Name: orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study pd-l1 expression
Uploaded: 2019-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression at JoVE.com

Les auteurs aimeraient remercier Safia Zahma pour son aide avec la préparation des coupes de tissus.

Tous les protocoles expérimentaux comme indiqué ci-dessous suivent les directives éthiques et ont été approuvés par le ministère fédéral autrichien de la Science, la recherche et l’économie.
Remarque : Le protocole ici décrit un modèle orthotopique de transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris dans syngéniques bénéficiaires. Les cellules peuvent être isolées des poumons avec tumeur de KrasLSL-G12D: p53fl/fl (KP) ...

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	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Zappa, C., Mousa, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer:+current+treatment+and+future+advances.">Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances.</a> Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).</li><li>Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics/Pharmacodynamics+of+Pulmonary+Delivery+of+Colistin+against+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+Mouse+Lung+Infection+Model.">Pharmacokinetics/Pharmacodynamics of Pulmonary Delivery of Colistin against Pseudomonas aeruginosa in a Mouse Lung Infection Model.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (3), (2017).</li><li>Wegesser, T. C., Last, J. 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Afin d’étudier les manifestations physiologiques et pathologiques de poumon dans le poumon, méthodes intubation par voie intratrachéale invasive et non invasive pour l’instillation de différents réactifs sont largement utilisé26,27,28,29 ,30,31,32. Dans le domaine du cancer, les c...

Cancer du poumon est toujours de loin le plus grand tueur de liés au cancer dans les hommes et les femmes1. En effet, selon l’American Cancer Society, chaque année plus de personnes meurent du cancer du poumon que du cancer du sein, la prostate et du côlon cancer ensemble1. Jusqu'à récemment, la majorité des patients souffrant de cancer de poumon non à petites cellules (NSCLC), qui est le plus abondant sous-type de cancer du poumon, ont été traitée avec une chimiothérapie à base de platine dans un cadre de première ligne, principalement avec l’ajout de l’angiogenèse inhibiteurs de la2. Seulement un sous-ensemble de patients recèle oncogènes mutations dans le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR), kinase de lymphome anaplasique (ALK), ou dans ROS1 et peut être traité avec disponible ciblant médicaments3,4. Avec l’avènement des inhibiteurs de la point de contrôle immunitaire, nouvel espoir pour les patients atteints de cancer du poumon a été soulevée, même si jusqu'à présent, seulement 20 à 40 % des patients répondent à l’immunothérapie5. Par conséquent, plus recherche est nécessaire pour améliorer ce résultat en thérapie immunitaire de point de contrôle de réglage fin et d’étudier les options de traitement combinatoire.
Pour étudier le cancer du poumon, une vaste gamme de modèles précliniques sont disponible, y compris les modèles spontanés déclenché par des produits chimiques et les agents cancérigènes et les souris génétiquement modifiée modèles (GEMM) où autochtones tumeurs surviennent suite à l’activation conditionnelle d' oncogènes et/ou l’inactivation du suppresseur de tumeur gènes6,7,8. Ces modèles sont particulièrement utile pour étudier les processus fondamentaux dans le développement de tumeurs du poumon, mais elles exigent également une vaste souris d’élevage, et expériences sont coûteuses en temps. Par conséquent, plusieurs études évaluant les inhibiteurs potentiels Profitez des modèles de xénogreffes de (patient dérivés) sous-cutané où lignées de cellules cancéreuses du poumon humain sont injectées par voie sous-cutanée de souris immunodéficientes9.
Dans ces modèles, le micromilieu des tumeurs n’est pas représenté en conséquence ; par conséquent, les chercheurs utilisent aussi des modèles de transplantation orthotopique, où les cellules tumorales sont injectées par voie intraveineuse, intrabronchially ou directement dans le poumon parenchyme10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Certaines de ces méthodes sont techniquement difficiles, difficiles à reproduire et nécessitent une formation intensive des chercheurs. 21 ici, nous avons adapté un orthotopique non invasif, méthode de transplantation par voie intratrachéale chez les souris immunocompétentes, où les tumeurs se développent dans les 3 à 5 semaines et présentent une similitude importante de tumeurs humaines, à induire l’expression de la T-cellule suppresseur programmé mort-ligand 1 (PD-L1) sur les cellules tumorales. 11 , 12 , 20 l’utilisation de cellules de tumeur de souris provenant de modèles GEMM et souris destinataires syngéniques permet une étude appropriée du microenvironnement tumoral, y compris les cellules immunitaires. En outre, gène outils comme CRISPR/Cas9 technologie22 d’édition peut être utilisé in vitro avant la transplantation qui facilite la recherche sur l’impact des facteurs génétiques dans la tumorigenèse du poumon.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:663px;" width="664">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:255px;">mouse lung adenocarcinoma cell line</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">isolated in house</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:255px;">C57Bl/6 mice</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:255px;">129S mice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11544446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11573397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11539876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11560626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketasol (100 mg/ml Ketamine)</td>
			<td style="width:123px;">Ogris Pharma</td>
			<td style="width:119px;">8-00173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Xylasol (20 mg/ml Xylazine)</td>
			<td style="width:123px;">Ogris Pharma</td>
			<td style="width:119px;">8-00178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">BD Insyste (22GA 1.00 IN)</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">381223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Blunt forceps</td>
			<td style="width:123px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS8260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Leica CLS150 LED</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">30250004</td>
			<td>Fibre Light Illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Student Iris Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I (RNase-Free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:123px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">25-5982-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:123px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">25-4321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study pd-l1 expression

L’utilisation de modèles murins est indispensable pour l’étude de la physiopathologie des maladies diverses. En ce qui concerne le cancer du poumon, plusieurs modèles sont disponibles, y compris les organismes génétiquement machiné des modèles ainsi que les modèles de la transplantation. Cependant, les modèles de souris génétiquement modifiées sont long et coûteux, que certains modèles de transplantation orthotopique sont difficiles à reproduire. Ici, une méthode de livraison non invasif par voie intratrachéale de cellules de tumeur du poumon comme un modèle de transplantation orthotopique alternative est décrite. L’utilisation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris et receveurs de greffe syngénique permet à étudier la tumorigenèse sous la présence d’un système immunitaire pleinement active. En outre, les manipulations génétiques de tumeur cellules avant transplantation rend ce modèle une approche intéressante de gagner du temps pour étudier l’impact des facteurs génétiques sur la croissance tumorale et l’expression des gènes cellulaires tumorales profils dans des conditions physiologiques. En utilisant ce modèle, nous montrons ce poumon cellules d’adénocarcinome express niveaux accrus de l’éliminateur de lymphocytes programmé mort-ligand 1 (PD-L1) lorsqu’il est cultivé dans leur milieu naturel par rapport à la culture in vitro.

Nous avons utilisé le modèle de transplantation orthotopique par livraison de cellules tumorales par voie intratrachéale pour tester si le microenvironnement tumoral stimule expression PD-L1. Par conséquent, nous avons isolé cellules pulmonaires AC souris du modèle KP autochtone (cellules de KP), dix semaines après induction tumorale via Cre recombinase-exprimant l’adénovirus (Ad.Cre) livraison24. Par la suite, nous avons marqué le poumon cellules AC en ...

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Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression (Video) | JoVE 

Orthotopic Transplantation de cellules d’adénocarcinome pulmonaire syngénique pour étudier l’Expression des PD-L1

Nous décrivons ici un modèle de transplantation orthotopique syngénique minimalement invasives des cellules d’adénocarcinome pulmonaire souris comme un modèle de temps - et réduction des coûts pour étudier le cancer du poumon non à petites cellules.

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

La transplantation orthotopique des cellules d’adénocarcinome de poumon de souris dans les destinataires syngeneic de greffe permet l’étude de tumorigenesis en présence d’un système immunitaire entièrement actif dans des conditions physiologiques. Bien sûr, les tumeurs se développent en souris immunocompétence et c’est beaucoup plus physiologique que si vous effectuez une greffe chez des souris immunodéficientes. L’édition génétique des cellules tumorales avant une transplantation fait de ce modèle une approche directe et gain de temps pour étudier l’impact des facteurs génétiques sur la croissance tumorale et les profils d’expression génétique.Comparée aux modèles autochthonous inducibles de tumeur de poumon, cette méthode évite l’élevage étendu des souris, et représente donc un raffinement des modèles précédents de souris de cancer du poumon. Avant de commencer la procédure, utilisez des ciseaux pour enlever l’extrémité d’une aiguille de cathéter et pousser complètement le cathéter sur l’extrémité de l’aiguille. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement d’onteil, appliquez l’onguent aux yeux d’une souris anesthésiée et synergétique de huit à 12 semaines et accrochez les incisives supérieures au-dessus d’une corde de suture à travers une plate-forme d’intubation avec la poitrine perpendiculaire à la suture.Placez un câble à fibre optique entre les membres avant pour éclairer la poitrine et ouvrez soigneusement la bouche à l’aide de forceps plats désinfectés pour extraire la langue. Recherchez l’émission de lumière blanche pour localiser le larynx, l’épiglottis et les cartilages aryténoïdes. Une fois que l’ouverture de la trachée est clairement visible, glissez doucement le cathéter dans la trachée, jusqu’à la bifurcation, mais pas au-delà, pour garantir une distribution uniforme des cellules adénocarcinomes pulmonaires dans les poumons.Faites en sorte que l’insertion du cathéter soit très lisse. Si vous ressentez une résistance, retirez le cathéter et exposez à nouveau la trachée pour éviter de blesser la souris. Retirez rapidement l’aiguille du cathéter et vérifiez si la lumière blanche peut être observée brillant à travers le cathéter.Pour confirmer un bon placement du cathéter dans la trachée, fixez une seringue d’eau d’un millilitre au cathéter. L’eau de la seringue doit se déplacer rapidement de haut en bas à temps avec la respiration. Avant de livrer la suspension cellulaire, réchauffer les cellules à la main et charger 50 microlitres de cellules dans le cathéter.Dès que la suspension est aspirée, fixez une seringue vide d’un millilitre au cathéter et distribuez 300 microlitres d’air dans le cathéter pour assurer une distribution complète des cellules tumorales dans les poumons. Retirez ensuite délicatement le cathéter et placez la souris sur un coussin chauffant avec surveillance jusqu’à ce qu’elle soit complètement couchée. Après le point de terminaison expérimental approprié, tremper la carcasse dans 70% d’éthanol et fixer l’animal à une planche de dissection.Faire une incision ventrale midline et inverser doucement la peau pour exposer les muscles de la paroi thoracique et les organes abdominaux. Utilisez des ciseaux pour percer le diaphragme et couper les côtes, exposant la cavité thoracique. Couper une petite ouverture dans le ventricule gauche et utiliser une aiguille de calibre 27 pour parcourir le poumon trois fois à travers le ventricule droit avec six à huit millilitres de PVS glacé par perfusion.Après la dernière perfusion, les poumons doivent être complètement dégagés du sang et apparaître blancs. Après la récolte, utiliser des ciseaux pour émincer le tissu pulmonaire en petits morceaux. Transférer les fragments pulmonaires dans un tube de microcentrifugeuse de deux millilitres contenant 1,5 millilitres de tampon de digestion pulmonaire pendant une incubation de 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius, avec des secousses.À la fin de la digestion, transférer la suspension cellulaire à l’aide d’une passoire cellulaire de 70 microns dans un tube de 50 millilitres et utiliser l’extrémité d’un piston stérile de seringue de 10 millilitres pour presser les fragments de tissu restants à travers le filtre. Rincer la passoire avec 15 millilitres de PVS, complétées par 2% de FCS. Et recueillir les cellules par centrifugation.Suspendre à nouveau la pastille dans un millilitre de tampon de lyse de potassium au chlorure d’ammonium pendant une incubation de cinq minutes à température ambiante et centrifuger à nouveau les cellules. Puis re-suspendre la pastille de globules blancs dans un millilitre de PVS complété par 2%FCS et tacher les cellules pour l’analyse cytométrique de flux selon le protocole expérimental. Comme prévu, la survie des souris receveurs est corrélée au nombre de cellules greffées.Et les poumons récoltés au moment de la mort démontrent une distribution égale des nodules de tumeur dans tous les lobes. En comparant des sections des poumons hébergeant des tumeurs autochthonous, avec des tumeurs suivant les cellules orthotopiques transplantées de tumeur de poumon, aucune différence morphologique n’est observée. L’analyse cytométrique d’écoulement de l’expression de PD-L1 des cellules pulmonaires isolées trois semaines après transplantation orthotopique de cellules de tumeur dans les souris immunocompétentes, comme juste démontré, révèle up-regulation dans l’expression de marqueur de surface cellulaire de PD-L1, comparée aux cellules de tumeur de poumon culturenelle in vitro.Après la transplantation orthotopique, d’autres méthodes analytiques peuvent être appliquées, y compris l’analyse immunohistochimique, et le profilage de l’ARNm pour répondre à d’autres questions expérimentales.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure (Video) | JoVE 

Établissant double résistance à l’EGFR-TKI et rencontré-TKI dans le poumon adénocarcinome cellules In Vitro avec une procédure d’augmentation de la Dose 2-step

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation (Video) | JoVE 

Un modèle de souris syngénique Cancer du pancréas pour étudier les effets de l’électroporation irréversible

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer (Video) | JoVE 

Un modèle murin syngénique bioluminescentes et Fluorescent orthotopique du Cancer de la Prostate androgéno-dépendants et résistant à la Castration

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Immunophénotypage de homogreffe orthotopique (syngéniques) d’adénocarcinome Ductal pancréatique KPC primaires murines par cytométrie en flux

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients (Video) | JoVE 

Avec 22 3 anticorps Anti-PD-L1 se concentrent sur la biopsie et cytologie échantillons provenant de patients atteints de Cancer de poumon Non à petites cellules

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions (Video) | JoVE 

Isolement des cellules souches mésenchymateuses du tissu de pulpe et co-culture avec les cellules cancéreuses afin d’étudier leurs Interactions

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence (Video) | JoVE 

Caractérisation semi-automatique De MD-L1 et recensement des cellules tumorales circulantes de patients atteints d'immunofluorescence

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (Video) | JoVE 

Implantation orthotopique guidée par ultrasons de l'adénocarcinome ductal pancréatique murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate (Video) | JoVE 

Un modèle de rat Sprague Dawley d’ostéosarcome orthotopique syngénique avec amputation pour contrôler le taux de métastases

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...