae) isopentenyl Transferazlar deli dana gibi amiloid lifleri24,25,26toplama eğilimli proteinleri vardır. Her ne kadar bunun için doğrudan kanıt değil henüz gösterilen bu gözlemler potansiyel tRNA isopentenyl Transferazlar nörodejeneratif hastalıklarda işe bulaştırmak.
İsopentenyl Transferazlar bir isopentenyl transferaz aktivitesini çeviri ve hastalık, doğrudan6ölçmek yöntemleri oynadıkları rolü göz önüne alındığında bu enzimler Normal'in altında ve hastalık durumlarında bir mekanik anlamak için önemlidir. Yöntemleri giderek artan sayıda vitro isopentenylation deneyleri, pozitif hibridizasyon dahil olmak üzere6A RNA değişiklik ben algılamak kullanılabilir ben yokluğunda (PHA6) deneyleri,6ince katman Kromatografi (TLC), amino asit kabul aktivite deneyleri ve kütle spektrometresi yaklaşımlar (Ref. 4yorum).
Bir vitro isopentenylation tahlil 14C-DMAPP ve etiketsiz tRNA kullanır nitelendirdi. Bu tahlil, radyoaktif karbon 14C-DMAPP tarafından isopentenyl transferaz RNA aktarılır. Bu tahlil son derece hassas olmakla birlikte, genellikle bu belirli kalıntı9,20,27değiştiren belirlemek zordur. PHA6 deneyleri itimat hantal üzerinde ben6A değiştirme değiştirilmiş kalıntı kapsayan bir 32P olarak etiketlenmiş sonda hibridizasyon ile müdahale. Bu nedenle, hibridizasyon bir i yokluğunda büyük6bir değişiklik18,28,29. PHA6 deneyleri son derece hassas ve hücresel lysates çıkarılan toplam RNA analiz yeteneğine sahip. Ayrıca, sondalar özel ilgi RNA tasarlamak için bu yöntemi önemli hedef esneklik sağlıyor. Ancak, PHA6 deneyleri artıkları sonda hedeflenen bölge içinde oluşur ve bu nedenle Roman değişiklik siteleri tanımlamak daha az muhtemel değişiklikler karakterizasyonu için sınırlıdır. Buna ek olarak, bağlama yokluğu modifikasyonu göstergesidir gibi diğer değişiklikler veya RNA bağlama etkiler mutasyonlar veri analizi yıkmak da.
Başka bir yaklaşım Benzil DEAE selüloz (BD) selüloz kromatografi tRNA30olarak6A değişiklikleri amino asit kabul aktivite olarak ben, bir okuma ile birleştirir. Bu yaklaşım doğrudan işlev deneyi ' nın6A değişiklik, ama ben6A değişiklik algılamak için dolaylı bir yaklaşımdır ve çözünürlük RNA içinde belirli bir kalıntı değişiklikler eşlemek için yoksun. TLC yaklaşım toplam tRNA algılamak için kullanılan ben6A değişiklikler. Bu yaklaşımda, dahili olarak 32tRNA P olarak etiketlenmiş tek nükleotid sindirmek ve iki boyutlu TLC analiz isopentenylation tanımlamak için kullanılır. Bu yaklaşım son derece hassas saptamada toplam6A belirli bir RNA örnek ama sindirim tüm sırası bilgi kaybolmadı; Böylece, araştırmacı hiçbir şekilde hangi artıkları değiştirilmiş31olmuştur saptayacak yeterliliğe sahip değildir.
Daha yakın zamanlarda, sıvı kromatografi-tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) yöntemleri kantitatif tür hücre tipleri ve deneysel koşullar32,33arasında toplam RNA Modifikasyon karşılaştıran geliştirilmiştir, 34. Bu metodoloji sınırlamasından kimlik ve hangi değiştirilmiş nükleozit yapıldı RNA içinde pozisyon34türetilmiş belirlemek daha az yetenekli olmasıdır. Ayrıca, uzmanlık ve ekipman bu deneyler yürütmek için gerekli bu yaklaşım pratiklik sınırlayın.
Buna ek olarak, bazı yeni nesil sıralama teknolojileri RNA Modifikasyon transcriptome çapında34eşlemek için geliştirilmiştir. Immunoprecipitation RNA'lar ile antikor belirli bir değişiklik (RIP-Seq) belirli bir belirli değişiklik35,36içeren tüm serileri tanımlamak için Dedektif etkinleştirin. Ayrıca, ters transkriptaz tabanlı yaklaşımlar Kimya-Seq ve rasgele uyuşmazlığı sıralama gibi ters transkripsiyon tepki değiştirilmiş artıkları37,38,39tedirginlikler güveniyor. RNA Modifikasyon transcriptome çapında eşlemek için bu tekniklerin avantaj rağmen RIP-seq ve kimya-Seq teknolojileri güvenilir antikor veya reaktif kimyasallar belirli her değişiklik için sırasıyla34mevcut eksikliği ile sınırlıdır. Ayrıca, ters transkriptaz enzimler Kimya-Seq gerçekleştirmek için gereken ve rasgele uyuşmazlığı sıralama teknikleri istikrarlı RNA yapılar tarafından engellemiştir. TRNA çok değiştirilmiş ve yapısal istikrarlı yapısı onları bu teknikleri kullanarak sorguya çekmek özellikle zor olun. Bugüne kadar yeni nesil teknolojileri dayandırılmış henüz6değişiklikler34ben eşlemek için kullanılmıştır değil.
Burada, ben6A tRNA değişiklikler içinde vitroalgılamak için basit ve doğrudan bir yaklaşım açıklar. Kuluçka RNA'lar ile rekombinant S. cerevisiae isopentenyl transferaz (Mod5), ardından RNase T1 sindirim ve 1 boyutlu jel elektroforez analiz6A değişiklikler ben eşlemek için bu yöntemi kullanır. Bu yaklaşım doğrudan ve verileri çözümlemek için küçük özel uzmanlık gerektirir. Ayrıca, bu yöntem diğer RNA enzimler, kovalent değiştirmek RNA ya da RNA'ın hareketlilik bir jel ile molekül ağırlığı enzimler de dahil olmak üzere değiştirme için uyarlanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:677px;" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">UreaGel Concentrate</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Diluent</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">UreaGel Buffer</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">10x TBE</td>
			<td style="width:176px;">National Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">EC-833</td>
			<td>As part of a kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ammonium persulfate (APS)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7727-54-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethylethylenediamine (TMED)</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Tris base</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10043-35-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">EDTA</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-00-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ATP</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">34369-07-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:216px;">MgCl2</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">7786-30-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMAPP</td>
			<td style="width:176px;">Caymen Chemical</td>
			<td style="width:119px;">1186-30-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Super RNaseIN</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM2694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">60-24-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">64-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodiume acetate</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">127-09-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rnase T1</td>
			<td style="width:176px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">EN0541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glycerol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">56-81-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Xylene cyanol</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">2650-17-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment and Supplies</td>
			<td style="width:176px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Short glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Long glass plates (20-40 cm W x 40 cm L)</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vertical gel apparatus</td>
			<td style="width:176px;">The Gel Company</td>
			<td style="width:119px;">S2-3040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">50 mL disposable syringe</td>
			<td style="width:176px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">03-377-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stainless steel binder clips</td>
			<td style="width:176px;">Idea Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phosphoscreen</td>
			<td style="width:176px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-74</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic wrap</td>
			<td style="width:176px;">(local grocery store)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro assay to detect trna-isopentenyl transferase activity

N6- isopentenyladenosine RNA değişiklikleri işlevsel olarak farklı ve prokaryot ve ökaryotlar arasında son derece korunmuş. En son derece korunmuş N6- isopentenyladenosine değişiklikler biri A37 konumunu tRNA bir alt oluşur. Bu değişiklik çeviri ve sadakat tRNA benzeşim ribozom artırarak artırır. Mutasyon bu değişiklik ökaryotlarda sorumlu enzim mitokondrial disfonksiyon ve kanser de dahil olmak üzere çeşitli hastalık durumlarında ile ilişkilidir. Bu nedenle, substrat özgüllüğü ve biyokimyasal faaliyetleri Bu enzimlerin anlama normal ve patolojik ökaryotik biyoloji anlamak için önemlidir. Yöntemleri çeşitli bir dizi6A değişiklikler ben karakterize etmek için istihdam edilmiştir. Burada olduğunu isopentenylation Mod5 tarafından algılanması için doğrudan bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem RNA'ların kuluçka ardından RNase T1 sindirim ve ben6A değişiklikleri algılamak için 1 boyutlu jel elektroforez analiz bir rekombinant isopentenyl transferaz ile kullanır. Buna ek olarak, bu protokolün diğer RNA enzimler karakterize etmek için potansiyel uyum ele alınmıştır.

Mod5 Tirozin ile inkübe tRNA ya da serin tRNA varlığı veya yokluğu DMAPP. Değişiklik reaksiyon ürünleri hangi tüm guanosines bir 3' guanozin monophosphates (GMP)24 (Şekil 1) bırakarak 3' sonu cleaves RNase T1 sindirilmiş. RNA'ların tam sindirim, sonra bir % 20 polyacrylamide jel denaturing çözümlenir radiolabeled parçacıkları (Şekil 2A), tahmin edilebilir bir desen olu...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity at JoVE.com

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Burada, maya RNA-modifiye enzim, Mod5, biyokimyasal karakterizasyonu için bir iletişim kuralı tanımlamak ve nasıl diğer RNA enzimler için bu iletişim kuralı uygulanırsa tartışıyorlar.

TRNA-Isopentenyl transferaz aktivite tespit etmek için bir In Vitro tahlil

N6-isopentenyladenosine RNA modifications are functionally diverse and highly conserved among prokaryotes and eukaryotes. One of the most highly conserved ...

Bu protokolün genel amacı biyokimyasal olarak tRNA-Isopentenyl Transferaz Aktivitesi In Vitro karakterize etmektir. Bu yöntem, saflaştırılmış rekombinant enzimlerin tRNA-isopentenil transferaz aktivitesinin in-vitro saptanması ve karakterizasyonu için yararlıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı kovalent RNA modifikasyonu algılamak için kullanılan basit ve doğrudan bir teşpolmasıdır.Bu yöntem tRNA-isopentenil transferaz aktivitesine ışık sağlasa da, geniş aralıktaki biyokimyasal karakterizasyonu veya RNA modifiye enzimleri için potansiyel olarak uyarlanabilir. Bu işlemin ilk adımı iyice jel döküm için kullanılacak cam plakaları temizlemektir. Tabakları sabun ve suyla yıkayın, deiyonize suyla iyice durulayın ve sonra plakaları isopropanol ve tüy bırakmayan mendillerle temizleyin.Sonra, plakaları ve spacers monte edin. 100 mililitre %20 akrilamid, 7.5 azı dişi üre, 1x TBE jel yapmak için aşağıdaki reaktifleri karıştırın. Üre jel konsantresi 80 mililitre, üre jel diluent 10 mililitre, ve üre jel tampon 10 mililitre.Karışıma 40 mikrolitre T-med ve 800 mikrolitre taze hazırlanmış %10 amonyum persülfat ekleyin. Jel çözeltisini büyük bir şırıngaya çekin ve kabarcık oluşumunu önlemek için çözeltiyi dağıtırken cam plakaları arasında jel çözeltisini dağıtın. Jel in oda sıcaklığında 30 dakika katılaşmak için izin verin.Jel katılaşmış sonra, dikey bir jel aparat üzerine jel bitki. Üst ve alt tampon bölmelerini 1x TBE ile doldurun. Jeli yüklemeden iki saat önce, tampon sınırın en küçük oligonükleotidleri çalıştırabilmesi için jeli 20 miliamperde iki saat önceden çalıştırın.RNA isopentenylation tahlil için her reaksiyon hazırlamak 17 mikrolitre son bir hacim. Her tüp 50 milimolor Tris-HCl, pH 7.2, 1.2 milimolar ATP, 5.8 milimolar magnezyum klorür, 0.2 milimolar DMAPP, 10 adet RNase inhibitörü, 40, 000 CPM dahili 32P etiketli RNA, 5.3 micromolar Mod5 ve 1.2 milimolar 2-mercaptoeolol ekleyin. Reaksiyonları 37 derecede bir saat kuluçkaya yatırın.Bir saat sonra, etanol% 100 etanol 2.5 hacmi ve 3.5 molar sodyum asetat pH 5.5 1/10 hacmi kullanarak RNase çökelti ve negatif 20 derece santigrat bir gecede yerleştirin. Daha sonra, RNA örneklerini 15, 400 g ve 4 santigrat derecede 20 dakika santrifüj edin. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve her RNA peletini %70 etanol500 mikrolitre ile yıkayın.Örnekleri 15, 400 g ve 4 santigrat derecede beş dakika santrifüj edin. Supernatant'ı dikkatlice çıkarın ve RNA peletlerini 15 dakika veya tüm etanol buharlaşana kadar kurutun. Sonraki sekiz molar üre 10 mikrolitre her RNA pelet askıya.Her numuneye 150 adet RNase T1 ekleyin ve bir gecede 37 santigrat derecede kuluçkaya yatın. Ertesi gün, her numuneye iki mikrolitre 6x yükleme tamponu ekleyin. Her RNA örneğinin 10 mikrolitresini ön çalışma, %20 poliakrilamid, 7,5 molar üre jeli yükleyin.Jeli 25 miliamperde iki saat çalıştırın. İki saat sonra elektroforezi durdurun ve jeli cihazdan çıkarın. İki cam plaka arasındaki mührü kırın ve jel her iki plakaüzerinde kalan cam plakalardan birini dikkatlice çıkarın.Jel üzerine plastik bir sargı bir tabaka yerleştirin ve üç saat boyunca bir fosfor ekran üzerinde maruz. Bu protokol, S.cerevisiae isopentenyl tranferase Mod5 tarafından modifiye edilen hem kanonik hem de nonkanonik tRNA kalıntılarının izopentenilasyonunu güvenilir bir şekilde algılar. Bu örnekte tirozin tRNA dahili olarak 32P-adenozin ile etiketlenmiş ve Mod5 DMAPP varlığı veya yokluğunda RNase ile inkübe edilmiştir.RNA'lar RNase T1 ile sindirildi ve poliakrilamid jeli ile çözüldü. Mod5 DMAPP varlığında öngörülen kalıntı değiştirir ve kaydırılmış 10 nükleotit ile gösterilir, nükleozit pozisyonlarında parça içeren üçlü adenozin 36 için 38 tirozin tRNA parçası içerir. Modifiye adenozin 37 ikamet bir yıldız ile gösterilir.Benzer şekilde, serine tRNA Mod5 ve DMAPP ile kuluçkaya yatırıldığında, nükleozit pozisyonunda 36 ile 38 arasında parça içeren 10 nükleotit üçlü adenozinin tam bir kayması gözlenmektedir. İlginçtir ki, nükleozit pozisyonlarında 36 ile 38 arasında üçlü adenozin içeren üçlü adenozin içermeyen yedi nükleotit parçasının kısmi kayması gözlenir, bu da nükleozit pozisyonunda 36 ile 38 diziarasında parça içeren üçlü adenozinin ve mod5 in vitro aktivitesi için yapının gerekli olmayabileceğini düşündürmektedir. Bir kez bu teknik ustalanınca düzgün bir şekilde yapılırsa iki, dört ila altı saat gün sürer.RNA bozulması RNA modifikasyonunu etkileyebileceğinden ve veri yorumlanmasını bozabileceğinden, bu yordamı denemek RNA'nın bütünlüğünü korumak ve izlemek önemlidir. Bu prosedürün ardından ilgi enzimini kullanarak mutasyonel çalışmalar, enzimatik aktivite için gerekli olan belirli kalıntıları veya etki alanlarını belirlemek için yapılabilir. Bu teknik, gelişiminden sonra, prokaryotik ve ökaryotik enzimlerin tRNA-isopentenil transferaz aktivitelerini söylemek için RNA biyolojisi alanında araştırmacılariçin yol açtı.Bu videoyu izledikten sonra, ilgi enzimisopentenil transferaz aktivitesinin tespiti için protokolü nasıl uygulayacağınızı iyi anlamak gerekir. Radyoaktivite ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve uygun PPE takma, yeterli koruma kullanımı ve radyoaktivitenin düzgün bir şekilde atılması gibi önlemlerin her zaman bu işlemi gerçekleştirirken alınması gerektiğini unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

An In Vitro Assay to Detect tRNA-Isopentenyl Transferase Activity

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

pH bağımlı aktivitenin tespiti<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; İn Vitro</em&gt; ve<em&gt; İn Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

A Fluorescence-based Assay of Phospholipid Scramblase Activity

Fosfolipid Scramblase Aktivitesinin bir floresan bazlı analiz

Scramblases translocate phospholipids across the membrane bilayer bidirectionally in an ATP-independent manner. The first scramblase to be identified and ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Quantification of Hypopigmentation Activity In Vitro

Miktar hipopigmentasyon aktivitesinin in Vitro

This study presents laboratory methods for the quantification of hypopigmentation activity in vitro. Melanin, the major pigment in melanocytes, is ...

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

A Colorimetric Assay of Citrate Synthase Activity in Drosophila Melanogaster

Drosophila Melanogaster'de Sitrat Synthase Aktivitesinin Kolorimetrik Tsöplini

Mitochondria play the most prominent roles in cellular metabolism by producing ATP through oxidative phosphorylation and regulating a variety of ...

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

An In Vitro Single-Molecule Imaging Assay for the Analysis of Cap-Dependent Translation Kinetics

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

Cap-dependent protein synthesis is the predominant translation pathway in eukaryotic cells. While various biochemical and genetic approaches have allowed ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

DetectSyn: A Rapid, Unbiased Fluorescent Method to Detect Changes in Synapse Density

DetectSyn: Sinaps Yoğunluğundaki Değişiklikleri Tespit Etmek için Hızlı, Tarafsız Bir Floresan Yöntemi

Synapses are the site of communication between neurons. Neuronal circuit strength is related to synaptic density, and the breakdown of synapses is ...

Measuring Caspase Activity Using a Fluorometric Assay or Flow Cytometry

Florometrik Tahlil veya Akış Sitometrisi Kullanarak Kaspaz Aktivitesinin Ölçülmesi

The activation of cysteine proteases, known as caspases, remains an important process in multiple forms of cell death. Caspases are critical initiators ...