Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Vi takke Pierre Gönczy og BioImaging & optik Platform (BIOP) på École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Schweiz, hvor SIM-billederne af centrioler blev erhvervet. Nikolai Klena og Davide Gambarotto er støttet af det Europæiske Forskningsråd (ERC) start Grant (StG) 715289 (ACCENT) og Maeva Le Guennec, Paul Guichard og Virginie Hamel af Swiss National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers understøttes af Geneves Universitet.

<ol>
	<li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+in+cells+and+organisms.">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li><li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+and+only+once:+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease.">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrioles,+centrosomes,+and+cilia+in+health+and+disease.">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li><li>G&#246;nczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly.">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li><li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+organization+and+centriole+architecture:+their+sensitivity+to+divalent+cations.">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li><li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+structure.">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+basal+bodies+in+paramecium.">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).</li><li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis.">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li><li>Li, S., Fernandez, J. -. J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography.">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li><li>Guichard, P., Chr&#233;tien, D., Marco, S., Tassin, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography.">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry.">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li><li>Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartwheel+assembly.">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes.">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li><li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure.">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li><li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging.">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis.">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li><li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii.">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).</li><li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus:+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body.">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, 2663-2674 (2004).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy.">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms.">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813 (2017).</li><li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology.">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li><li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Approaches+to+the+Study+of+the+Role+of+Metals+in+the+Metabolism+of+Microorganisms.">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li><li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles.">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li><li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyVolution-the+smart+path+to+confocal+super-resolution.">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+3D-SIM/SMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+&#8764;4-5+nm.">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of &#8764;4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li><li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+lytic+enzymes+(autolysins)+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+(hydroxy)proline-specific+proteases.">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li><li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images.">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

En af udfordringerne i biologi er at dechifrere det nøjagtige lokalisering af proteiner i en arkitektonisk kontekst. Centriole er en ideel struktur at anvende disse metoder, som dens arkitektur er blevet undersøgt ved hjælp af cryo-elektron tomografi, afslørende interessante ultrastrukturelle træk langs dens længde. På grund af sine dimensioner tæt på opløsning grænse i Optisk mikroskopi, er det imidlertid vanskeligt at lokalisere netop et protein ved immunfluorescens til en strukturel underregion af centriole ved hjælp af konventionelle mikroskoper30.
Opløsning i Optisk mikroskopi er begrænset af diffraktion af lys, der giver nogenlunde, lateral maksimal opløsning på 200 nm i Optisk mikroskopi24. Denne begrænsning har imidlertid været omgås ved en af de store gennembrud i de sidste 20 år i Optisk mikroskopi: opfindelsen af super-resolution metoder. Disse tilgange kan billedet over diffraktion grænser på forskellige beslutninger: 120 nm for SIM, omkring 50 nm for stimuleret emission udtynding (STED) og 20 – 40 nm for enkelt-molekyle lokalisering mikroskopi (SMLM)24. Med disse nye udviklinger super-resolution mikroskopi er de strukturelle subregioner af centriole opnåelige. I praksis er det imidlertid stadig vanskeligt at præcist bestemme lokalisering af et protein til et strukturelt element til hovedårsagen til, at de modne centrioler findes i kun 2 eksemplarer pr. celle og har tilfældige retningslinjer, hvilket gør fortolkningen af lokalisering vanskeligt. Derfor, blev en protokol, der oprettet som gør det muligt for forskere at billede af super-resolution et stort antal centrioler, øge chancen for at observere ikke-tvetydige retningslinjer. Vigtigere, da denne metode er baseret på brugen af isolerede centrioler, vi leverer en metode til at rense intakt C. reinhardtii centrioler, der indeholder modne centrioler og procentrioles.
Endelig, på grund af vifte af centriole retningslinjer, der kan være afbildet med denne protokol, enkelt-partikel analyse kan anvendes ved hjælp af elektronmikroskopi software. Dette resulterer i generation af gennemsnitlige klasser af centrioler i en bestemt retning. Vigtigere, kan disse fremkomne 2D-billeder derefter bruges til at vurdere lokalisering af et specifikt protein langs centriole. Denne metode kan anvendes på billeder med dual-farve Super-opløsning, og en farve kan bruges til at afsløre centriole skelettet (fx, tubulin), mens anden farven kan henføres til en specifik centriolar protein. Ved at fratrække de gennemsnit opnået med én farve eller to farver, bliver det lettere at registrere et protein langs centriole (proksimale, central eller distale). Bemærk at de to kanaler skal justeres nøjagtigt for at undgå eventuelle vildledende fortolkninger. Derudover vil gennemsnit af top synspunkter hjælpe dechifrere hvis et protein lokaliserer inde centriolar lumen, langs en mikrotubulus væg, eller uden for centriole.
Denne metode har fordelen at fastslå lokalisering af specifikke proteiner, der kunne være svært at lokalisere ellers på grund af heterogene mærkning. Bemærk, at andre metoder til at kortlægge proteiner inden for centrioler er beskrevet korrelationsmaalinger 3D-SIM/SMLM med, for eksempel vurdering af de specifikke retningslinjer for centrioler ved at bestemme de elliptiske profil af en markør, der danner en torus omkring den centriole af SIM-billeddannelse. Med denne parameter, er det muligt at lokalisere protein med en præcision på 4 – 5 nm30. Bemærk også, at den beskrevne metode her bruger isolerede centrioler med intakt procentrioles, et tegn på, at centriole arkitekturen er sandsynligvis i vid udstrækning bevaret. Men vi kan ikke udelukke der nogle arkitektoniske træk er forstyrret under rensningen, såsom centriole diameteren varierer med koncentrationen af divalent kationer, som forstærkes med isolering af den menneskelige centrosome5.
En af de kritiske trin i protokollen præsenteres her er at få tilstrækkelig koncentreret isolerede centrioler i forskellige orienteringer imødekommenhed over for Fluo-SPA. Det gør du ved først sikre renheden og effektiviteten af proceduren centriole isolation. En lav koncentration af isolerede centrioler vil forhindre korrekt imaging og yderligere billedbehandling. Til dette formål leverer vi en metode til at berige antallet af centrioler per synsfelt. Afhængigt af antallet af centrioler i den brøk, der anvendes, skal lydstyrken indlæst i koncentratoren, der justeres, med en maksimal volumen på 250 µL.
Vigtigst, er denne metode blevet udviklet til en cellevæg minus cw15-C. reinhardtii celler. I denne stamme, skrøbelighed af cellevæggen giver mulighed for en ordentlig lysering af celler og dermed, befrielsen af dens indhold. Denne protokol er ikke effektive for wild-type C. reinhardtii celler, som cellevæggen forhindrer en ordentlig lysering. Alternative strategier såsom sonikering eller en præ-inkubation af celler med autolysin, et enzym, der kan forringe cellevæg31, skulle sættes på plads til at ændre cellevæg fÃ¸r isolation protokollen præsenteres her.
Denne opsætning kan bruges med forskellige typer mikroskoper, lige fra konventionelle Konfokal mikroskoper til høj overførselshastighed dedikeret super-resolution mikroskoper. Bemærk, at når du laver SMLM, en speciel buffer er nødvendig for korrekt imaging og således et kammer, der er tilpasset til en 12 mm coverslip med buffer oven på coverslip skal bruges. Efterfølgende billedbehandling vil blive udført med inverterede mikroskoper. Hvis mikroskop set-up ikke tillader en 12 mm coverslip, kan protokollen præsenteres her anvendes på 18 mm coverslips ved hjælp af et 30 mL runde-nederste rør og en modificeret adapter og koncentrator. Det er også vigtigt at Bemærk at kvaliteten af den endelige genopbygning i SMLM vil afhænge af kvaliteten af farvning og af det primære antistof bruges som metode til fiksering.
I sammendrag leverer vi en metode, der kan anvendes til billede talrige centrioler efterfulgt af Fluo-SPA, vil generere gennemsnit af centrioler i forskellige retninger, hvilket bidrager til at lokalisere centriolar protein med præcision. Vigtigst, kan denne metode anvendes mere generelt isolerede centrioler fra andre arter, andre organeller eller store makromolekylære forsamlinger. Endelig stikprøve forberedelse tilgang præsenteres her, kombineret med nylige udvikling af algoritmer for enkelt-partikel analyse af fluorescerende SMLM data32, kunne åbne yderligere forbedring i den molekylære kartografi af store makromolekylære assemblies.

Centriole er en evolutionært bevarede organelle, der ligger kernen i centrosome i animalske celler og kan fungere som en basal krop (refereret til som centrioler herefter) til skabelon cilia eller flageller i mange eukaryoter1,2. Som sådan er centrioler afgørende for grundlæggende celle biologiske processer lige fra spindel forsamling til celle signalering. Derfor, defekter i centriole forsamling eller funktion er blevet forbundet med flere menneskelige sygdomme herunder ciliopathies og kræft3.
Centrioler er nine-fold, symmetrisk, mikrotubulus triplet-baserede cylindrisk strukturer der er, typisk ~ 450 nm lang og ~ 250 nm bred4,5,6,7. Konventionelle elektronmikroskopi og cryo-elektron tomografi af centrioler fra forskellige arter har afsløret, at centrioler er polariseret langs deres længdeakse med tre forskellige regioner: en proksimal region, en central kerne og en distal region5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. vigtigere, hver af disse regioner viser strukturelle særegenheder. Først, lumen af 100 nm-lange proksimale regionen indeholder vejrmølle struktur tilsluttet mikrotubulus triplet gennem knappenålshoved element12. Andet, 300-400 nm-lange centrale region indeholder fiber tætheder i funktionerne lumen og strukturelle langs indersiden af mikrotubuli: den Y-formede linker, C-tubulus hale og A-tubulus stub9. Endelig, 50 – 100 nm distale region udstiller sub distale og distale vedhæng, der omgiver den distale del af centriole5,13.
De sidste to årtier har været præget af opdagelsen af et stigende antal centriolar proteiner, fører til en aktuel vurdering af omkring 100 forskellige proteiner er en del af centriole14,15,16, 17. trods disse fremskridt, den præcise lokalisering af disse proteiner inden for centriole er stadig undvigende, især inden for strukturfondene subregioner. Vigtigere, er tildele en præcis lokalisering til strukturelle regioner af centriole afgørende for en bedre forståelse af deres funktion. I denne henseende, har C. reinhardtii centrioler været medvirkende til begge aspekter af første delimitating de forskellige strukturelle egenskaber langs den cylinder9,18,19, som derefter tilladt forskere til at korrelere lokalisering af en delmængde af proteiner ved hjælp af fluorescerende mikroskopi til en sub strukturelle region. Dette omfatter for eksempel, de proteiner, Bld12p og Bld10p, som Lokaliser i den proksimale region og i strukturen vejrmølle især20,21,22,23. Listen over underkonstruktionen lokaliseret proteiner indeholder også POB15 og POC16, to nye proteiner identificeret ved massespektrometri, dekorere regionen indre centrale kerne af C. reinhardtii centrioler17.
Dette papir giver en fuldstændig beskrivelse af den metode, der er udviklet til at isolere og image C. reinhardtii centrioler for efterfølgende super-resolution mikroskopi og enkelt-partikel gennemsnit. For at nå dette mål, er det vigtigt at afgrænse de tekniske begrænsninger, der skal overvindes. Første, centriole rensning kan påvirke den overordnede arkitektur, med vejrmølle strukturen ofte går tabt under de forskellige trin i isolation9. For det andet, dimensioner af centriole er meget tæt på diffraktion grænse i Optisk mikroskopi. Faktisk, den laterale opløsning, der kan opnås i Konfokal mikroskopi er omkring 200 nm24, svarende til diameteren af centriole, og opløsningen i z-akse er omkring 2-3 x lavere, fører til en anisotrope volumen. For det tredje kunne heterogenitet af antistof mærkning og centriole orientering begrænse tolkningen skulle lokalisere en protein i en bestemt centriolar subregion. Endelig findes centrioler i kun to eksemplarer pr. celle, hvilket gør det vanskeligt at erhverve et stort antal billeder og finde en entydig centriole orientering. For at omgå disse tekniske spørgsmål, udviklede vi en metode, der bygger på anvendelse super-resolution mikroskopi på stort antal isolerede centrioler, at vedtager forskellige retningslinjer. Først vil vi beskrive en protokol for at rense C. reinhardtii centrioler, der gør det muligt for rensning af strukturelt intakt centrioler og procentrioles indeholdende vejrmølle. Derefter vil vi beskrive en trinvis protokol for at koncentrere centrioler på coverslips til billeddannelse af konventionelle eller Super-resolution fluorescerende mikroskopi. Dette vigtige skridt giver mulighed for at øge antallet af centrioler afbildet i flere retninger. Endelig vil vi beskrive en procedure for at udføre enkelt-partikel gennemsnit på data erhvervet på fluorescerende mikroskoper, der letter påvisning af centrioler i forskellige retninger. Helt, denne metode kan anvendes på billedet centrioler fra forskellige arter eller andre store makromolekylære forsamlinger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioler er store makromolekylære forsamlinger vigtigt for korrekt udførelse af grundlæggende celle biologiske processer såsom celledeling, celle motilitet, eller celle signalering. Grønalger Chlamydomonas reinhardtii har vist sig for at være en indsigtsfuld model i studiet af centriole arkitektur, funktion og protein sammensætning. Trods store fremskridt mod forståelse centriolar arkitektur er en af de aktuelle udfordringer at bestemme den nøjagtige lokalisering af centriolar komponenter inden for strukturel regioner af centriole for bedre at forstå deres rolle i centriole Biogenese. En stor begrænsning ligger i løsningen af Fluorescens mikroskopi, hvilket komplicerer fortolkningen af protein lokalisering i denne organelle med dimensioner tæt på diffraktion grænse. For at tackle dette spørgsmål, leverer vi en metode til at rense og billed et stort antal C. reinhardtii centrioler med forskellige orienteringer bruger Super-resolution mikroskopi. Denne teknik giver mulighed for yderligere behandling af data gennem fluorescerende enkelt-partikel gennemsnit (Fluo-SPA) på grund af det store antal af centrioler erhvervet. Fluo-SPA genererer gennemsnit af farves C. reinhardtii centrioler i forskellige retninger, således at lette lokaliseringen af forskellige proteiner i centriolar subregioner. Vigtigst, kan denne metode anvendes på billedet centrioler fra andre arter eller andre store makromolekylære forsamlinger.

C. reinhardtii Centriole Isolation: For at isolere centrioler, cw15- C. reinhardtii celler blev dyrket i flydende kultur i flere dage under lys og efterfølgende pelleted ved centrifugering ved 600 x g i 10 min. Pelleted celler blev vasket 1 x med PBS og resuspenderet i en deflagellation buffer forud for deflagellation ved at udføre en pH chok ved hjælp af 0,5 M eddikesyre til et slut-pH på 4,5-4.7 for 2 min(figur 1). Tilføjelse af 1 N KOH blev brugt til at genoprette pH 7.0. For at adskille fritliggende flageller fra celle organer, blev deflagellated celler først centrifugeres for at fjerne hovedparten af flageller. Bundfaldet blev så vasket 2 x med PBS og genopslemmes i 30 mL PBS forud for lastning det langsomt på en 25%-saccharose pude (figur 1B). Røret blev spundet på 600 x g i 15 min. ved 4 ° C til at fjerne de fleste af de fritliggende flageller. Efter centrifugering, celle organer blev spredt i saccharose pude (figur 1C) og inddrives ved at fjerne den ca. 30 mL af supernatanten (indtil den røde pil i figur 1C). Den resulterende 20 mL af vasket celler blev derefter genopslemmes i 20 mL koldt PBS og centrifugeres ved 600 x g i 10 min. Næste, supernatanten blev kasseret, og cellerne var helt genopslemmes i 10 mL PBS. Cellerne blev overført til en 250 mL flaske og lysisbuffer blev føjet til de resuspenderede celler på én gang. DNase blev føjet til lysis og inkuberes i 1 time ved 4 ° C. Efter centrifugering skridt til at fjerne celle debris (se den hvide pellet i figur 1D), supernatanten blev indsamlet og omhyggeligt læsset på en 2 mL 60%-saccharose pude inden centrifugering ved 10.000 x g i 30 min. ved 4 ° C. Bemærk, at for 100 mL lysis, 8 rør på 15 mL blev brugt til at udføre dette trin, svarende til 12,5 mL lysisbuffer indlæst på 2 mL af saccharose pr. rør. Efter centrifugering, de fleste af supernatanten blev fjernet op til 1 mL over puden. Resterende supernatanten 1 mL blev derefter indsamlet med 2 mL pude og derefter blandes og samles for at opnå en endelige mængden af 24 mL. Poolen blev derefter læsset på en 40% - 50%-, 70%-saccharose gradient og spundet på 68,320 x g i 1 h og 15 min. ved 4 ° C. Endelig, de isolerede centrioler blev indsamlet ved at gøre et hul i den nederste del af centrifugering røret ved hjælp af en nål og dråberne blev indsamlet i 12 x 500 µL fraktioner. På grund af den høje koncentration af de forskellige saccharose, drop dannet meget langsomt i begyndelsen (70% saccharose) og så mere hurtigt (40% saccharose).
Immunfluorescens af isolerede centrioler For at vurdere kvaliteten af proceduren isolation, blev 10 µL af hver indsamlet gradient fraktion derefter centrifugeres på en coverslip ved hjælp af en coverslip støtte adapter (figur 2A-2D). Vigtigere, for at fjerne sikkert coverslip, en brugerdefineret hooked enhed var designet (figur 2B). Næste, coverslips blev analyseret ved immunfluorescens. Antistoffer mod CrSAS-6(Bld12p) blev brugt i denne undersøgelse til at indikere tilstedeværelsen af vejrmølle struktur og α-tubulin (DMA1) til at fremhæve den centriolar væg. Ved at tælle antallet af centrioler, der var positive for både CrSAS-6 og α-tubulin per synsfelt og derefter beregning af det samlede antal centrioler pr. brøker, var det muligt at fastslå, hvilke fraktioner var beriget til isolerede centrioler ( Figur 2F-2 H). Interessant, var 6 fraktioner beriget til centrioler (figur 2F og 2 G, brøker #1 – 6), med et højdepunkt for brøkdel #3, mens de sidste fraktioner var ikke, som angiver, at rensning arbejdede. Bemærk, at i denne særlige eksperiment, 95% af de samlede centrioler var positiv for CrSAS-6 og α-tubulin i brøkdel #3. Dette indikerer, at mest isolerede centrioler beholdt deres vejrmøller. Hvis ingen berigelse af centrioler er iagttaget i de første brøkdele, isolation procedure virkede ikke og bør gentages. Bemærk at nogle flagellaternes stykker kan iagttages for det meste i brøker centrioler.
Næste, hvis du vil beregne det samlede antal centrioler pr. µL, antallet af centriole pr. synsfelt skal ganges med forholdet som præsenteret i figur 2H. Det resulterende tal skal divideres derefter med omfanget af den brøk, der anvendes for immunofluorescens for at få antallet af centrioler pr. µL. I denne særlige isolation procedure indeholdt den mest beriget brøkdel omkring 37 centrioler for et område med 0.00846 mm2 (med et synsfelt på 92 x 92 µm2). Overfladen af afsnittet tube var 7,5 mm radius med et samlet areal på 176 mm2. Tilsvarende forholdet blev derefter 176/0.00846 = 20,803.8, så alt 769,740 centrioler (37 x 20, 803.8) i 10 µL. Derfor blev antallet af centrioler i 1 µL 76,974.
Koncentrationen af isolerede centrioler på Coverslips: Øge antallet af centrioler pr. felt øger chancen for påvisning af utvetydig centriole orientering, samt øge chancen for at afsløre ens retningslinjer, der kan bruges til yderligere partikel gennemsnit procedurer. Som centrioler fra de koncentrerede fraktioner er stadig sparsomme på coverslip, udviklet vi en centrifugering tilbehør for at koncentrere centrioler i midten af coverslip (fig. 3A) opkaldt en koncentrator. Bemærk, at en .stl fil med de præcise foranstaltninger for 3D-udskrivning er forsynet med dette håndskrift.
Først, en coverslip af 12 mm var monteret på koncentrator (fig. 3B). Adapteren var anbragt oven på coverslip og runde-nederste rør blev omvendt og placeret over den forsamlede adapter og koncentrator. Runde-nederste rør blev derefter forsigtigt omvendt, således at indlæsning af prøven (protokol trin 4.2). Centrioler blev derefter centrifugeres ved 10.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Efter at centrioler underkastes immunofluorescens og farves CrSAS-6/Bld12p og α-tubulin (figur 3 c-3E). Vigtigere, uden koncentrator, blev ca. 30 centrioler set per synsfelt (figur 3C), mens 183 centrioler blev set per synsfelt, når koncentratoren, der blev brugt (figur 3D-3F). Bemærk at centrioler dækkede kun en disk af 4 mm i diameter i midten af coverslip. Dette resultat viser, at koncentration trin virker og giver mulighed for en 6-fold berigelse af centrioler i et defineret område af coverslips, således lette deres registrering og billeddannelse.
Fluorescerende enkelt-partikel gennemsnit af isolerede C. reinhardtii centrioler: Her, ved hjælp af SIM-mikroskopi, der kan nå en opløsning på omkring 120 nm, centrioler farvet for monoglutamylated tubulin (GT335, figur 4), en tubulin ændring findes i centriolar mikrotubuli, blev afbildet24. C. reinhardtii centrioler er omkring 500 nm lang, altid parvis, og ofte fundet med forbundet, nyligt duplikeret probasal organer (refereret til som procentrioles herefter) og tværstribede mikrotubulus-associerede fibre19. Derfor, denne endelige samling var ca. 1 µm store. Af denne grund, og for at billedet centrioler i deres helhed, anbefaler vi erhverve en Z-stack på de isolerede centrioler.
Her, efter overtagelsen, blev en endelige billede genereret ved at udføre en maksimal intensitet projektion ved hjælp af ImageJ28 (billedet/stabler/Z projekt/max intensitet projektion, fig. 4B). En enkelt-partikel analyse ved hjælp af cryo-electron microscopy software blev udført for at gøre klasser af centrioler med lignende retningslinjer fra sådanne billeder, og derefter i gennemsnit blev udført. For at gøre det, var billedfarve først omvendt for at bedre visualisere objekter (fig. 4C). Centrioler blev plukket manuelt i en box centreret over hver partikel ved hjælp af den frit tilgængelige Scipion software29 der integrerer flere elektronmikroskopi software-programmer såsom Xmipp3 (figur 4D). Bemærk, at størrelsen på boksen skal defineres af brugeren. Her, kasser med 50 x 50 pixel for pixelstørrelse af 31.84 nm blev brugt. Næste, alle partikler blev udvundet (figur 4E) og justeret ved hjælp af Xmipp3 (fig. 4F). Næste, en cirkulær maske på 12 pixel i radius blev anvendt for at isolere hvert centriole fra centriolar-par (fig. 4G). Partiklerne blev derefter klassificeret, ved hjælp af Xmipp3, til at generere flere gennemsnit. Kun blev homogen klasse gennemsnit holdt, hvilket betyder, at partikler, der afviger fra de klasse gennemsnit udelukkede manuelt. Dette skridt blev gentaget for at generere en næsten perfekt gennemsnit for hver valgte orientering. Efter fem gentagelser, to klasser af gennemsnit blev genereret: en top Se fra 63 objekter (figur 4H) og en side udsigt fra 98 partikler (figur 4jeg) af monoglutamylated centrioler. Dimensioner af objektet blev bestemt ved at måle afstanden mellem toppene af intensitet plot profil langs monoglutamylation signal.
Vigtigere, længden af sideudsyn klasse gennemsnit er 260 nm med en diameter på 250 nm, sammenlignes med det målte monoglutamylated tubulin signal, som blev vist til at lokalisere en region af 286 ± 33 nm længde i kernen af centriole17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> Figur 1 : Rensning af C. reinhardtii centrioler. (A) Dette er en skematisk gengivelse af hvert trin fører til isolation af C. reinhardtii centrioler. Det omfatter repræsentative trin af før-protokollen (B) og (C) efter centrifugering på 25%-saccharose gradient. Den røde pil i panelet C angiver den mindste volumen at holde efter centrifugering. (D) dette panel viser den hvide pellet mængden celler efter centrifugering. Den sorte pil angiver pelleten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> Figur 2 : Centrifugering set-up til at udføre immunofluorescens på isoleret centrioler. (A) 10 µL af hver indsamlet fraktion er fortyndet først i 100 µL af 10 mM K-rør (pH 7,2). (B) Dette er en skematisk fremstilling af centrifugering enheder, som omfatter en 15 mL runde-nederste rør, en 12 mm coverslip, en adapter til coverslip, og en skræddersyet hooked enhed til at inddrive coverslip efter centrifugering. Paneler C og D viser tegninger forklarer hvor hen til genoprette coverslip efter centrifugering. (C) sted værktøjet hooked ind i hullet i den slidsede kant af adapteren og (D) træk forsigtigt. (E) disse er billeder af fugtkammer kræves for at udføre immunofluorescens billeddannelse. Pilen angiver 12 mm coverslip. (F) disse er repræsentative Konfokal billeder på 63 X (zoome 2) af gradient fraktioner #1-8, indsamlet under proceduren rensning og farves CrSAS-6 (rød) og α-tubulin (grøn). Mellemværker svarer til regionen angivet med en hvid boks i visningerne lavere forstørrelse. Skalalinjen = 10 µm. (G) Dette er en graf, der repræsenterer antallet af centrioler positive for både CrSAS-6 og α-tubulin per synsfelt i hver fraktion. Bemærk berigelsen i fraktioner #1-6. Det gennemsnitlige antal centrioler pr. felt i hver fraktion: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4,6, #3 = 37.0 ± 17,0, #4 = 23,3 ± 11.4, #5 = 14.3 ± 2.1, #6 = 13,7 ± 9.3, #7 = 2,7 ± 1,2, #8 = 1,0 ± 0,0, #9 = 1,0 ± 0,0, #10 = 0.0 ± 0,0, #11 = 0,3 ± 0,6, #12 = 0.0 ± 0,0. For hver fraktion, blev 3 tilfældige felter afbildet. Bemærk, at når tælle de mest beriget brøkdel #3, fandt vi, at 95% af centrioler er positiv for CrSAS-6 og α-tubulin (n = 205 centrioler). (H) A forholdet mellem antallet af centrioler i det målte område af micrographs bruges til at beregne det samlede antal af centrioler i området i røret. Centriole antal pr. µL kan beregnes ud fra 10 µL oprindeligt centrifugeres fraktioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> Figur 3 : Isolerede centrioler er centrifugeres ved hjælp af koncentratorer. (A) dette panel viser centrifugering enheder skulle koncentrere centrioler på coverslips før immunofluorescens, herunder en 15 mL runde-nederste rør, en koncentrator, en 12 mm coverslip og en støtte adapter apparater. (B) dette panel viser de skridt til at samle centrifugering enhed. Paneler C-E viser Konfokal billeder af centrioler farves til CrSAS-6 (rød) og α-tubulin (grøn) (C) uden eller (D-E) med koncentratoren. Mellemværker svarer til regionen angivet med en hvid boks i visningerne lavere forstørrelse. Skalalinjen er 10 µm. Bemærk at centrioler er beriget i midten af coverslip (den prikkede linje repræsenterer grænsen af det koncentrerede område). (F) dette diagram repræsenterer antallet af centrioler per synsfelt uden og med koncentratoren. Fem tilfældige felter synspunkt blev analyseret. Det gennemsnitlige antal centrioler er, uden koncentrator, 29.8 ± 2.9, og med koncentrator, 182.6 ± 11,5, P < 0,0001. Den statistiske signifikans blev vurderet af en uparret t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> Figur 4 : Enkelt-partikel gennemsnit på isolerede C. reinhardtii centrioler. (A) dette panel viser Z stak billeder af centrioler farves med GT335 og anskaffes ved hjælp af en SIM mikroskop. (B) disse paneler viser en maksimal intensitet Z projektion af de stablede billeder. Skalalinjen = 1 µm. (C) disse paneler viser et repræsentativt billede med en inverteret kontrast. Indsatsen repræsenterer en zoom-i at visualisere centrioler bedre. (D) disse paneler Vis partiklen plukke. Indsatsen angiver, hvordan partikler blev plukket. (E) det er eksempler på 5 udvundet partikler. (F) dette panel viser partikler efter justering. (G) dette panel viser partikler efter anvender en maske. Paneler H og jeg viser to klasse gennemsnit: (H) en top view (63 partikler) og (jeg) en sideudsigt (98 partikler). Dobbelt pilene angiver dimensionerne af GT335 signal. Skalalinjen = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a> 
Supplerende fil 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Venligst klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation og fluorescens Imaging for enkelt-partikel genopbygning af Chlamydomonas centrioler

Vi har udviklet en strategi for at rense og billed et stort antal af centrioler i forskellige orienteringer modtagelig for Super-resolution mikroskopi og enkelt-partikel gennemsnit.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Denne metode kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål i centriole feltet, såsom lokalisering protein til en bestemt region af centriole. Den største fordel ved denne teknik, som vi giver mulighed for at koncentrere centriole for at få dem i flere retninger. Selv om denne metode kan give indsigt i Klamydomonas centriole biologi, det kan også anvendes til andre system, såsom isolerede menneskelige og paramecium centrioles.Demonstration af proceduren vil være ph.d.-studerende Nikolai Klena, en anden ph.d.-studerende Maeva Le Guennec, og postdoc i laboratoriet Davide Gambarotto. For at starte denne procedure skal du først forberede alle medier og kultur C.Reinhardtii celler som skitseret i tekstprotokollen. De forberedte celler overføres til 50 milliliter koniske rør, og de centrifugeres ved 600 gange g i 10 minutter.Pellet én gang med 50 milliliter 1x PBS og drej cellerne igen ved 600 gange g i 10 minutter. Brug en pipette til at opslænne pellet i 100 milliliter rumtemperatur deflagellation buffer. Bægerglasset sættes på en magnetisk omrører, og der tilsættes langsomt 0,5 molar eddikesyre til en endelig pH-standard på 4,5 til 4,7.Lad denne blanding inkubere ved stuetemperatur i to minutter. Efter dette langsomt tilføje dråber af en normal kaliumhydroxid for at genoprette pH til 7,0, overføre cellerne til 50 milliliter rør, og centrifuge dem ved 600 gange g i 10 minutter, for at fjerne eventuelle fritliggende flagella. Kassér supernatanten og opbevar pellet på is, indtil den er klar til vask.Når du er klar, vaskes pellet to gange med 50 milliliter 1x PBS ved fire grader Celsius pr. vask. Drej den vaskede pellet ved 600 gange g og fire grader Celsius i 10 minutter. Opsplit pellet i 30 milliliter 1x PBS.Derefter langsomt indlæse suspensionen på en 20 milliliter pude på 25% saccharose, uden at blande. Spin ved 600 gange g og fire grader Celsius i 15 minutter for at fjerne eventuelle resterende flagella og sprede cellerne i saccharose. Brug en aspirator, omhyggeligt aspirere supernatant holde kun de nederste-mest 20 milliliter.De resterende saccharose vaskes ved at tilsætte 20 milliliter kold 1x PBS. Centrifuge ved 600 gange g og fire grader Celsius i 10 minutter. Opsplit pellet i 10 milliliter 1x PBS ved fire grader Celsius, og sørg for, at der ikke er klumper i opløsningen.Den opslæmrede pellet overføres til en ny 250 milliliterflaske, lysisbufferen, suppleret med 5.000 enheder DNase, til den flaske, der indeholder cellerne. Inkuber ved fire grader Celsius i en time, mens du blander hver 15 minutter ved omhyggeligt at vende flasken. De lysede celler overføres til et konisk rør på 50 milliliter og centrifugeres ved 600 gange g og fire grader Celsius i 10 minutter.Ved hjælp af en pipette, indsamle supernatant og læg den i en 30 milliliter rund-bund rør på is, der indeholder to milliliter 60% saccharose pude. Centrifuge dette ved 10,000 gange g i 30 minutter ved fire grader Celsius. Derefter aspirere supernatanten op til en milliliter over saccharosepuden.Bemærk den gule grænseflade mellem den ene milliliter af resterende supernatant, og de to milliliter saccharose pude. Ved hjælp af en skåret P1000 spids, forsigtigt blande den resterende supernatant med saccharose. Pool alle saccharose puder og gemme dem på is.Dernæst forberede en 40% til 70% saccharose gradient i en tyndvægget 38,5 milliliter polypropylen rør som skitseret i tekstprotokollen. Indlæs langsomt de sammenderkede grænseflader i forløbet. Balance rørene med 10 millimolar K-PIPES buffer, og centrifuge ved 68, 320 gange g og fire grader Celsius i 75 minutter.Efter dette, bruge en 0,8 millimeter nål til at lave et hul i bunden af røret, og sørg for ikke at forstyrre de forskellige saccharose lag. Brug dette hul til at indsamle 12 500 mikroliter fraktioner ved fire grader Celsius. Ved hjælp af en skåret P200 spids, forberede en ekstra 10 mikroliter aliquot fra hver fraktion, der skal anvendes under immunfluorescens.Derefter snap-fryse fraktioner i flydende nitrogen. Til at begynde, placere en steril 12 millimeter dækslæb på den forsænkede nederste ende af koncentrator, og sørg for at holde PDL-belagt side ned. Anbring adapteren direkte ovenpå for at lægge dækslet på.Derefter vende den runde bund rør og placere den over koncentrator, coverslip, og adapter. Brug en pincet, forsigtigt skubbe ensemblet, indtil den når bunden af røret, og derefter vende røret. Der tilsættes 10 millimolar K-PIPES-buffer, indtil den når toppen af koncentratoren.Sørg for, at der ikke er bobler i koncentrators centrale cylinder. Tilsæt forsigtigt 100 mikroliter på 10 millimolar K-PIPES buffer til en af aliquots af den berigede centriolar fraktion og bland grundigt ved hjælp af en P200 pipette. Fjern derefter 100 mikroliter K-PIPES-buffer fra koncentratorens hule centrum og tilsæt 100 mikroliter af bufferfraktionblandingen, og sørg for, at indholdet forbliver i koncentratorens hule centrum.Spin ved 10, 000 gange g i 10 minutter i en centrifuge, der er forkølet til fire grader Celsius. Derefter skal du bruge en pincet til at fjerne koncentratoren. Sæt en håndlavet-hooked enhed ind i hullet til stede i slidsning kant af adapteren og løft forsigtigt op for at inddrive coverslip.Når den når toppen af røret, skal du bruge en behandsket finger til at fange adapterens kant og bruge pincet til at fjerne dækslæbet, da du er opmærksom på, hvilken side af dæksækken indeholder centrioler. Derefter udføre fiksering og immunfluorescens farvning af de koncentrerede centrioler. Til at begynde, inkubere coverslips med centrioles i den forberedte krystal polystyren transmission lab boks fyldt med 100% methanol ved minus 20 grader Celsius i 5 minutter.Ved hjælp af en pincet overføres dækslerne til en gennemsigtig laboratoriekasse fyldt med 50 milliliter 1x PBS. Lad objektglassene vaske i PBS i fem minutter ved stuetemperatur. Derefter pipette 60 mikroliter af primære antistof blandes på et stykke laboratorieforsegling wrap i et befugtet kammer.Læg forsigtigt dækslerne oven på antistoffet blandes med centriolerne direkte mod dråben. Lad dækslæberne inkubere i 45 minutter. Derefter fjernes dækslerne, og de vaskes i en kasse med PBS i fem minutter.De vaskede dækslip skal sammenspuges i 45 minutter med sekundære antistoffer i PBS 1%BSA og 0,05% Tween-20. Fjern dækslingerne og vask dem i fem minutter i en kasse med PBS. Ved hjælp af et almindeligt anti-fading monteringsmedium skal du montere dækslæbet på et dias.Derefter billede de isolerede centrioler på et konfokal mikroskop på en 63X olie mål med en NA på 1,4, mens du anvender decentralisering. Opsæt henholdsvis den øverste og nederste position af Z-stakken over og under centriolesignalet, og ansk af få en stor stak billeder, der omfatter det samlede centriole signal. Projekt stakken, og udfør gennemsnit af enkeltpartikel som beskrevet i tekstprotokollen.Repræsentativ immunfluorescens afslører, at seks fraktioner er beriget for isolerede centrioler, med et højdepunkt for fraktion nummer tre, mens de sidste to fraktioner ikke er, hvilket indikerer, at rensningen er vellykket. Kun omkring 30 centrioles ses pr synsfelt uden koncentrator, mens 183 ses med koncentrator. Dette viser, at koncentratortrinnet er vellykket, og giver mulighed for en seksdobling af centrioler i et defineret område, hvilket gør det lettere at opdage og afbilde dem.Super-opløsning mikroskopi bruges derefter til billede centrioles farves for monoglutamylated tubulin, og software bruges til at generere en næsten perfekt gennemsnit for hver valgt orientering. Efter fem iterationer, to klasser af gennemsnit blev genereret af monoglutamylated centrioles: en top visning fra 63 objekter og en side visning fra 98 partikler. Længden af side-view klasse gennemsnit er 260 nanometer med en diameter på 250 nanometer, svarende til den målte monoglutamylated tubulin signal, der ses at lokalisere inden for kernen af centriole.Mens du udfører denne procedure, er det vigtigt at huske at holde den isolerede centriole på is og snap-fryse dem efter isolation. Efter denne procedure, anden metode, som kryo-elektron mikroskopi og massespektrometri kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål, såsom den indfødte arkitektur centriole eller centriole protein sammensætning.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imaging og 3D Genopbygning cerebrovaskulær Strukturer i embryonale zebrafisk

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hurtig analyse og udforskningen af ​​fluorescensmikroskopi Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescensimagografi med One-nanometer Nøjagtighed (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...