Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

ونشكر بيير Gönczy وبيويماجينج والبصريات منصة (بيوب) في مدرسة البوليتكنيك Fédérale دي لوزان، لوزان، سويسرا، حيث تم اقتناء صور سيم centrioles. كلنا نيكولاي ودافيدي جامباروتو معتمدة من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC) ابتداء منح (الجنيه الاسترليني) 715289 (تمييز) وجينك Le Maeva، بول كيشار، والفرنسية فيرجيني هامل من PP00P3_157517 مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (سنسف). سوزان بورجيرس معتمد من قبل جامعة جنيف.

<ol>
	<li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+in+cells+and+organisms.">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li><li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+and+only+once:+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease.">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrioles,+centrosomes,+and+cilia+in+health+and+disease.">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li><li>G&#246;nczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly.">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li><li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+organization+and+centriole+architecture:+their+sensitivity+to+divalent+cations.">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li><li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+structure.">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+basal+bodies+in+paramecium.">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).</li><li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis.">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li><li>Li, S., Fernandez, J. -. J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography.">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li><li>Guichard, P., Chr&#233;tien, D., Marco, S., Tassin, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography.">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry.">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li><li>Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartwheel+assembly.">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes.">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li><li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure.">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li><li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging.">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis.">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li><li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii.">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).</li><li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus:+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body.">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, 2663-2674 (2004).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy.">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms.">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813 (2017).</li><li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology.">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li><li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Approaches+to+the+Study+of+the+Role+of+Metals+in+the+Metabolism+of+Microorganisms.">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li><li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles.">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li><li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyVolution-the+smart+path+to+confocal+super-resolution.">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+3D-SIM/SMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+&#8764;4-5+nm.">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of &#8764;4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li><li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+lytic+enzymes+(autolysins)+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+(hydroxy)proline-specific+proteases.">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li><li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images.">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

أحد التحديات في مجال البيولوجيا فك التعريب الدقيق للبروتينات في سياق معمارية. مريكز بنية مثالية لتطبيق هذه الأساليب، كما درست الهندسة المعمارية استخدام التصوير المقطعي الإلكترون البرد، تكشف عن ملامح ultrastructural مثيرة للاهتمام على طوله. ومع ذلك، بسبب أبعادها قريبة من حد القرار بالمجهر الضوئي، من الصعب دقة ترجمة بروتين من الفلورة إلى منطقة مريكز استخدام المجاهر التقليدية30الفرعية هيكلية.
يقتصر القرار في المجهر الضوئي من حيود الضوء الذي يعطي، تقريبا، قرارا أقصى أفقي من 200 نانومتر في المجهر الضوئي24. ومع ذلك، قد هذا الحد تجنبت بواحدة من كبرى إنجازات السنوات ال 20 الماضية في المجهر الضوئي: اختراع أساليب القرار فائقة. هذه النهج يمكن الصورة خارج حدود حيود في قرارات مختلفة: 120 نانومتر سيم حوالي 50 نانومتر ليحث إذاعة استنزاف (STED) و 20 – 40 نانومتر للتعريب جزيء واحد مجهرية (سملم)24. مع هذه التطورات الجديدة من الفحص المجهري القرار فائقة، قابلة المناطق الفرعية الهيكلية من مريكز. ومع ذلك، في الممارسة العملية، ما زال من الصعب تحديد دقة التعريب من البروتين لعنصر هيكلي للسبب الرئيسي في أن centrioles ناضجة موجودة في نسخ 2 فقط لكل خلية والتوجهات العشوائية، مما يجعل تفسير الترجمة الصعبة. لهذا السبب، تم بروتوكول إنشاء الذي يسمح للباحثين صورة فائقة القرار عدد كبير من centrioles، زيادة فرصة لمراقبة التوجهات غير غامضة. الأهم من ذلك، حيث يعتمد هذا الأسلوب على استخدام centrioles معزولة، ونحن نقدم وسيلة لتنقية سليمة رينهاردتي C. centrioles التي تحتوي على centrioles ناضجة وبروسينتريوليس.
وأخيراً، نظراً لمجموعة التوجهات مريكز التي يمكن تصويرها بهذا البروتوكول، تحليل الجسيمات واحد يمكن تطبيقها استخدام البرمجيات الميكروسكوب الإلكتروني. ينتج عن هذا الجيل من متوسط فئات centrioles في اتجاه معين. الأهم من ذلك، يمكن استخدام هذه الصور 2-د الناتجة ثم تقييم التعريب بروتين محددة على طول مريكز. وفي الواقع، هذا الأسلوب يمكن تطبيقها على الصور ذات الدقة الفائقة المزدوج-لون، ويمكن استخدام لون واحد للكشف عن مريكز هيكل عظمى (مثلاً، توبولين)، في حين الألوان الأخرى يمكن أن يعزى إلى بروتين سينتريولار محددة. عن طريق طرح المتوسطات التي تم الحصول عليها مع لون واحد أو لونين، يصبح من الأسهل لتسجيل نسبة بروتين على طول مريكز (الدانية أو المركزية أو البعيدة). علما أنه ينبغي مواءمة القناتين بدقة لمنع أي تفسيرات مضللة. وعلاوة على ذلك، سوف تساعد المتوسطات لآراء كبار فك إذا كان بروتين يموضع داخل التجويف سينتريولار، على طول الجدار microtubule، أو خارج مريكز.
ويمتاز هذا الأسلوب للتأكد من إضفاء الطابع المحلي على البروتينات المحددة التي يمكن أن تكون صعبة لتعريب خلاف ذلك بسبب العلامات غير متجانسة. نلاحظ أن أساليب أخرى لتعيين البروتينات داخل centrioles قد وصف في الارتباطية سيم/سملم ثلاثي الأبعاد مع، على سبيل المثال، تقييم توجهات محددة centrioles بتحديد الشخصية اهليلجية علامة تشكيل الحيد حول مريكز بتصوير سيم. تستخدم هذه المعلمة، من الممكن ترجمة البروتين بدقة من 4 – 5 نانومتر30. لاحظ أيضا أن يستخدم الأسلوب الموصوفة هنا centrioles معزولة مع سليمة بروسينتريوليس، إشارة إلى أن بنية مريكز الأكثر احتمالاً يحافظ إلى حد كبير. ومع ذلك، لا يمكننا أن نستبعد أن بعض المعالم المعمارية باﻻنزعاج أثناء تنقية، مثل قطر مريكز متفاوتة مع تركيز الكاتيونات divalent كما تتضخم مع عزلة centrosome البشرية5.
واحدة من الخطوات الحاسمة للبروتوكول المعروضة هنا الحصول على مركزة بما فيه الكفاية centrioles معزولة في توجهات مختلفة قابلة لقطع-سبأ. للقيام بذلك، تأكد أولاً من النقاء وكفاءة إجراءات العزل مريكز. تركيز منخفض من centrioles معزولة يمنع التصوير السليم والاستمرار في معالجة الصورة. لهذا الغرض، ونحن نقدم وسيلة لإثراء عدد centrioles كل مجال الرؤية. اعتماداً على عدد centrioles في الكسر المستخدمة، ينبغي تعديل وحدة التخزين المحملة في مركزات، مع وحدة تخزين كحد أقصى من 250 ميليلتر.
الأهم من ذلك، أن هذا الأسلوب قد وضعت لجدار الخلية ناقص الخلايا رينهاردتي cw15--جيم . في هذه السلالة، هشاشة جدار الخلية يسمح تحلل سليم للخلايا، ومن ثم تحرير المحتوى الخاص به. هذا البروتوكول ليس من الكفاءة للبرية من نوع C. رينهاردتي الخلايا، كما يمنع جدار الخلية تحلل سليم. الاستراتيجيات البديلة مثل سونيكيشن أو حضانة قبل الخلايا مع أوتوليسين، إنزيم يمكن أن تتحلل في جدار الخلية31، يتعين أن توضع بتغيير الخلية جدار قبل تطبيق البروتوكول العزلة المعروضة هنا.
يمكن استخدام هذا الإعداد مع أنواع مختلفة من المجاهر، تتراوح بين المجاهر التقليدية [كنفوكل] المجاهر القرار فائقة الإنتاجية العالية مخصصة. لاحظ أن عند القيام سملم، المخزن مؤقت خاص المطلوب للتصوير السليم، وهكذا، ينبغي أن تستخدم غرفة مكيفة ساترة 12 مم مع المخزن المؤقت على رأس ساترة. سيتم إجراء تصوير اللاحقة مع المجهر المقلوب. إذا كان لا يسمح بتركيب المجهر ساترة 12 مم، يمكن تطبيقها البروتوكول المعروضة هنا على كوفيرسليبس 18 ملم باستخدام أنبوب أسفل جولة 30 مل ومحول تم التعديل والمكثف. كما أن من المهم ملاحظة أن نوعية إعادة إعمار سملم النهائي سيتوقف على النوعية لتلطيخ وجسم الأولية المستخدمة، فضلا عن طريقة التثبيت.
وباختصار، نحن نقدم أسلوب التي يمكن تطبيقها على الصورة التي أعقبت centrioles العديد من فلوو-سبأ التي سوف تولد متوسطات centrioles في التوجهات المختلفة، مما يساعد على ترجمة البروتين سينتريولار بدقة. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب أكثر عموما centrioles معزولة من الأنواع الأخرى، العضيات الأخرى، أو جمعيات الجزيئات الكبيرة. وأخيراً، نهج إعداد عينة المعروضة هنا، جنبا إلى جنب مع تطوير خوارزمية الأخيرة لتحليل واحد-الجسيمات الفلورية سملم البيانات32، يمكن أن تفتح المزيد من تحسين في الخرائط الجزيئية الكبيرة الجزيئات التجميعات.

مريكز هو عضية تقحم مصانة التي تكمن في صميم سينتروسومي في الخلايا الحيوانية، ويمكن أن تعمل كهيئة القاعدية (المشار إليها ك centrioles أدناه) بأهداب القالب أو سياط في كثير من حقيقيات النوى1،2. على هذا النحو، حاسمة بالنسبة للعمليات البيولوجية الخلية الأساسية تتراوح بين الجمعية المغزل إلى الخلية إشارات centrioles. ولذلك، ارتبطت مع العديد من الأمراض البشرية بما في ذلك سيليوباثيس والسرطانات3عيوب في الجمعية مريكز أو دالة.
Centrioles تضاعف، متناظرة، ميكروتوبولي الثلاثي القائم على الهياكل الاسطوانية التي هي، عادة، ~ 450 نانومتر طويلة و ~ 250 نانومتر واسعة4،5،،من67. المجهر الإلكتروني التقليدية والتصوير المقطعي cryo-إلكترون من centrioles من الأنواع المختلفة قد كشفت عن أن centrioles هي الاستقطاب على طول محورها طويل مع ثلاث مناطق متميزة: منطقة الدانية، ونواة مركزية، و منطقة البعيدة5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11-الأهم من ذلك، كل من هذه المناطق يعرض السمات الهيكلية المحددة. أولاً، يتضمن تجويف منطقة شمال البحر الأبيض المتوسط طوله الدانية 100 هيكل عجلة العربة متصلة بالثلاثي ميكروتوبولي من خلال عنصر رأس الدبوس12. ثانيا، يتضمن منطقة وسط شمال البحر الأبيض المتوسط طوله 300-400 كثافة ليفية في السمات الهيكلية والتجويف على طول الوجه الداخلي ميكروتوبوليس: رابط على شكل Y والذيل ج-A-9كعب الروتين. وأخيراً، منطقة شمال البحر الأبيض المتوسط 50 – 100 القاصي المعارض الملاحق الفرعية البعيدة والبعيدة التي تحيط بالجزء الأعلى من5،مريكز13.
لقد اتسمت في العقدين الأخيرين باكتشاف عدد متزايد من البروتينات سينتريولار، مما أدى إلى إجراء تقدير الحالي لبروتينات مميزة حوالي 100 كونها جزءا من مريكز14،،من1516، 17-وعلى الرغم من أوجه التقدم هذه، التعريب الدقيق لهذه البروتينات داخل مريكز يظل بعيد المنال، لا سيما داخل المناطق الفرعية الهيكلية. الأهم من ذلك، تعيين ترجمة دقيقة للمناطق الهيكلية مريكز أمر حاسم لفهم أفضل لوظيفتها. وفي هذا الصدد، centrioles رينهاردتي C. قد ساعدت في كلا من الجوانب بأول واﻻستعانة السمات الهيكلية المختلفة على طول الاسطوانة9،18،19، مما أتاح ثم الباحثين للربط بين إضفاء الطابع المحلي على مجموعة فرعية بروتينات باستخدام مجهر فلوري إلى منطقة شبه هيكلية. ويشمل هذا، على سبيل المثال، البروتينات Bld12p و Bld10p، الذي ترجمة في المنطقة الدانية، وفي هيكل عجلة العربة خاصة20،21،،من2223. كما تشمل قائمة البروتينات الهيكلية المترجمة POB15 و POC16، هما البروتينات الرواية حددها الكتلي التي تزين المنطقة الداخلية الأساسية المركزية centrioles رينهاردتي جيم- 17.
تقدم هذه الورقة وصف كامل للطريقة التي وضعت لعزل والصورة centrioles رينهاردتي C. للفحص المجهري القرار فائقة اللاحقة والجسيمات واحد في المتوسط. ولتحقيق هذا الهدف، من المهم أن تحدد القيود التقنية التي يتعين التغلب عليها. أولاً، يمكن أن تؤثر على تنقية مريكز البنيان الشامل، مع هيكل عجلة العربة وكثيراً ما يتم فقدان أثناء الخطوات المختلفة لعزل9. وثانيا، أبعاد مريكز قريبة جداً من الحد حيود في المجهر الضوئي. في الواقع، هو القرار الجانبية التي يمكن الحصول عليها في الفحص المجهري [كنفوكل] حوالي 200 نانومتر24، مماثلة للقطر مريكز، والقرار في ض-محور عن 2 – 3 س أقل، مما يؤدي إلى وحدة تخزين متباين. وثالثاً، يمكن أن يحد إلى التباين في اتجاه وضع العلامات ومريكز جسم تفسير الحاجة إلى ترجمة بروتين في منطقة سينتريولار الفرعية محددة. وأخيراً، توجد centrioles في نسختين فقط كل خلية، مما يجعل من الصعب الحصول على عدد كبير من الصور، والبحث عن اتجاه مريكز لا لبس فيها. للالتفاف حول هذه المسائل التقنية، قمنا بتطوير أسلوب يعتمد على تطبيق القرار فائقة مجهرية على عدد كبير من centrioles المعزولة التي تعتمد التوجهات المختلفة. نحن سوف تصف أول بروتوكول لتنقية رينهاردتي C. centrioles التي تمكن من تنقية centrioles سليمة هيكلياً وبروسينتريوليس التي تحتوي على عجلة العربة. ثم، ونحن سوف تصف بروتوكول خطوة بخطوة للتركيز centrioles على كوفيرسليبس للتصوير بواسطة التقليدية أو مجهرية فائقة القرار الفلورسنت. تسمح هذه الخطوة هامة لزيادة عدد centrioles تصويرها في اتجاهات متعددة. وأخيراً، نحن سوف تصف إجراء لإجراء واحد-الجسيمات في المتوسط على البيانات التي يحصل عليها من شأن المجاهر الفلورسنت التي تسهل الكشف عن centrioles في اتجاهات مختلفة. إجمالاً، يمكن تطبيقها على الصورة centrioles هذا الأسلوب من مختلف الأنواع أو التجميعات الجزيئات الكبيرة الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioles تجميعات الجزيئات الكبيرة الهامة للتنفيذ السليم للعمليات البيولوجية الخلية الأساسية مثل انقسام الخلية أو حركية الخلية إشارات الخلية. الطحالب الخضراء رينهاردتي تشلاميدوموناس ثبت أن طراز الثاقبة في دراسة الهندسة المعمارية مريكز، الدالة، وتكوين البروتين. وعلى الرغم من التقدم الكبير نحو فهم بنية سينتريولار، أحد التحديات الراهنة تحديد التعريب الدقيق لمكونات سينتريولار داخل المناطق الهيكلية مريكز من أجل فهم أفضل لدورها في مريكز نشوء حيوي. قيداً رئيسيا يكمن في حل مجهرية الأسفار، مما يعقد تفسير التعريب البروتين في هذا عضية مع أبعاد قريبة من الحد حيود. لمعالجة هذه المسألة، ونحن نقدم وسيلة لتنقية والصورة عدد كبير من رينهاردتي C. centrioles مع توجهات مختلفة باستخدام الفحص المجهري القرار فائقة. هذا الأسلوب يسمح لمزيد من المعالجة للبيانات عن طريق فلوري واحد-الجسيمات المتوسط (فلوو-سبأ) نظراً للعدد الكبير من centrioles المكتسبة. فلوو-سبأ يولد متوسطات الملون centrioles C. رينهاردتي في توجهات مختلفة، وبالتالي تيسير إضفاء الطابع المحلي على البروتينات متميزة في المناطق الفرعية سينتريولار. الأهم من ذلك، يمكن تطبيق هذا الأسلوب بصورة centrioles من الأنواع الأخرى أو التجميعات الجزيئات الكبيرة الأخرى.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

والعزلة وتصوير الأسفار لتعمير واحد-الجسيمات Chlamydomonas Centrioles

قمنا بتطوير استراتيجية لتنقية والصورة عدد كبير من centrioles في توجهات مختلفة قابلة للفحص المجهري القرار فائقة والجسيمات واحد في المتوسط.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في مجال المركزية، مثل توطين البروتين إلى منطقة معينة من الناحية المركزية. الميزة الرئيسية لهذه التقنيات التي نقدمها وسيلة لتركيز المركزية للحصول عليها في اتجاهات متعددة. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤى في علم الأحياء السنتية الكلاميومودوناس، فإنه يمكن أيضا أن تطبق على نظام آخر، مثل الإنسان المعزول وcparmecium centrioles.ومن خلال هذا الإجراء، سيكون طالب الدكتوراه نيكولاي كلينا، وطالبة دكتوراه أخرى هي مايفا لو غيينك، وطالبة ما بعد الدكتوراه في المختبر دافيدي غامباروتو. لبدء هذا الإجراء أولاً تحضير كافة الوسائط و الثقافة الخلايا C.Reinhardtii كما هو موضح في بروتوكول النص. نقل الخلايا المعدة إلى أنابيب مخروطية 50 ملليلتر والطرد المركزي لهم في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق.غسل بيليه مرة واحدة مع 50 ملليلتر من 1X PBS وتدور الخلايا مرة أخرى في 600 مرات ز لمدة 10 دقيقة. استخدام ماصة لإعادة تعليق بيليه في 100 ملليلتر من درجة حرارة الغرفة العازلة الجزال. ضع الكأس على مُحرك مغناطيسي، وأضيف ببطء 0.5 حمض الخليك المولي إلى الأسي فير النهائي من 4.5 إلى 4.7.اسمحوا هذا الخليط احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد هذا ببطء إضافة قطرات من هيدروكسيد البوتاسيوم العادي لاستعادة السيد الهز إلى 7.0، ونقل الخلايا إلى أنابيب 50 ملليلتر، والطرد المركزي لهم في 600 مرة ز لمدة 10 دقائق، لإزالة أي flagella منفصلة. تجاهل المابير وتخزين بيليه على الجليد حتى جاهزة للاغتسال.عندما تكون جاهزة، وغسل بيليه مرتين باستخدام 50 ملليلتر من 1X PBS في أربع درجات مئوية لكل غسل. تدور بيليه غسلها في 600 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق. Resuspend بيليه في 30 ملليلتر من 1X PBS.ثم, ببطء تحميل التعليق على وسادة 20 ملليلتر من 25٪ السكروز, دون خلط. تدور في 600 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة لإزالة أي flagella المتبقية ونشر الخلايا في السكروز. باستخدام الطامح، وpirpirate بعناية عظمى حفظ فقط أسفل معظم 20 ملليلتر.غسل السكروز المتبقية بإضافة 20 ملليلتر من برنامج تلفزيوني 1x الباردة. أجهزة الطرد المركزي في 600 مرة ز و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إعادة تعليق بيليه في 10 ملليلتر من 1x PBS في أربع درجات مئوية، والتأكد من أنه لا توجد كتل في الحل.نقل بيليه resuspended إلى زجاجة جديدة 250 ملليلتر، إضافة العازلة تحلل، تستكمل مع 5، 000 وحدة من DNase، إلى زجاجة تحتوي على الخلايا. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة، في حين خلط كل 15 دقيقة عن طريق قلب بعناية الزجاجة. نقل الخلايا الميسوسة إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وطاردة مركزية في 600 مرة ز وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.باستخدام ماصة، وجمع نابيربيرت وتحميله في أنبوب 30 ملليلتر جولة القاع على الجليد تحتوي على اثنين من ملليلتر من 60٪ وسادة السكروز. الطرد المركزي هذا في 10،000 مرة ز لمدة 30 دقيقة في أربع درجات مئوية. بعد هذا، الطامح فوق مليلتر واحد فوق وسادة السكروز.لاحظ الواجهة الصفراء بين ملليلتر واحد من عظمى المتبقية، ومليلتر اثنين من وسادة السكروز. باستخدام قطع P1000 تلميح، بلطف خلط عظمى المتبقية مع السكروز. تجمع كل من وسائد السكروز وتخزينها على الجليد.المقبل, إعداد 40٪ إلى 70٪ sucrose التدرج في رقيقة الجدران 38.5 ملليلتر أنابيب البولي بروبلين كما هو مبين في بروتوكول النص. قم بتحميل الواجهات المجمّعة ببطء في التدرج. موازنة الأنابيب مع 10 ميليمولار K-PIPES العازلة، والطرد المركزي في 68، 320 مرات ز وأربع درجات مئوية لمدة 75 دقيقة.بعد ذلك، استخدم إبرة 0.8 ملليمتر لجعل ثقب في الجزء السفلي من الأنبوب، والتأكد من عدم إزعاج طبقات السكروز المختلفة. استخدام هذه الحفرة لجمع 12 500 كسور ميكرولتر في أربع درجات مئوية. باستخدام قطع P200 تلميح، وإعداد إضافية 10 ميكرولتر aliquot من كل كسر لاستخدامها أثناء immunofluorescence.ثم، المفاجئة تجميد الكسور في النيتروجين السائل. للبدء، ضع غطاء 12 ملليمتر معقمة على الطرف السفلي المُعطل من المُركز، مع التأكد من إبقاء الجانب المغلف بـ PDL أسفلًا. وضع محول مباشرة على القمة، لسقف الغطاء.ثم، عكس أنبوب مستدير القاع ووضعها على المكثف، coverslip، والمحول. باستخدام ملاقط، ودفع بلطف الفرقة حتى تصل إلى الجزء السفلي من الأنبوب، ومن ثم عكس الأنبوب. أضف 10 ملليمولار من المخزن المؤقت K-PIPES حتى يصل إلى أعلى المكثف.تأكد من عدم وجود فقاعات في الاسطوانة المركزية للمكثف. إضافة بلطف 100 ميكرولترات من 10 ميليمولار K-PIPES العازلة إلى واحدة من aliquots من جزء هليولار المخصب ومزيج شامل باستخدام ماصة P200. بعد ذلك، قم بإزالة 100 ميكرولترات من المخزن المؤقت K-PIPES من مركز المُركز المجوف، وإضافة 100 ميكرولترات من خليط الكسر العازل، مع التأكد من أن المحتويات تبقى في مركز المُركز المجوف.تدور عند 10,000 مرة ز لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي يتم تبريده مسبقاً إلى أربع درجات مئوية. بعد ذلك، استخدم ملاقط لإزالة المكثف. أدخل جهازًا يدويًا في الثقب الموجود في الحافة المشقوقة للمحول ورفعه بلطف لاستعادة الغطاء.بمجرد أن تصل إلى أعلى الأنبوب ، استخدم إصبعًا قفازًا لمحاصرة حافة المحول واستخدام ملاقط لإزالة الغطاء ، مع الأخذ في الاعتبار أي جانب من الأغطية يحتوي على قنطار. ثم, أداء التثبيت وصبغ المناعة من تمركز. للبدء، احتضان الأغطية مع المستويات المركزية في مربع مختبر انتقال البوليسترين الكريستال المعدة مليئة 100٪ الميثانول في ناقص 20 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.باستخدام ملاقط، نقل الأغطية إلى مربع مختبر شفاف مملوءة 50 ملليلتر من 1X PBS. دع الشرائح تغسل في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، ماصة 60 ميكرولترات من مزيج الأجسام المضادة الأولية على قطعة من التفاف ختم المختبر في غرفة مرطبة.ضع بعناية في الأغطية على رأس مزيج الأجسام المضادة مع الأساليب المركزية التي تواجه الانخفاض مباشرة. دع الغطاءات تحتضن لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، قم بإزالة الأغطية واغسلها في صندوق يحتوي على PBS لمدة خمس دقائق.احتضان الأغطية المغسولة لمدة 45 دقيقة ، مع أجسام مضادة ثانوية في PBS 1 ٪ BSA و 0.05 ٪ Tween -20. إزالة الأغطية وغسلها لمدة خمس دقائق في مربع يحتوي على برنامج تلفزيوني. باستخدام العادي المضادة للتلاشي تصاعد المتوسطة، تحميل الغطاء على شريحة.ثم، صورة هئية معزولة على مجهر confocal في هدف النفط 63X مع N.A.of 1.4، في حين تطبيق deconvolution. قم بإعداد الموضع العلوي والسفلي للرصة Z فوق إشارة القيادة المركزية وأسفلها، على التوالي، والحصول على مجموعة كبيرة من الصور التي تتألف من إجمالي إشارة المركزية. قم بـ Project المكدس و تنفيذ متوسط جسيمات مفردة كما هو موضح في بروتوكول النص.ويكشف الفلور المناعية التمثيلية أن ستة كسور يتم إثراؤها من أجل الكسور المركزية المعزولة، مع ذروة للكسر رقم ثلاثة، في حين أن الكسرين الأخيرين لا يتم ذلك، مما يشير إلى أن التنقية ناجحة. فقط حوالي 30 وينظر إلى 30 centrioles لكل مجال من وجهات النظر دون المكثف، في حين ينظر 183 مع المكثف. وهذا يدل على أن خطوة المكثف ناجحة، ويسمح بإثراء ستة أضعاف من القطاعات المركزية في منطقة محددة، مما يجعل من الأسهل للكشف عنها وصورتها.ثم يتم استخدام المجهر فائقة الدقة لتصوير سينيريوليس ملطخة لـ monoglutamylated tubulin ، ويتم استخدام البرامج لتوليد متوسط شبه مثالي لكل توجه مختار. بعد خمسة تكرارات، تم إنشاء فئتين من المتوسطات من الأساليب المركزية أحادية الولاتمة: عرض علوي من 63 كائنًا وعرض جانبي من 98 جسيمًا. طول متوسط فئة الرؤية الجانبية هو 260 نانومتر مع قطر 250 نانومتر، مقارنة بإشارة توبولين مونجلوتال التي يتم قياسها التي ينظر إليها لتوطين داخل قلب centriole.أثناء تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على العزلة المركزية على الجليد وتجميدها بعد العزل. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء طريقة أخرى، مثل المجهر الإلكترونات التبريد وقياس الطيف الشامل من أجل الإجابة على سؤال إضافي، مثل الهندسة المعمارية الأصلية لل centriole أو تكوين البروتين المركزية.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

وفصل التزاوج من الرباعيات المتلحفة reinhardtii عن التحليل الوراثي

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

ولد لتطبيع الإسفار التصوير المقطعي الإسقاط الضوئية للتصوير القلب الجامع

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

جرحشاعثزرحشرتاد الإسفار عن التصوير المقطعي في الجسم الحي. تصوير النامية ذبابة الفاكهة</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

الوقت الفاصل بين التصوير من الانقسام الميتوزي بعد ترنسفكأيشن سيرنا

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

واحد المجهر الإلكتروني التعمير الجسيمات مجمع Exosome باستخدام أسلوب عشوائي الخيمة المخروطية

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis والمجهرية للتصوير الإسفار Intravital للدوران الأوعية الدقيقة

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

التصوير والإعمار 3D من الهياكل الدماغية في الجنينية اسماك الزرد

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

التصوير مضان مع نانومتر دقة واحدة (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...