Name: orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study pd-l1 expression
Uploaded: 2019-01-19T13:00:00
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저자는 Safia Zahma 그녀의 조직 단면도의 준비에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

모든 실험 프로토콜 개요로 아래 윤리 지침 그리고 과학의 오스트리아 연방 정부, 연구 및 경제에 의해 승인 했다.
참고: 여기에 프로토콜 syngeneic 받는 사람으로 orthotopic 이식 모델을 마우스 폐 선 암 셀을 설명합니다. 셀 KraLSL-G12D의 종양-베어링 폐에서 격리 될 수 있습니다: p53fl/플로리다 (KP) 마우스7,18,...

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공부 하 고 폐에서 폐 생리 및 pathologic 행사, 다양 한 시 약의 문제에 대 한 침략과 비-침략 적 intratracheal 삽 관 법 메서드는 널리26,,2728,29 ,30,,3132. 암 분야에서 연구자는 intratracheal 사용 (및 intranasal) 폐 상피 세포에 체세포 ...

폐암은 아직까지 남자와 여자 둘 다1에서 가장 큰 암 관련 살인자 이다. 실제로, 미국 암 협회에 따르면 매년 유 방, 전립선, 결 장 암 함께1보다 폐암의 다이 더 많은 사람들이. 최근까지, 비 작은 세포 폐암 (NSCLC)는 폐암의 가장 풍부한 하위에서에서 고통 받는 환자의 대부분 주로 신생의 추가 함께 첫 줄 속에서 백 금 기반의 화학 요법으로 치료 했다 억제제2. 환자의 부분 집합 anaplastic 림프 종 키나 제 (ALK), 또는 ROS1, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), 종양 돌연변이 비호 하 고 사용할 수 있는 대상 약3,4대우 될 수 있다. 검사점 면역 억제제의 도래와 함께 폐 암 환자에 대 한 새로운 희망이 생겨났다, 비록 지금까지만 20-40%의 환자는 면역 치료5에 응답. 따라서, 추가 연구 필요 면역 검사점 치료를 미세 조정 하 고 조합 치료 옵션을 조사 하 여이 결과 개선 합니다.
폐암 연구, 전 임상 모델의 광대 한 배열을 사용할 수 있습니다, 그리고 자발적인 모델 등 모델 (GEMM) 학위 종양의 조건부 활성화 다음 발생 화학 물질과 발암 물질과 유전자 조작된 마우스에 의해 실행 oncogenes 또는 종양 억제기 유전자6,,78의 비활성화. 이 모델은 폐 종양 개발의 기본 프로세스를 조사 하기 위해 특정 값의 하지만 그들은 또한 광범위 한 쥐 사육, 요구 그리고 실험은 시간이 걸리는. 따라서, 많은 연구 잠재적인 억제제 평가 활용 피하 (환자-파생)이 종이 식 모델 immunodeficient 마우스9에 인간의 폐 암 세포 라인은 피하 주입.
이 모델에서 종양의 micromilieu 표시 되지 않습니다 따라; 따라서, 연구원은 또한 orthotopic 이식 모델 사용, 어디 종양 세포는 주입 정 맥, intrabronchially, 또는 직접 폐 실질10,,1112,13, 14,15,16,17,18,,1920. 이러한 메서드 중 일부는 기술적으로 도전적인, 재현할 수 및 연구자의 집중적인 훈련을 필요로입니다. 21 여기 우리는 비-침략 적 orthotopic immunocompetent 쥐, 종양 3-5 주 이내 개발과 인간의 종양, T-세포의 표현을 유도 하에 상당한 유사성을 전시에 intratracheal 이식 방법 적응 억압 죽음-ligand 1 (PD-L1) 종양 세포에 프로그램. 11 , 12 , GEMM 모델에서 파생 된 20 마우스 종양 세포를 사용 하며 syngeneic 받는 사람 마우스 면역 세포를 포함 하 여 종양 microenvironment의 적절 한 공부 또한, CRISPR/Cas9 기술22 같은 도구를 편집 하는 유전자 생체 이식 폐 tumorigenesis에서 유전적 요인의 영향의 조사를 용이 하 게 하기 전에 사용할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:663px;" width="664">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:255px;">mouse lung adenocarcinoma cell line</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">isolated in house</td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:255px;">C57Bl/6 mice</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;"></td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">F1 of the cross of the two backgrounds may be used (8-12 weeks)</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:255px;">129S mice</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI 1640 Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11544446</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11573397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11548876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11539876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin, 0.25% (1X) with EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11560626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ketasol (100 mg/ml Ketamine)</td>
			<td style="width:123px;">Ogris Pharma</td>
			<td style="width:119px;">8-00173</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Xylasol (20 mg/ml Xylazine)</td>
			<td style="width:123px;">Ogris Pharma</td>
			<td style="width:119px;">8-00178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">BD Insyste (22GA 1.00 IN)</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">381223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Blunt forceps</td>
			<td style="width:123px;">Roboz</td>
			<td style="width:119px;">RS8260</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Leica CLS150 LED</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">30250004</td>
			<td>Fibre Light Illuminator</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Student Iris Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I (RNase-Free)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">Collagenase Type I</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17100017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:255px;">ACK Lysing Buffer</td>
			<td style="width:123px;">Lonza</td>
			<td>10-548E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:123px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">25-5982-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:255px;">Rat IgG2a kappa Isotype Control, PE-Cyanine7</td>
			<td style="width:123px;">eBioscience</td>
			<td style="width:119px;">25-4321-82</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

orthotopic transplantation of syngeneic lung adenocarcinoma cells to study pd-l1 expression

마우스 모델의 사용은 다양 한 질병의 병 태 생리학 공부를 위한 불가결. 폐암에 관하여 몇 가지 모델을 사용할 수 있습니다, 그리고 유전자를 포함 하 여 설계 모델 뿐만 아니라 이식 모델. 그러나, 유전자 조작된 마우스 모델은 어렵고 비싼, 일부 orthotopic 이식 모델은 재현 하기 어려운 반면. 여기, 대체 orthotopic 이식 모델로 폐 종양 세포의 비-침략 적 intratracheal 전달 방법 설명 되어 있습니다. 마우스 폐 선 암 세포 및 syngeneic 이식 받는 사람을 사용 하 여 완전히 활성 면역 체계의 존재 아래 tumorigenesis 공부 수 있습니다. 또한, 종양의 유전자 조작 세포 이식 게 생리 적인 조건 하에서 프로이 모델 종양 성장과 종양 세포 유전자 발현에 유전 요인의 영향을 공부 하는 매력적인 시간 절약 접근 하기 전에. 우리는 폐 선 암 셀 표시이 모델을 사용 하 여 T 세포 억제기의 빠른 증가 수준 생체 외에서 재배에 비해 그들의 자연 환경에서 성장 하는 때 죽음-ligand 1 (PD-L1) 프로그램.

우리는 종양 microenvironment 자극 PD L1 식 여부를 테스트 하려면 intratracheal 종양 세포 배달을 통해 orthotopic 이식 모델을 사용. 따라서, 우리는 학위 KP 모델 (KP 셀)에서 마우스 폐 AC 셀 Cre recombinase 표현 하는 아 데 노 바이러스 (Ad.Cre) 배달24통해 종양 유도 따라 10 주를 고립. 그 후, 우리는 폐 녹색 형광 단백질 (GFP)를 사용 하 여 AC 셀 표시-intratracheal 배달을 ?...

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Orthotopic PD L1 식 공부 Syngeneic 폐 선 암 세포의 이식

여기 우리는 비 작은 세포 폐 암 공부 시간 및 비용 절감 모델 마우스 폐 선 암 세포의 침 습 syngeneic orthotopic 이식 모델을 설명 합니다.

The use of mouse models is indispensable for studying the pathophysiology of various diseases. With respect to lung cancer, several models are available, ...

마우스 폐 아데노시스종 세포의 직교 이식은 생리적 조건 하에서 완전히 활동적인 면역 계통의 존재하에 종양 발생의 연구를 허용한다. 물론, 종양은 면역 능력 마우스로 발전하고 이것은 면역 결핍 마우스에서 이식을 수행하는 경우 훨씬 더 생리적이다. 이식 전에 종양 세포의 유전자 편집은 이 모형이 종양 성장 및 유전자 발현 단면도에 유전 요인의 충격을 공부하기 위한 직접적이고 시간 절약적인 접근법입니다.유도성 자가폐 종양 모델과 비교하여, 이 방법은 마우스의 광범위한 사육을 피하고, 따라서 이전 폐암 마우스 모델의 정제를 나타낸다. 절차를 시작하기 전에 가위를 사용하여 카테터 바늘의 끝을 제거하고 카테터를 바늘 끝까지 완전히 밀어 넣습니다. 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 마취, 시너지 8 ~ 12 주 된 마우스의 눈에 연고를 적용하고 봉합사에 수직 가슴과 삽관 플랫폼을 가로 질러 봉합장 위에 상부 절개를 연결합니다.앞팔사이에 광섬유 케이블을 놓고 가슴을 비추고 불감염된 평평한 집게를 사용하여 조심스럽게 입을 열어 혀를 추출합니다. 후두, 후두, 후두및 아티노이드 연골을 찾기 위해 백색광의 방출을 찾습니다. 기관의 개구부가 명확하게 드러나면 카테터를 기관으로 부드럽게 밀어 넣고 분기를 넘어서는 것이 아니라 폐 내의 폐 선암종 세포의 균등한 분포를 보장합니다.카테터의 삽입이 매우 부드럽다는 것을 주의하십시오. 저항이 느껴지면 카테터를 제거하고 마우스를 손상시키지 않도록 기관을 다시 노출하십시오. 카테터에서 바늘을 빠르게 제거하고 카테터를 통해 빛나는 백색광을 관찰 할 수 있는지 확인하십시오.기관 내에 카테터의 적절한 배치를 확인하려면 카테터에 1 밀리리터 주사기를 부착하십시오. 주사기의 물은 호흡과 함께 빠르게 위아래로 움직여야 합니다. 세포 현탁액을 전달하기 전에, 손으로 세포를 따뜻하게하고 카테터에 세포의 50 마이크로 리터를로드합니다.서스펜션이 흡인되는 즉시, 카테터에 빈 1밀리리터 주사기를 부착하고 300마이크로리터의 공기를 카테터에 분배하여 폐 내종양 세포의 완전한 분포를 보장한다. 그런 다음 카테터를 부드럽게 제거하고 전체 침전이 될 때까지 모니터링하여 열 패드에 마우스를 놓습니다. 적절한 실험 적 종점 후, 70 %에탄올에 시체를 흡수하고 해부 보드에 동물을 고정.복부 중간 부절을 만들고 피부를 부드럽게 반전하여 흉부 벽 근육과 복부 장기를 노출시십시오. 가위를 사용하여 다이어프램에 구멍을 뚫고 갈비뼈를 자르고 흉부 구멍을 노출시하십시오. 좌심실의 작은 개구부를 자르고 27 게이지 바늘을 사용하여 주입 당 6~8밀리리터의 얼음 차가운 PVS를 우심실을 통해 폐를 세 번 견딜 수 있습니다.마지막 관류 후, 폐는 혈액의 완전히 명확하고 흰색 나타납니다. 수확 후 가위를 사용하여 폐 조직을 작은 조각으로 다진다. 폐 조각을 37°C에서 30~60분 동안 폐 소화 완충제 1.5밀리리터를 함유한 2밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기십시오.소화가 끝나면 70미크론 세포 스트레이너를 통해 50 밀리리터 튜브로 세포 현탁액을 옮기고 멸균 10 밀리리터 주사기 플런저의 끝을 사용하여 필터를 통해 남은 조직 조각을 누릅니다. 2%의 FCS를 보완한 15밀리리터의 PVS로 스트레이너를 헹구세요. 그리고 원심분리에 의해 세포를 수집한다.실온에서 5분 동안 염화칼륨 용해 완충제의 1밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고 세포를 원심분리합니다. 그런 다음 2%FCS로 보충된 PVS의 1밀리리터에서 백혈구 펠릿을 다시 중단하고 실험 프로토콜에 따른 유동 세포 측정 분석을 위해 세포를 얼룩지게 한다. 예상대로, 수신자 마우스의 생존은 이식된 세포의 수와 상관관계가 있다.그리고 죽음의 시간에 수확된 폐는 모든 엽 전체에 종양 요절의 균등한 분포를 보여줍니다. 충청 종양을 품고 있는 폐에서 단면을 비교할 때, 정형소이식된 폐 종양 세포를 따르는 종양과, 형태학적 차이는 관찰되지 않습니다. 정형소 종양 세포이식 후 3주 후에 분리된 폐 세포의 PD-L1 발현의 유동 세포 분석은 방금 입증된 바와 같이, PD-L1 세포 표면 마커 발현에서 의상 조절을 드러내며, 체외 배양폐 종양 세포에 비해.직교 이식에 이어, 면역화학적 분석, mRNA 프로파일링을 포함한 다른 분석 방법을 적용하여 추가적인 실험적 질문을 해결할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Orthotopic Transplantation of Syngeneic Lung Adenocarcinoma Cells to Study PD-L1 Expression

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure

Establishing Dual Resistance to EGFR-TKI and MET-TKI in Lung Adenocarcinoma Cells In Vitro with a 2-step Dose-escalation Procedure (Video) | JoVE 

폐 선 암 세포에서 생체 외에서 2 단계 복용량 단계적 확대 절차와 EGFR TKI와 만난 TKI 듀얼 저항 설정

Drug resistance is a major challenge in cancer therapy. The generation of resistant sublines in vitro is necessary for discovering novel mechanisms to ...

연구

암 연구학

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment (Video) | JoVE 

암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation (Video) | JoVE 

돌이킬 수 없는 Electroporation의 효과 공부 하는 Syngeneic 췌 장 암 마우스 모델

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer

A Bioluminescent and Fluorescent Orthotopic Syngeneic Murine Model of Androgen-dependent and Castration-resistant Prostate Cancer (Video) | JoVE 

발광 및 형광 Orthotopic Syngeneic Murine 모델 Androgen 종속 및 거세 내성 전립선 암

Orthotopic tumor modeling is a valuable tool for pre-clinical prostate cancer research, as it has multiple advantages over both subcutaneous and ...

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry

Immunophenotyping of Orthotopic Homograft (Syngeneic) of Murine Primary KPC Pancreatic Ductal Adenocarcinoma by Flow Cytometry (Video) | JoVE 

Immunophenotyping Orthotopic Homograft (Syngeneic) Murine 기본 KPC 췌 장 Ductal 선 암의 Cytometry로의

Homograft (syngeneic) tumors are the workhorse of today&#39;s immuno-oncology (I/O) preclinical research. The tumor microenvironment (TME), particularly ...

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients

Using 22C3 Anti-PD-L1 Antibody Concentrate on Biopsy and Cytology Samples from Non-small Cell Lung Cancer Patients (Video) | JoVE 

22C 3를 사용 하 여 반대로 PD L1 항 체 생 검 및 비 작은 세포 폐 암 환자에서 세포학 샘플에 집중

Pembrolizumab monotherapy has been approved for the first- and second-line treatment of patients with PD-L1-expressing advanced non-small cell lung cancer ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions (Video) | JoVE 

펄프 조직 문화와 공동 암 세포와 그들의 상호 작용을 공부 하에서 중간 엽 줄기 세포 분리

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence

Semi-automatic PD-L1 Characterization and Enumeration of Circulating Tumor Cells from Non-small Cell Lung Cancer Patients by Immunofluorescence (Video) | JoVE 

면역형광에 의한 비소세포 폐암 환자의 순환 종양 세포의 반자동 PD-L1 특성화 및 열거

Circulating tumor cells (CTCs) derived from the primary tumor are shed into the bloodstream or lymphatic system. These rare cells (1&#8722;10 cells per mL ...

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

Ultrasound-Guided Orthotopic Implantation of Murine Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (Video) | JoVE 

뮤린 췌장 연성 선암의 초음파 유도 정형 외 이식

The recent success of immune checkpoint blockade in melanoma and lung adenocarcinoma has galvanized the field of immuno-oncology as well as revealed the ...

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate

A Syngeneic Orthotopic Osteosarcoma Sprague Dawley Rat Model with Amputation to Control Metastasis Rate (Video) | JoVE 

전이율을 제어하는 절단을 가진 신제닉 직소 성 골육종 스프라그 Dawley 쥐 모델

The most recent advance in the treatment of osteosarcoma (OS) occurred in the 1980s when multi-agent chemotherapy was shown to improve overall survival ...