Name: orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study pd-l1 expression
Uploaded: 2019-01-19T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare Safia Zahma per il suo aiuto con la preparazione delle sezioni del tessuto.

Tutti i protocolli sperimentali come indicato qui sotto seguono linee guida etiche e sono stati approvati dal Ministero federale austriaco della scienza, ricerca ed economia.
Nota: Il protocollo qui descrive un modello di trapianto ortotopico di cellule di adenocarcinoma del polmone del topo in syngeneic destinatari. Le cellule possono essere isolate dai polmoni del tumore-cuscinetto di KrasLSL-G12D: p53fl/fl (KP) topi7,...

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	<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+statistics,+2018.">Cancer statistics, 2018.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (1), 7-30 (2018).</li><li>Zappa, C., Mousa, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-small+cell+lung+cancer:+current+treatment+and+future+advances.">Non-small cell lung cancer: current treatment and future advances.</a> Translational Lung Cancer Research. 5 (3), 288-300 (2016).</li><li>Dolly, S. O., Collins, D. C., Sundar, R., Popat, S., Yap, T. 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G., Warawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intubation-mediated+intratracheal+(IMIT)+instillation:+a+noninvasive,+lung-specific+delivery+system.">Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation: a noninvasive, lung-specific delivery system.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52261 (2014).</li><li>Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Improved+Method+for+Rapid+Intubation+of+the+Trachea+in+Mice.">An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).</li></ol>

Per studiare gli eventi fisiologici e patologici del polmone nel polmone, metodi di intubazione endotracheale invasive e non invasive per l'instillazione di vari reagenti sono ampiamente usato26,27,28,29 ,30,31,32. Nel campo del cancro, i ricercatori usano l'intratracheale (e intranasale) i...

Cancro ai polmoni è ancora di gran lunga il più grande assassino di neoplasia in uomini e donne1. Infatti, secondo l'American Cancer Society, ogni anno più persone muoiono di cancro al polmone rispetto al seno, prostata e colon cancro insieme1. Fino a poco tempo, la maggior parte dei pazienti affetti da cancro del polmone non a piccole cellule (NSCLC), che è il sottotipo più abbondante del cancro del polmone, sono stata curata con la chemioterapia platino-basata in un ambiente di prima linea, per lo più con l'aggiunta dell'angiogenesi inibitori2. Solo un sottoinsieme dei pazienti porti mutazioni oncogeniche nel recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR), chinasi anaplastic di linfoma (ALK) o in ROS1 e può essere trattato con farmaci targeting disponibili:3,4. Con l'avvento degli inibitori di checkpoint immuni, nuova speranza per i malati di cancro del polmone è sorto, anche se fino ad ora, solo il 20-40% dei pazienti risponde alla terapia immune5. Quindi, ulteriore ricerca è necessaria per migliorare questo risultato di fine-tuning terapia immunitaria checkpoint e indagando le opzioni di trattamento combinatorio.
Per studiare il cancro del polmone, una vasta gamma di modelli preclinici sono disponibile, compresi i modelli spontanee innescato da prodotti chimici e agenti cancerogeni e geneticamente costruito del topo modelli (GEMM) dove i tumori autoctoni derivano dopo l'attivazione condizionale del oncogeni e/o l'inattivazione di tumore soppressore geni6,7,8. Questi modelli sono di particolare valore per indagare i processi fondamentali nello sviluppo del tumore del polmone, ma richiedono anche topi vasti allevamento, e gli esperimenti sono che richiede tempo. Di conseguenza, molti studi che valutano potenziali inibitori sfruttare modelli sottocutaneo dello xenotrapianto (paziente-derivato) dove linee cellulari del cancro del polmone umano vengono iniettati per via sottocutanea in topi immunodeficienti9.
In questi modelli, la micromilieu dei tumori non è rappresentato in conseguenza; quindi, i ricercatori usano anche modelli di trapianto ortotopico, dove le cellule del tumore sono iniettate per via endovenosa, intrabronchially o direttamente nel polmone parenchima10,11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20. Alcuni di questi metodi sono tecnicamente impegnativi, difficili da essere riprodotto e richiedono una formazione intensiva dei ricercatori. 21 qui abbiamo adattato un invasivo ortotopico, intratracheale metodo di trapianto in topi immunocompetenti, dove i tumori si sviluppano entro 3-5 settimane ed esibiscono le somiglianze significative di tumori umani, di indurre l'espressione della T-cellula soppressore programmata morte-legante 1 (PD-L1) sulle cellule del tumore. 11 , 12 , 20 l'uso delle cellule del tumore del mouse derivati da modelli di GEMM e topi syngeneic destinatari permette di studiare corretta del microambiente tumorale tra cui cellule del sistema immunitario. Inoltre, gene editing strumenti come CRISPR/Cas9 tecnologia22 può essere impiegato in vitro prima del trapianto che facilita l'indagine dell'impatto dei fattori genetici in tumorigenesis del polmone.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:663px;" width="664">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:255px;">mouse lung adenocarcinoma cell line</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">isolated in house</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:255px;">C57Bl/6 mice</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:255px;">129S mice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11544446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11573397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11539876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11560626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketasol (100 mg/ml Ketamine)</td>
			<td style="width:123px;">Ogris Pharma</td>
			<td style="width:119px;">8-00173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Xylasol (20 mg/ml Xylazine)</td>
			<td style="width:123px;">Ogris Pharma</td>
			<td style="width:119px;">8-00178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">BD Insyste (22GA 1.00 IN)</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">381223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Blunt forceps</td>
			<td style="width:123px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS8260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Leica CLS150 LED</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">30250004</td>
			<td>Fibre Light Illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Student Iris Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I (RNase-Free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:123px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">25-5982-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:123px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">25-4321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study pd-l1 expression

L'utilizzo di modelli murini è indispensabile per lo studio della fisiopatologia delle malattie varie. Per quanto riguarda il cancro del polmone, sono disponibili diversi modelli, tra cui geneticamente ingegnerizzati modelli così come i modelli di trapianto. Tuttavia, modelli murini geneticamente sono lunghe e costose, considerando che alcuni modelli di trapianto orthotopic sono difficili da riprodurre. Qui, un metodo di consegna intratracheale non invasiva delle cellule del tumore del polmone come un modello di trapianto ortotopico alternativo è descritto. L'uso di cellule di adenocarcinoma del polmone del topo e destinatari di trapianto syngeneic permette di studiare il tumorigenesis in presenza di un sistema immunitario pienamente attiva. Inoltre, le manipolazioni genetiche del tumore le cellule prima di trapianto rende questo modello un approccio attraente di risparmiare tempo per studiare l'impatto dei fattori genetici sulla crescita del tumore e l'espressione genica delle cellule di tumore profili in condizioni fisiologiche. Utilizzando questo modello, vi mostriamo quello polmone cellule dell'adenocarcinoma espresso livelli aumentati del soppressore T-cellula programmata morte-legante 1 (PD-L1) quando coltivate nel loro ambiente naturale rispetto alla coltivazione in vitro.

Abbiamo usato il modello di trapianto ortotopico via intratracheale consegna di cellule del tumore per verificare se il microambiente tumorale stimola l'espressione di PD-L1. Di conseguenza, abbiamo isolato cellule di topo polmone AC dal modello KP autoctono (cellule KP), 10 settimane dopo induzione del tumore tramite Cre-ricombinasi-espressione dell'adenovirus (Ad.Cre) consegna24. Successivamente, abbiamo etichettato il polmone cellule AC usando una proteina fluor...

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Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression (Video) | JoVE 

Trapianto orthotopic delle cellule dell'Adenocarcinoma del polmone Syngeneic studiare espressione PD-L1

Qui descriviamo un modello di trapianto orthotopic syngeneic minimamente invasiva delle cellule di adenocarcinoma del polmone del topo come un modello di tempo - e riduzione dei costi per studiare il cancro del polmone non a piccole cellule.

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

Il trapianto ortotopico di cellule adenocarcinoma polmonari del topo in riceventi di innesto sigeneico consente lo studio della tumorigenesi in presenza di un sistema immunitario pienamente attivo in condizioni fisiologiche. Naturalmente, i tumori si sviluppano in un topo immunocompetibile e questo è molto più fisiologico che se si esegue un trapianto in topi immunodifesa. L'editing genico delle cellule tumorali prima di un trapianto rende questo modello un approccio diretto e che fa risparmiare tempo per studiare l'impatto dei fattori genetici sulla crescita tumorale e sui profili di espressione genica.Rispetto ai modelli di tumore polmonare autoctono induttibile, questo metodo evita l'allevamento estensivo dei topi e rappresenta quindi un perfezionamento dei precedenti modelli di topo tumorale polmonare. Prima di iniziare la procedura, utilizzare le forbici per rimuovere l'estremità di un ago catetere e spingere completamente il catetere oltre l'estremità dell'ago. Dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, applicare un unguento agli occhi di un topo anestetizzato, sinergico di otto-12 settimane e agganciare gli incisivi superiori su una corda di sutura attraverso una piattaforma di intubazione con il petto perpendicolare alla sutura.Posizionare un cavo in fibra ottica tra gli arti anteriori per illuminare il petto e aprire con cura la bocca utilizzando forcelle piatte disinfettate per estrarre la lingua. Cerca l'emissione di luce bianca per localizzare la laringe, l'epiglottide e le cartilagine aritenoidi. Una volta che l'apertura della trachea è chiaramente visibile, far scivolare delicatamente il catetere nella trachea, fino alla biforcazione ma non oltre, per garantire una distribuzione uniforme delle cellule adenocarcinoma polmonari all'interno dei polmoni.Fare attenzione che l'inserimento del catetere sia molto fluido. Se si sente una resistenza, rimuovere il catetere ed esporre nuovamente la trachea per evitare di ferire il mouse. Rimuovere rapidamente l'ago dal catetere e verificare se la luce bianca può essere osservata brillare attraverso il catetere.Per confermare un corretto posizionamento del catetere all'interno della trachea, attaccare una siringa di un millilitro d'acqua al catetere. L'acqua nella siringa dovrebbe muoversi rapidamente su e giù nel tempo con la respirazione. Prima di fornire la sospensione cellulare, riscaldare le celle a mano e caricare 50 microlitri di cellule nel catetere.Non appena la sospensione viene aspirata, attaccare una siringa vuota da un millilitro al catetere e erogare 300 microlitri d'aria nel catetere per garantire una distribuzione completa delle cellule tumorali all'interno dei polmoni. Quindi rimuovere delicatamente il catetere e posizionare il mouse su un riscaldatore con monitoraggio fino alla piena rimessenza. Dopo l'endpoint sperimentale appropriato, immergere la carcassa nel 70% di etanolo e fissare l'animale a una scheda di dissezione.Fai un'incisione ventrale della linea mediana e inverti delicatamente la pelle per esporre i muscoli della parete toracica e gli organi addominali. Utilizzare le forbici per forare il diaframma e tagliare le costole, esponendo la cavità toracica. Tagliare una piccola apertura nel ventricolo sinistro e utilizzare un ago calibro 27 per perfondere il polmone tre volte attraverso il ventricolo destro con da sei a otto millilitri di PVS ghiacciato per infusione.Dopo l'ultima perfusione, i polmoni dovrebbero essere completamente chiari dal sangue e apparire bianchi. Dopo la raccolta, utilizzare le forbici per tritare il tessuto polmonare in piccoli pezzi. Trasferire i frammenti polmonari in un tubo di microcentrifugo a due millilitri contenente 1,5 millilitri di tampone di digestione polmonare per un'incubazione da 30 a 60 minuti a 37 gradi Celsius, con scuotimento.Al termine della digestione, trasferire la sospensione cellulare attraverso un colino cellulare da 70 micron in un tubo da 50 millilitri e utilizzare l'estremità di uno stantuffo sterile per siringhe da 10 millilitri per premere eventuali frammenti di tessuto rimanenti attraverso il filtro. Risciacquare il colino con 15 millilitri di PVS, integrato con 2%FCS. E raccogliere le cellule per centrifugazione.Sospendere nuovamente il pellet in un millilitro di tampone di lisi potassio cloruro di ammonio per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente e centrifugare nuovamente le cellule. Quindi sospendere nuovamente il pellet di globuli bianchi in un millilitro di PVS integrato con il 2%FCS e macchiare le cellule per l'analisi citometrica del flusso secondo il protocollo sperimentale. Come previsto, la sopravvivenza dei topi ricevente è correlata al numero di cellule innestati.E i polmoni raccolti al momento della morte dimostrano una distribuzione uniforme dei noduli tumorali in tutti i lobi. Quando si confrontano sezioni di polmoni che ospitano tumori autoctoni, con tumori che seguono cellule tumorali polmonari trapiantate ortotopicamente, non si osservano differenze morfologiche. L'analisi citometrica del flusso dell'espressione PD-L1 delle cellule polmonari isolate tre settimane dopo il trapianto di cellule tumorali ortotopiche in topi immunocompetenti, come appena dimostrato, rivela l'up-regulation nell'espressione del marcatore della superficie cellulare PD-L1, rispetto alle cellule tumorali polmonari coltivate in vitro.Dopo il trapianto ortotopico, possono essere applicati altri metodi analitici, tra cui l'analisi immunoistochimica e la profilazione dell'mRNA per affrontare ulteriori domande sperimentali.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure (Video) | JoVE 

Che istituisce la doppia resistenza all'EGFR-TKI e incontrato-TKI nel polmone Adenocarcinoma cellule In Vitro con una procedura 2-passo Dose-escalation

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

Atterramento condizionale dell'espressione genica in linee cellulari del cancro per studiare il reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation (Video) | JoVE 

Un modello murino di cancro del pancreas Syngeneic per studiare gli effetti dell'elettroporazione irreversibile

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

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Un modello murino Syngeneic Orthotopic bioluminescenti e fluorescente di carcinoma della prostata androgeno-dipendente e castrazione-resistente

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients (Video) | JoVE 

Utilizzando 22 3 dell'anticorpo Anti-PD-L1 concentrarsi sulla biopsia e campioni di citologia dai malati di cancro del polmone Non a piccole cellule

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions (Video) | JoVE 

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence (Video) | JoVE 

Caratterizzazione semiautomatica PD-L1 ed enumerazione delle cellule tumorali circolanti da pazienti affetti da cancro del polmone a cellule non piccole mediante immunofluorescenza

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (Video) | JoVE 

Impianto ortotopico a ultrasuoni dell'adenocarcinoma dugalese Murine

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate (Video) | JoVE 

Un modello di ratto sprague Dawley ortotopico singenico con amputazione per controllare il tasso di metastasi

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...