Name: orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study pd-l1 expression
Uploaded: 2019-01-19T13:00:00
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著者は、ティッシュ セクションの準備で彼女の助けのサフィア Zahma を感謝したいです。

下を通りのすべて実験的プロトコルは倫理的なガイドラインに従ってくださいし、オーストリア連邦省の科学、研究および経済によって承認されました。
注:ここでのプロトコルは、同系の受信者にマウス肺腺癌細胞の同所性同種移植モデルをについて説明します。セルは KrasLSL G12Dの腫瘍肺から分離することが: p53フロリダ州/フロリダ(KP) マ?...

<ol>
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肺の肺生理学的および病理学的イベントを研究するには、様々 な試薬の注入のための侵襲的、非侵襲的な気管内挿管法が広く使われている26,27,28,29 ,30,31,32。がん分野で研究者は、気管を使用 (および鼻腔内) 肺上皮細?...

肺がんは男性と女性の両方の1で最大の癌関連キラーではまだまだです。確かに、アメリカの癌協会によると毎年多くの人々 は胸、前立腺および結腸癌の一緒に1のよりも肺癌で死ぬ。肺がんの最も豊富なサブタイプは、非小細胞肺癌 (NSCLC) 患者の大半が血管新生の主の最初の行設定でプラチナ ベースの化学療法で治療された最近まで、阻害剤2。患者のサブセットのみ未分化リンパ腫キナーゼ (アルク) または ROS1、上皮成長因子受容体 (EGFR) の発癌性突然変異を隠すし、利用可能なターゲット薬3,4と扱うことができます。免疫チェックポイント阻害剤の出現により、今までは、患者の 20-40% だけは免疫療法5に応答が、肺癌患者に新たな希望が生じた。それ故に、さらに研究は免疫チェックポイント療法を微調整し、組合せ治療オプションを調査してこの結果を改善するために必要です。
肺癌の研究、前臨床モデルの広大な配列があります、モデル (ジェム) の条件付きのアクティブ化後、土着の腫瘍が発生するの化学物質や発ガン性物質や遺伝子組み換えマウスによって引き起こされる自発的なモデルを含む遺伝子および/または腫瘍サプレッサーの遺伝子6,7,8の不活化。これらのモデルは、肺腫瘍の開発の基本的なプロセスを調査する特定の値が、繁殖、広範なマウスも必要になります、実験は時間がかかる。したがって、潜在的な阻害を評価する多くの研究はひと肺癌細胞株を免疫不全マウス9注入皮下皮下 (患者由来) 異種移植モデルの利点を取る。
これらのモデルで腫瘍の micromilieu は必要に応じては表されませんしたがって、研究者も使用する同所性同種移植モデルどこ肺実質10、11,12,13に静脈内投与、intrabronchially、または直接に、腫瘍細胞が挿入され、 14,15,16,17,18,19,20。これらのメソッドのいくつかは、技術的に困難な再現して研究者の集中的な訓練を必要とすることは困難です。21ここで我々 は非侵襲的な同所性気管移植による免疫マウス、腫瘍が 3 ~ 5 週間以内に開発して、T 細胞の発現を誘導するために、人間の腫瘍の重要な類似を表わす、適応抑制プログラム死リガンド 1 (PD L1) 腫瘍の細胞。11,12,20マウス腫瘍細胞の使用に由来するジェム モデルと同系の受信者マウスが免疫細胞を含む腫瘍微小環境の適切な研究をします。さらに、体外移植肺腫瘍の遺伝要因の影響の調査を容易にする前に、遺伝子編集 CRISPR/Cas9 技術22のようなツールは使用できます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:663px;" width="664">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:255px;">mouse lung adenocarcinoma cell line</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">isolated in house</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:255px;">C57Bl/6 mice</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:255px;">129S mice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11544446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11573397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11539876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11560626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketasol (100 mg/ml Ketamine)</td>
			<td style="width:123px;">Ogris Pharma</td>
			<td style="width:119px;">8-00173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Xylasol (20 mg/ml Xylazine)</td>
			<td style="width:123px;">Ogris Pharma</td>
			<td style="width:119px;">8-00178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">BD Insyste (22GA 1.00 IN)</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">381223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Blunt forceps</td>
			<td style="width:123px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS8260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Leica CLS150 LED</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">30250004</td>
			<td>Fibre Light Illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Student Iris Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I (RNase-Free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:123px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">25-5982-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:123px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">25-4321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study pd-l1 expression

マウス モデルの使用は様々 な疾患の病態生理を研究するため不可欠であります。肺癌に対するいくつかのモデルがあります、モデルだけでなく、移植モデルに設計遺伝子を含みます。ただし、遺伝子組み換えマウス モデルは時間がかかり、高価ないくつかの同所性同種移植モデルが再現しにくいに対しです。ここでは、代替同所性同種移植モデルとして肺腫瘍細胞の非侵襲的な気管の配信方法は記述されています。マウス肺腺癌細胞と同系移植の受信者の使用は、完全にアクティブな免疫システムの存在下で腫瘍を勉強できます。さらに、腫瘍の遺伝子操作は細胞移植になりますこのモデル, 腫瘍の増殖や腫瘍細胞の遺伝子発現の遺伝的要因の影響を研究する魅力的な時間節約アプローチは生理的条件下でプロファイルする前に。それ肺腺癌細胞を示す本モデルを用いた T 細胞サプレッサーの増加レベルを表現は、in vitro における栽培と比較して、自然の環境で栽培されたは死リガンド 1 (PD L1) プログラム。

腫瘍微小環境の PD L1 の発現を刺激するかどうかをテストする気管内腫瘍細胞配信を通じて同所性同種移植モデルを使用しました。したがって、10 週間後腫瘍誘導に Cre リコンビナーゼ発現アデノ ウイルス (Ad.Cre) 配信24土着 KP モデル (KP 細胞) からマウス肺 AC 細胞を分離しました。その後、肺は、緑色蛍光タンパク質 (GFP) を用いた AC 細胞をラベル付?...

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PD L1 の発現を研究する同系の肺腺癌細胞の同所性同種移植

ここで非小細胞肺癌を勉強する時間とコスト削減モデルとしてマウス肺腺癌細胞の低侵襲同系同所性同種移植モデルについて述べる。

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

マウス肺腺癌細胞を同種移植片レシピエントに移植する正交性移植により、生理学的条件下で完全に活性な免疫系の存在下での腫瘍形成の研究が可能になる。もちろん、腫瘍は免疫能力マウスに発展し、免疫不全マウスで移植を行う場合ははるかに生理学的です。移植前の腫瘍細胞の遺伝子編集は、このモデルを腫瘍成長および遺伝子発現プロファイルに対する遺伝的要因の影響を研究するための直接的かつ時間を節約するアプローチにする。誘導性オートチソナス肺腫瘍モデルと比較して、この方法はマウスの広範な繁殖を回避し、したがって、以前の肺癌マウスモデルの改良を表す。手順を開始する前に、はさみを使用してカテーテル針の端部を取り除き、カテーテルを針の端に完全に押し込みます。つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、麻酔下の8〜12週齢のマウスの目に軟膏を塗布し、縫合糸に垂直な胸部を持つ挿管プラットフォームを横切って縫合糸の文字列の上切開部をフックします。前肢の間に光ファイバーケーブルを置いて胸を照らし、消毒された平らな鉗子を使って舌を慎重に開けます。白色光の放出を探して喉頭、喉頭蓋、およびアリュテノイド軟骨を見つけます。気管の開口部がはっきりと見える場合は、カテーテルを気管に静かにスライドさせ、分岐を超えて、肺内の肺腺癌細胞の均等な分布を保証する。カテーテルの挿入が非常に滑らかであることを注意してください。抵抗を感じたら、カテーテルを取り外し、気管を再び露出して、マウスの怪我をしないようにします。針をカテーテルから素早く取り出し、カテーテルを通して白色光が光っているかどうかを確認します。気管内のカテーテルの適切な配置を確認するには、カテーテルに水の1ミリリットルの注射器を取り付けます。注射器の水は呼吸に合うように急速に上下に動くはずです。細胞懸濁液を送達する前に、細胞を手で温め、50マイクロリットルの細胞をカテーテルに積み込みます。懸濁液が吸引されるとすぐに、空の1ミリリットルの注射器をカテーテルに取り付け、300マイクロリットルの空気をカテーテルに分配して、肺内の腫瘍細胞の完全な分布を確保する。その後、カテーテルを静かに取り外し、完全な債務が発生するまで監視とヒートパッド上にマウスを置きます。適切な実験エンドポイントの後、70%エタノールに死体を浸し、解剖板に動物を固定します。腹側の正中線切開を行い、皮膚をそっと反転して胸壁の筋肉と腹部の器官を露出させます。はさみを使って横隔膜を穿刺し、肋骨を切り、胸腔を露出させろ。左心室の小さな開口部を切断し、27ゲージの針を使用して、右心室を通して肺を3回穿孔し、1回の注入ごとに6〜8ミリリットルの氷冷PVSを使用します。最後の灌流の後、肺は完全に血液を取り除き、白く見えるはずです。収穫後、はさみを使用して肺組織を小片にミンチします。肺の断片を摂氏37度で30~60分間の肺消化バッファー1.5ミリリットルを含む2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、揺れ動かします。消化の終わりに、70ミクロンの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに細胞懸濁液を移し、無菌10ミリリットルシリンジプランジャーの端を使用して、残りの組織断片をフィルターに押し込みます。2%FCSを補って、PVSの15ミリリットルでストレーナーをすすいでください。遠心分離により細胞を回収する。ペレットを塩化アンモニウムカリウムリシスバッファーの1ミリリットルで室温で5分間インキュベーションし、再び遠心分離します。次に、2%FCSを補充したPVSの1ミリリットルで白血球ペレットを再中断し、実験プロトコルに従ってフローサイトメトリック分析のために細胞を染色する。予想通り、レシピエントマウスの生存は、生着細胞の数と相関している。そして、死亡時に収穫された肺は、すべてのローブ全体で腫瘍結節の均等な分布を示す。自己性腫瘍を抱える肺の切片を、同種移植された肺腫瘍細胞に続く腫瘍と比較すると、形態学的差異は認められない。免疫担当マウスへの直交性腫瘍細胞移植の3週間後に単離された肺細胞のPD-L1発現のフロー細胞量分析は、ちょうど実証したように、PD-L1細胞表面マーカー発現におけるアップレギュレーションを明らかにし、インビトロ培養肺腫瘍細胞と比較した。整形移植後、免疫物質化学分析、および追加の実験的な問題に対処するためのmRNAプロファイリングを含む他の分析方法を適用することができる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure (Video) | JoVE 

肺腺癌細胞の in Vitro 2 ステップ増量の手順でデュアル抵抗性 EGFR TKI と会った TKI の確立

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation (Video) | JoVE 

不可逆エレクトロポレーションの効果を研究する同系膵癌マウス モデル

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer (Video) | JoVE 

アンドロゲン依存性去勢抵抗性前立腺癌の生物発光と蛍光の同所性同種同系マウスモデル

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry (Video) | JoVE 

同所性同種 (同系) マウスのプライマリ KPC 膵管腺癌のフローサイトメトリーによる診療

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients (Video) | JoVE 

アンチ PD L1 抗体は生検で非小細胞肺癌患者からの細胞のサンプル集中 22 3 を使用して

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions (Video) | JoVE 

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence (Video) | JoVE 

免疫蛍光による非小細胞肺癌患者からの循環腫瘍細胞の半自動PD-L1特性図と列挙

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (Video) | JoVE 

マウス膵管腺癌の超音波誘導矯正着移植

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate (Video) | JoVE 

転移率を制御する切断を用いた同種異形性骨肉腫スプレイグ・ドーリーラットモデル

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...