Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Wij danken Pierre Gönczy en de BioImaging & Optics Platform (BIOP) op de École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Zwitserland, waar de SIM-beelden van de centrioles werden verworven. Nikolai Klena en Davide Gambarotto worden ondersteund door de European Research Council (ERC) Starting Grant (StG) 715289 (ACCENT) en Maeva Le Guennec, Paul Guichard en Virginie Hamel door de Zwitserse National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers wordt ondersteund door de Universiteit van Genève.

<ol>
	<li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+in+cells+and+organisms.">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li><li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+and+only+once:+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease.">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrioles,+centrosomes,+and+cilia+in+health+and+disease.">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li><li>G&#246;nczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly.">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li><li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+organization+and+centriole+architecture:+their+sensitivity+to+divalent+cations.">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li><li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+structure.">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+basal+bodies+in+paramecium.">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).</li><li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis.">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li><li>Li, S., Fernandez, J. -. J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography.">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li><li>Guichard, P., Chr&#233;tien, D., Marco, S., Tassin, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography.">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry.">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li><li>Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartwheel+assembly.">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes.">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li><li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure.">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li><li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging.">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis.">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li><li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii.">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).</li><li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus:+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body.">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, 2663-2674 (2004).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy.">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms.">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813 (2017).</li><li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology.">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li><li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Approaches+to+the+Study+of+the+Role+of+Metals+in+the+Metabolism+of+Microorganisms.">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li><li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles.">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li><li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyVolution-the+smart+path+to+confocal+super-resolution.">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+3D-SIM/SMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+&#8764;4-5+nm.">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of &#8764;4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li><li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+lytic+enzymes+(autolysins)+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+(hydroxy)proline-specific+proteases.">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li><li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images.">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een van de uitdagingen in de biologie is het ontcijferen van de precieze lokalisatie van eiwitten in een architecturale context. De centriolen is een ideale structuur deze methoden, toe te passen als de architectuur is onderzocht met behulp van cryo-Elektronentomografie, onthullen interessante ultrastructurele kenmerken langs de lengte. Dankzij zijn afmetingen dicht bij de grens van de resolutie in de optische microscopie is het echter moeilijk te lokaliseren precies een eiwit door immunofluorescentie aan een structurele subregio van de centriolen met behulp van conventionele microscopen30.
De resolutie in de optische microscopie wordt beperkt door de diffractie van licht dat, ongeveer, een laterale maximumresolutie van 200 geeft nm in optische microscopie24. Echter, deze limiet in optische microscopie omzeild door een van de belangrijke doorbraken van de laatste 20 jaar is geweest: de uitvinding van super resolutie methoden. Deze aanpak kunnen beeld buiten de grenzen van de diffractie bij verschillende resoluties: 120 nm voor SIM, ongeveer 50 nm voor gestimuleerde emissie uitputting (STED) en 20-40 nm voor single-molecuul lokalisatie microscopie (SMLM)24. Met deze nieuwe ontwikkelingen van super resolutie microscopie zijn de structurele subregio's van de centriolen haalbaar. In de praktijk is het echter nog steeds moeilijk om nauwkeurig de lokalisatie van een proteïne aan een structureel element voor de belangrijkste reden dat de volwassen centrioles bestaan in slechts 2 exemplaren per cel en willekeurige oriëntaties, waardoor de interpretatie van lokalisatie moeilijk. Om deze reden een protocol opgericht waarmee onderzoekers om het imago door super resolutie een groot aantal centrioles, verhoging van de kans om te observeren niet-dubbelzinnig oriëntaties. Nog belangrijker is, aangezien deze methode is gebaseerd op het gebruik van geïsoleerde centrioles, wij bieden een methode om te zuiveren intact C. reinhardtii centrioles die volwassen centrioles en procentrioles bevatten.
Tot slot, als gevolg van het aantal centriool oriëntaties die image kan worden gemaakt met dit protocol, single-deeltje analyse kan worden toegepast met behulp van elektronenmicroscopie software. Dit resulteert in de generatie van de gemiddelde klassen van centrioles in een bepaalde richting. Nog belangrijker is, kunnen deze resulterende 2D-afbeeldingen vervolgens worden gebruikt ter beoordeling van de lokalisatie van een specifieke proteïne langs de centriolen. Inderdaad, deze methode kan worden toegepast op dual-kleuren Super resolutiebeelden en één kleur kan worden gebruikt om te onthullen de centriolen skelet (bv, tubuline), terwijl de andere kleur kan worden toegeschreven aan een specifieke centriolar eiwit. Door af te trekken de gemiddelden verkregen met één kleur of twee kleuren, wordt het gemakkelijker om te registreren een eiwit langs de centriolen (proximale, centraal of DISTAAL). Merk op dat de twee kanalen nauwkeurig moeten worden afgestemd om te voorkomen dat een misleidend interpretaties. Bovendien zal de gemiddelden van top uitzicht helpen ontcijferen als een eiwit binnen de centriolar lumen, langs de muur van de microtubuli, of buiten de centriolen lokaliseert.
Deze methode heeft het voordeel om na te gaan van de lokalisatie van specifieke proteïnen die moeilijk te lokaliseren anders vanwege de heterogene labeling. Merk op dat andere methoden om de kaart van eiwitten in de centrioles zijn beschreven in oereenstemming 3-D SIM/SMLM met, bijvoorbeeld, beoordeling van de specifieke richtsnoeren voor de centrioles door de bepaling van de elliptische Profiel van een marker vormen een torus rond de Centriool door SIM imaging. Met behulp van deze parameter, is het mogelijk om te lokaliseren van eiwit met een nauwkeurigheid van 4 – 5 nm30. Merk ook op dat de beschreven methode maakt hier gebruik van geïsoleerde centrioles met intact procentrioles, een teken dat de centriolen architectuur is het meest waarschijnlijk grotendeels behouden. Echter, we kunnen niet uitsluiten dat sommige architectonische stijlkenmerken zijn gestoord tijdens het zuiveringsproces ongehinderd, zoals de centriolen diameter variëren met de concentratie van divalente kationen zoals versterkt met de isolatie van de menselijke centrosoom5.
Een van de essentiële stappen van het hier gepresenteerde protocol is het verkrijgen van voldoende geconcentreerde geïsoleerde centrioles in verschillende richtingen vatbaar voor Fluo-SPA. Om dit te doen, moet u eerst de zuiverheid en de efficiëntie van de centriolen isolatie procedure zorgen. Een lage concentratie van geïsoleerde centrioles wordt voorkomen dat juiste beeldvorming en verdere beeldverwerking. Voor dit doel bieden wij een methode om te verrijken het aantal centrioles per gezichtsveld. Afhankelijk van het aantal centrioles in de Fractie gebruikt, moet het volume in de concentrator geladen worden aangepast, met een maximaal volume van 250 µL.
Nog belangrijker is, is deze methode is ontwikkeld voor een celwand minus cw15-C. reinhardtii cellen. In deze stam zorgt de kwetsbaarheid van de celwand voor een juiste lysis van de cellen en dus de bevrijding van de inhoud ervan. Dit protocol is niet efficiënt voor wild-type C. reinhardtii cellen, zoals de celwand een goede lysis voorkomt. Alternatieve strategieën, zoals ultrasoonapparaat of een pre-incubatie van de cellen met autolysin, een enzym dat de celwand31, kunt degraderen zou moeten worden ingevoerd om te wijzigen de celwand voorafgaand aan toepassing van het protocol van de isolatie die hier gepresenteerd.
Deze set-up kan worden gebruikt met verschillende soorten microscopen, variërend van conventionele confocal microscopen tot hoge doorvoer gewijd super resolutie microscopen. Bij het doen van SMLM, een speciale buffer is vereist voor correcte beeldvorming en dus een kamer voor een 12 mm dekglaasje aan met de buffer op de top van het dekglaasje aan aangepast moet worden gebruikt. Verdere beeldvorming worden uitgevoerd met omgekeerde microscopen. Als de set-up van de Microscoop niet mogelijk is een 12 mm dekglaasje aan, kan het protocol hier gepresenteerd worden toegepast op 18 mm coverslips met een ronde bodem tube van 30 mL en een gemodificeerde adapter en concentrator. Het is ook belangrijk om de opmerking dat de kwaliteit van de laatste wederopbouw in SMLM zal afhangen van de kwaliteit van de kleuring en van het primaire antilichaam gebruikt, evenals de methode van fixatie.
Kortom bieden wij een methode die kan worden toegepast op de afbeelding talrijke centrioles gevolgd door Fluo-SPA die zal genereren gemiddelden van centrioles in verschillende richtingen, waardoor centriolar eiwit met precisie te lokaliseren. Nog belangrijker is, kan deze methode meer in het algemeen worden toegepast naar geïsoleerde centrioles van andere diersoorten, aan andere organellen of te grote macromoleculaire verzamelingen. Tot slot het monster voorbereiding aanpak hier gepresenteerd, gecombineerd met de recente ontwikkeling van de algoritme voor single-deeltje analyse van fluorescerende SMLM gegevens32, kon openen verdere verbetering in de moleculaire cartografie van grote macromoleculaire assembly's.

De centriolen is een evolutionair geconserveerde organel dat de kern van het centrosoom in dierlijke cellen en kan fungeren als een orgaan van de basale (hierna aangeduid als centrioles hierna) sjabloon cilia of flagellen in vele eukaryoten1,2. Als zodanig zijn centrioles kritisch voor biologische processen fundamentele cel variërend van spindel vergadering naar cel signalering. Daarom gebreken in centriool vergadering of een functie hebben in verband gebracht met verschillende menselijke pathologie, met inbegrip van ciliopathies en kanker3.
Centrioles zijn nine-fold, symmetrische, microtubulus triplet gebaseerde cilindrische structuren dat zijn, meestal ~ 450 nm lange en ~ 250 nm breed4,5,6,7. Conventionele elektronenmicroscopie en cryo-Elektronentomografie van centrioles van verschillende soorten gebleken dat centrioles zijn gepolariseerd langs hun lange as met drie verschillende regio's: een proximale regio, een centrale kern en een distale regio5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. belangrijk is dat elk van deze regio's specifieke structurele kenmerken weergegeven. Ten eerste bevat het lumen van de 100 nm durende proximale regio de structuur van de Radslag aangesloten op de microtubuli triplet via de pinhead element12. Ten tweede, de regio van 300 – 400 nm durende midden vezelig dichtheden in de lumen en structurele kenmerken langs de binnenzijde van de microtubuli bevat: de linker Y-vormige, de C-zaadvormende staart en de A-zaadvormende stub9. Ten slotte is de 50-100 nm distale regio vertoont sub distale en distale aanhangsels die het distale deel van de centriolen5,13 omringen.
De laatste twee decennia hebben gekenmerkt door de ontdekking van een toenemend aantal centriolar eiwitten, leiden tot een huidige schatting van ongeveer 100 verschillende eiwitten die deel uitmaken van de centriolen14,15,16, 17. Ondanks deze vooruitgang, de precieze lokalisatie van deze proteïnen binnen de centriolen blijft ongrijpbaar, met name binnen structurele subregio's. Nog belangrijker is, is van cruciaal belang voor een beter begrip van hun functie een precieze lokalisatie toewijzen aan structurele regio's van de centriolen. In dit opzicht hebben C. reinhardtii centrioles bijgedragen in beide aspecten door de eerste delimitating de verschillende structurele kenmerken langs de cilinder9,18,19, waardoor vervolgens onderzoekers te correleren de lokalisatie van een subset van eiwitten fluorescent microscopie met een sub structurele regio. Dit omvat bijvoorbeeld de eiwitten Bld12p en Bld10p, die in de proximale regio, en in de Radslag-structuur met name lokaliseren20,21,22,23. De lijst van substructuur gelokaliseerd eiwitten omvat ook POB15 en POC16, twee nieuwe eiwitten geïdentificeerd door massaspectrometrie die de binnenkern van de centrale regio van C. reinhardtii centrioles17 versieren.
Dit witboek biedt een volledige beschrijving van de methode ontwikkeld om te isoleren en C. reinhardtii centrioles voor de daaropvolgende resolutie van de Super microscopie en single-deeltje gemiddeld beeld. Om dit te bereiken, is het belangrijk om af te bakenen de technische beperkingen die moeten worden overwonnen. Eerst, centriool zuivering kan invloed hebben op de algemene architectuur, met de structuur van de Radslag vaak verloren tijdens de verschillende stappen van isolatie9. Ten tweede, de afmetingen van de centriolen zijn zeer dicht bij de grens van de diffractie in optische microscopie. Inderdaad, de laterale resolutie die kan worden verkregen in confocale microscopie is ongeveer 200 nm24, vergelijkbaar met de diameter van de centriolen, en de resolutie in de z-as is over 2-3 x lager, wat leidt tot een anisotrope volume. Ten derde, de heterogeniteit van antilichaam labeling en centriool oriëntatie kan beperken de interpretatie die nodig zijn voor het lokaliseren van een proteïne in een specifieke centriolar sub-regio. Tot slot bestaan centrioles in slechts twee exemplaren per cel, waardoor het moeilijk te verwerven van een groot aantal afbeeldingen en het vinden van een eenduidige centriool oriëntatie. Om te omzeilen deze technische kwesties, ontwikkelden we een methode die is gebaseerd op het super resolutie microscopie toe te passen op een groot aantal geïsoleerde centrioles die verschillende richtsnoeren aannemen. Eerst beschrijven we een protocol om te zuiveren van C. reinhardtii centrioles waarmee de zuivering van structureel intact centrioles en procentrioles met de Radslag. Vervolgens beschrijven we een stapsgewijze protocol te concentreren van de centrioles op coverslips voor beeldvorming door conventionele of Super-resolutie fluorescentie microscopie. Deze belangrijke stap zorgt voor toename van de centrioles beeld in meerdere richtingen. Ten slotte, beschrijven we een procedure om uit te voeren single-deeltje gemiddeld op gegevens verworven op fluorescente microscopen, dat vergemakkelijkt de opsporing van centrioles in verschillende richtingen. Over het geheel genomen kan deze methode worden toegepast op beeld centrioles van verschillende soorten of andere grote macromoleculaire verzamelingen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioles zijn grote macromoleculaire assembly's die belangrijk zijn voor de goede uitvoering van fundamentele cel biologische processen zoals de celdeling, de beweeglijkheid van de cel of cellen signalering. De groene algen Chlamydomonas reinhardtii heeft bewezen een inzichtelijke model in de studie van centriool architectuur, functie en samenstelling van het eiwit. Ondanks de grote vooruitgang richting de centriolar het begrip platform is een van de huidige uitdagingen het vaststellen van de precieze lokalisatie van centriolar componenten binnen structurele regio's van de centriolen om beter te begrijpen hun rol in Centriool biogenese. Een belangrijke beperking ligt in de resolutie van de fluorescentie microscopie, die de interpretatie van eiwit lokalisatie in dit organel met afmetingen dicht bij de grens van diffractie compliceert. Ter bestrijding van deze vraag, bieden we een methode om te zuiveren en het beeld van een groot aantal C. reinhardtii centrioles met verschillende oriëntaties met behulp van de resolutie van de Super microscopie. Deze techniek maakt het mogelijk verdere verwerking van gegevens door middel van fluorescerende single-deeltje gemiddeld (Fluo-SPA) wegens het grote aantal centrioles verworven. Fluo-SPA genereert gemiddelden van gekleurd C. reinhardtii centrioles in verschillende richtingen, waardoor de lokalisatie van verschillende eiwitten in de centriolar subregio's. Nog belangrijker is, kan deze methode worden toegepast op afbeelding centrioles van andere soorten of andere grote macromoleculaire samenstellen.

C. reinhardtii centriool isolatie: Om te isoleren van de centrioles, cw15- C. reinhardtii cellen werden gekweekt in vloeibare cultuur voor enkele dagen onder licht en vervolgens Ingehuld door centrifugeren op 600 x g voor 10 min. Pelleted cellen werden 1 x met PBS gewassen en geresuspendeerde in een deflagellation buffer voorafgaand aan deflagellation door het uitvoeren van een schok van de pH met behulp van 0.5 M azijnzuur aan een definitieve pH van 4.5-4.7 gedurende 2 minuten(Figuur 1). Een toevoeging van 1 N KOH werd gebruikt om te herstellen pH 7.0. Om te scheiden vrijstaande flagellen van cel organen, werden deflagellated cellen eerst gecentrifugeerd om te verwijderen van het grootste deel van de flagellen. De pellet was dan 2 x met PBS gewassen en geresuspendeerde in 30 mL PBS voorafgaand aan langzaam laden op een 25%-sacharose kussen (Figuur 1B). De buis was gesponnen op 600 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C tot het verwijderen van de meeste van de vrijstaande flagellen. Na het centrifugeren, de cel organen werden verspreid in het kussen van sacharose (Figuur 1C) en hersteld door het verwijderen van de ongeveer 30 mL van het supernatans (tot de rode pijl in Figuur 1C). De resulterende 20 mL van de gewassen cellen werden vervolgens geresuspendeerde 20 ml koude PBS en gecentrifugeerd bij 600 x g gedurende 10 minuten. Vervolgens het supernatant werd verworpen, en werden volledig geresuspendeerde de cellen in 10 mL PBS. De cellen werden overgedragen aan een fles van 250 mL en de lysis buffer is toegevoegd aan de geresuspendeerde cellen tegelijk. DNase werd toegevoegd aan de lysis en uitgebroed gedurende 1 uur bij 4 ° C. Na een centrifugeren-stap voor verwijderen cel puin (Zie de witte pellet in Figuur 1D), het supernatant was verzameld en zorgvuldig geladen op een kussen 60%-sacharose 2 mL vóór centrifugeren bij 10.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Merk op dat voor 100 mL lysis, 8 buizen 15 ml werden gebruikt voor het uitvoeren van deze stap, overeenkomt met 12,5 mL lysis-buffermengsel geladen op 2 mL van sacharose per buis. Na het centrifugeren, de meeste van de bovendrijvende substantie werd verwijderd tot 1 mL boven het kussen. De 1 mL van het supernatans dat resterende was dan verzameld met de 2 mL-kussen en vervolgens gemengd en gebundeld om op te halen een eindvolume van 24 mL. Het zwembad was vervolgens geladen op een 40% - 50%-, 70%-sacharose kleurovergang en gesponnen bij 68,320 x g gedurende 1 uur en 15 min bij 4 ° C. Ten slotte, de geïsoleerde centrioles werden verzameld door een gat in het onderste gedeelte van het centrifugeren buis met behulp van een naald en de druppels werden verzameld in 12 x 500 µL breuken. De daling gevormd als gevolg van de hoge dichtheid van de verschillende sacharose, heel langzaam aan het begin (70% sucrose), en vervolgens meer snel (40% sucrose).
Immunofluorescentie van geïsoleerde Centrioles Om te beoordelen van de kwaliteit van de isolatie-procedure, was 10 µL van elke verzamelde kleurovergang breuk vervolgens gecentrifugeerd op een dekglaasje aan met behulp van een dekglaasje aan steun adapter (figuur 2A-2D). Nog belangrijker is, u kunt veilig verwijderen van het dekglaasje aan, een aangepaste verslaafd apparaat was ontworpen (Figuur 2B). De coverslips werden vervolgens geanalyseerd door immunofluorescentie. Antistoffen tegen CrSAS-6(Bld12p) gewend waren in deze studie wijzen op de aanwezigheid van de Radslag structuur en α-tubuline (DMA1) wil de centriolar muur. Door het aantal centrioles die positief voor zowel CrSAS-6 en α-tubuline per gezichtsveld waren tellen en vervolgens het berekenen van het totale aantal centrioles per breuken, bleek het mogelijk om te bepalen welke fracties werden verrijkt voor geïsoleerde centrioles ( Figuur 2F-2 H). Interessant, werden 6 breuken verrijkt voor centrioles (figuur 2F en 2 G, breuken #1-6), met een piek voor Fractie #3, terwijl de laatste breuken niet waren, die aangeeft dat de zuivering gewerkt. Merk op dat in dit bijzonder experiment, 95% van de totale centrioles positief voor CrSAS-6 en α-tubuline in fractie #3 waren. Dit geeft aan dat de meest geïsoleerde centrioles hun cartwheels behouden. Als geen verrijking van centrioles wordt waargenomen in de eerste breuken, de procedure van de isolatie werkte niet en moet worden herhaald. Merk op dat sommige flagellar stukken meestal in de breuken verstoken van centrioles kunnen worden waargenomen.
Vervolgens voor het berekenen van het totale aantal centrioles per µL, moet het aantal centriool per gezichtsveld worden vermenigvuldigd met de verhouding als aangegeven in Figuur 2H. Het resulterende getal moet vervolgens worden gedeeld door het volume van de breuk gebruikt voor de immunofluorescentie om het aantal centrioles per µL te verkrijgen. In deze procedure bepaalde isolatie bevatte de meest verrijkt breuk ongeveer 37 centrioles voor een oppervlakte van 0.00846 mm2 (met een gezichtsveld van 92 x 92 µm2). Het oppervlak van de buis sectie was 7.5 mm straal met een totale oppervlakte van 176 mm2. De overeenkomstige verhouding was toen 176/0.00846 = 20,803.8, dus een totaal van 769,740 centrioles (37 x 20, 803.8) in 10 µL. Daarom was het aantal centrioles in 1 µL 76,974.
Concentratie van geïsoleerde Centrioles op Coverslips: Verhoging van het aantal centrioles per veld verhoogt de kans op ondubbelzinnige centriool oriëntatie opsporen, evenals het verhogen de kans op het opsporen van soortgelijke richtsnoeren die kunnen worden gebruikt voor verdere deeltje gemiddeld procedures. Als centrioles van de geconcentreerde breuken zijn nog steeds schaars op het dekglaasje aan, ontwikkelden we een centrifugeren accessoire te concentreren in het midden van het dekglaasje aan (Figuur 3A) een concentrator met de naam centrioles. Merk op dat een .stl bestand met de nauwkeurige metingen voor 3D-printen is voorzien van dit manuscript.
Ten eerste, een dekglaasje aan van 12 mm was gemonteerd op de concentrator (Figuur 3B). De adapter was geplaatst op de top van het dekglaasje aan was de ronde-onderkant-buis en omgekeerd geplaatst over de geassembleerde adapter en de concentrator. De ronde onderkant-buis werd vervolgens voorzichtig omgekeerd, waardoor het laden van het monster (Protocol stap 4.2). De centrioles werden vervolgens gecentrifugeerd bij 10.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Daarna werden de centrioles onderworpen aan immunofluorescentie en gekleurd voor CrSAS-6/Bld12p en α-tubuline (Figuur 3 c-3E). Belangrijker, werden ongeveer 30 centrioles zonder concentrator beschouwd per gezichtsveld (Figuur 3C), terwijl de 183 centrioles per gezichtsveld werden gezien toen de concentrator gebruikt (figuur 3D-3F). Merk op dat de centrioles bedekt alleen een schijf van 4 mm diameter in het midden van het dekglaasje aan. Dit resultaat toont aan dat de concentratie stap werkt en een 6-fold verrijking van centrioles in een bepaalde regio van de coverslips kunt, dus versoepeling van hun detectie en beeldvorming.
TL Single-deeltje gemiddeld van geïsoleerde C. reinhardtii Centrioles: Hier, met behulp van SIM-microscopie, die oplopen een resolutie van ongeveer 120 tot kan nm, centrioles gebeitst voor monoglutamylated tubuline (GT335, Figuur 4), een tubuline wijziging in centriolar microtubuli, aanwezig waren verbeelde24. C. reinhardtii centrioles zijn ongeveer 500 nm lang, altijd in paren, en vaak gevonden met bijbehorende, nieuw gedupliceerd probasal organen (hierna aangeduid als procentrioles hierna) en Locustella microtubulus-geassocieerde vezels19. Daarom was deze eindmontage ongeveer 1 µm groot. Om deze reden, en om het beeld van de centrioles in hun geheel, is het raadzaam het verwerven van een Z-stack op de geïsoleerde centrioles.
Hier, na de overname, is een uiteindelijke afbeelding gegenereerd door het uitvoeren van een projectie van maximale intensiteit met behulp van ImageJ28 (beeld/stapels/Z project/max intensiteit projectie, Figuur 4B). Dergelijke beelden, een analyse van de single-deeltje cryo-Elektron microscopie softwarematig werd uitgevoerd zodat de klassen van centrioles met gelijkaardig oriëntaties en dan gemiddeld werd uitgevoerd. Om dit te doen, was de kleur van de afbeelding eerst omgekeerd zodat de objecten (Figuur 4C) beter te visualiseren. Centrioles werden handmatig geplukt in een vak gecentreerd over elk deeltje met behulp van de vrij beschikbare Scipion software29 die verschillende elektronenmicroscopie software programma's zoals Xmipp3 integreert (Figuur 4D). Merk op dat de grootte van de doos moet worden gedefinieerd door de gebruiker. Hier, dozen van 50 x 50 pixels voor een pixelgrootte van 31.84 nm werden gebruikt. Vervolgens alle deeltjes werden uitgepakt (Figuur 4E) en uitgelijnd met Xmipp3 (Figuur 4F). Vervolgens werd een cirkelvormig masker van 12 pixels in straal toegepast om te isoleren elke centriool uit de centriolar-pair (Figuur 4G). De deeltjes werden vervolgens ingedeeld, aan de hand van Xmipp3, voor het genereren van verschillende gemiddelden. Alleen werden homogene klasse gemiddelden bewaard, wat betekent dat de deeltjes die van de gemiddelden van de klasse afwijken werden handmatig uitgesloten. Deze stap werd herhaald om het genereren van een bijna perfecte gemiddelde voor elke gekozen koers. Na vijf iteraties, twee klassen van gemiddelden werden gegenereerd: een bovenaanzicht van 63 objecten (Figuur 4H) en een kant uitzicht vanaf 98 deeltjes (Figuur 4ik) van monoglutamylated centrioles. De afmetingen van het object werden bepaald door het meten van de afstand tussen de pieken van de intensiteit perceel profiel langs het monoglutamylation signaal.
Nog belangrijker is, is de lengte van het zijaanzicht klasse gemiddelde 260 nm met een diameter van 250 nm, vergelijkbaar met de gemeten monoglutamylated tubuline signaal dat bleek te lokaliseren in een regio van 286 ± 33 nm lengte binnen de kern van de centriolen17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> Figuur 1 : Zuivering van C. reinhardtii centrioles. (A) Dit is een schematische weergave van elke stap die leidt tot de isolatie van C. reinhardtii centrioles. Het omvat representatieve stappen van het protocol (B) vóór en (C) na het centrifugeren op het verloop van de 25%-sacharose. De rode pijl in deelvenster C geeft de minimumgrootte voor het volume te houden na het centrifugeren. (D) dit paneel toont de witte pellet lysed cellen na het centrifugeren. De zwarte pijl geeft de pellet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> Figuur 2 : Centrifugeren set-up om te voeren immunofluorescentie op geïsoleerde centrioles. (A) 10 µL van elke verzamelde breuk wordt eerst verdund in 100 µL van 10 mM K-PIPES (pH 7,2). (B) Dit is een schematische weergave van de apparaten van centrifugeren, omvat een tube van 15 mL ronde onderkant, een dekglaasje aan van 12 mm, een adapter voor het dekglaasje aan, en een op maat gemaakte verslaafd apparaat herstellen het dekglaasje aan na het centrifugeren. Panelen C en D tonen tekeningen waarin wordt uitgelegd hoe te herstellen van het dekglaasje aan na het centrifugeren. (C) plaats de verslaafd tool in het gat in de slotted rand van de adapter aanwezig en (D) trekken zachtjes. (E) Dit zijn beelden van de vochtige kamer moest uitvoeren immunofluorescentie imaging. De pijl geeft de 12 mm dekglaasje aan. (F) Dit zijn representatieve confocal beelden op 63 X (zoom 2) voor kleurovergang breuken #1-8, verzameld tijdens de procedure zuivering en gekleurd voor CrSAS-6 (rood) en α-tubuline (groen). De inzetstukken komen overeen met de regio aangegeven met een wit vakje in de lagere vergroting weergaven. Schaal bar = 10 µm. (G) Dit is een grafiek die het aantal centrioles positief voor zowel CrSAS-6 en α-tubuline per gezichtsveld in elke fractie vertegenwoordigt. Opmerking de verrijking in breuken #1-6. Het gemiddelde aantal centrioles per veld in elke fractie: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37.0 ± 17,0, #4 = 23.3 ± 11.4, #5 = 14.3 ± 2.1, #6 = 13.7 ± 9.3, #7 = 2.7 ± 1,2, #8 = 1,0 ± 0.0, #9 = 1,0 ± 0.0, #10 = 0,0 ± 0.0, #11 = 0.3 ± 0,6, #12 = 0,0 ± 0.0. Voor elke fractie, werden 3 willekeurige velden beeld. Merk op dat, toen de meest verrijkt breuk #3 tellen, we vonden dat 95% van de centrioles positief voor CrSAS-6 en α-tubuline zijn (n = 205 centrioles). (H) A verhouding van het aantal centrioles aanwezig op het gemeten gebied van de microfoto wordt gebruikt voor het berekenen van het totale aantal centrioles aanwezig op het gebied van de buis. Het nummer van de centriolen per µL kan worden berekend uit de 10 µL oorspronkelijk gecentrifugeerd breuken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> Figuur 3 : Geïsoleerde centrioles worden gecentrifugeerd met behulp van concentrators. (A) dit paneel toont het centrifugeren apparaten nodig om zich te concentreren op centrioles op coverslips vóór immunofluorescentie, met inbegrip van een tube van 15 mL ronde onderkant, een concentrator, een dekglaasje aan van 12 mm en een steun adapter apparaat. (B) dit paneel toont de stappen voor het monteren van het centrifugeren apparaat. Panelen C-E Toon confocal beelden van centrioles gekleurd voor CrSAS-6 (rood) en α-tubuline (groen) (C) zonder of (D-E) met de concentrator. De inzetstukken komen overeen met de regio aangegeven met een wit vakje in de lagere vergroting weergaven. De bar van de schaal is 10 µm. opmerking dat centrioles in het midden van het dekglaasje aan (de stippellijn geeft de rand van de geconcentreerd gebied) zijn verrijkt. (F) deze grafiek vertegenwoordigt het aantal centrioles per gezichtsveld zonder en met de concentrator. Vijf willekeurige gezichtsveld werden geanalyseerd. Het gemiddelde aantal centrioles is, zonder concentrator, 29.8 ± 2,9, en met de concentrator, 182.6 ± 11,5, P < 0,0001. De statistische significantie werd beoordeeld door een ongepaard t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> Figuur 4 : Single-deeltje gemiddeld op geïsoleerde C. reinhardtii centrioles. (A) dit paneel toont Z stapel beelden van centrioles gekleurd met GT335 en verkregen met behulp van een Microscoop SIM. (B) deze panelen tonen een maximale intensiteit Z projectie van de gestapelde afbeeldingen. Schaal bar = 1 µm. (C) de Toon van deze panelen een representatief beeld met een omgekeerde contrast. De inzet vertegenwoordigt een zoom-in de centrioles beter te visualiseren. (D) deze panelen Toon deeltje plukken. De inzet wordt aangegeven hoe de deeltjes werden geplukt. (E) Dit zijn voorbeelden van 5 geëxtraheerd deeltjes. (F) dit paneel toont de deeltjes na uitlijning. (G) dit paneel toont de deeltjes na het toepassen van een masker. Panelen H en ik Toon twee klasse gemiddelden: (H) een top uitzicht (63 deeltjes) enikeen zijaanzicht (98 deeltjes). De dubbele pijlen geven aan dat de afmetingen van het GT335 signaal. Schaal bar = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a> 
Aanvullende bestand 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullende bestand 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolatie en fluorescentie Imaging voor Single-deeltje wederopbouw van Chlamydomonas Centrioles

We hebben een strategie om te zuiveren en het beeld van een groot aantal centrioles in verschillende richtingen vatbaar voor super-resolutie microscopie en single-deeltje gemiddeld ontwikkeld.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het centriole veld te beantwoorden, zoals het lokaliseren van eiwitten naar een specifieke regio van de centriole. Het belangrijkste voordeel van deze technieken dat we de middelen bieden om centriole te concentreren om ze in meerdere richtingen te krijgen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in chlamydomonas centriole biologie, kan het ook worden toegepast op andere systemen, zoals geïsoleerde menselijke en paramecium centrioles.Het demonstreren van de procedure zal promovendus Nikolai Klena, een andere promovendus Maeva Le Guennec, en de postdoc in het laboratorium Davide Gambarotto. Om deze procedure te beginnen, eerst alle media en cultuur de C.Reinhardtii cellen zoals beschreven in het tekstprotocol voor te bereiden. Breng de bereide cellen over op 50 milliliter conische buizen en vercentrifugeer ze gedurende 10 minuten op 600 keer g.Was de pellet eenmaal met 50 milliliter 1x PBS en draai de cellen gedurende 10 minuten opnieuw op 600 keer g. Gebruik een pipet om de pellet opnieuw op te hangen in 100 milliliter kamertemperatuurdeflagellatiebuffer. Plaats het bekerglas op een magnetische roerder en voeg langzaam 0,5 molair azijnzuur toe aan een laatste pH van 4,5 tot 4,7.Laat dit mengsel twee minuten op kamertemperatuur uitbroeden. Voeg daarna langzaam druppels van een normale kaliumhydroxide toe om de pH te herstellen naar 7,0, breng de cellen over op 50 milliliter buizen en centrifugeer ze gedurende 10 minuten op 600 keer g om losse flagella te verwijderen. Gooi de supernatant weg en bewaar de pellet op ijs tot ze klaar zijn om te wassen.Als je klaar bent, was je de pellet twee keer met 50 milliliter 1x PBS bij vier graden Celsius per wasbeurt. Draai de gewassen pellet op 600 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Resuspend de pellet in 30 milliliter van 1x PBS.Laad vervolgens langzaam de suspensie op een kussen van 20 milliliter van 25%sucrose, zonder te mengen. Draai 15 minuten op 600 g en vier graden Celsius om de resterende flagella te verwijderen en de cellen in de sacharose te verspreiden. Met behulp van een aspirator, zorgvuldig aspirate de supernatant houden van alleen de onderste-meest 20 milliliter.Was de resterende sacharose door het toevoegen van 20 milliliter koude 1x PBS. Centrifuge op 600 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Resuspend de pellet in 10 milliliter van 1x PBS op vier graden Celsius, ervoor te zorgen dat er geen klonten in de oplossing.Breng de geresuspended pellet naar een nieuwe 250 milliliter fles, voeg de lyse buffer, aangevuld met 5.000 eenheden van DNase, aan de fles met de cellen. Incubeer op vier graden Celsius gedurende een uur, terwijl het mengen van elke 15 minuten door zorgvuldig omkeren van de fles. Breng de gelyseerde cellen over op een conische buis van 50 milliliter en centrifuge bij 600 keer g en vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Met behulp van een pipet, verzamel de supernatant en laad het in een 30 milliliter ronde bodem buis op ijs met twee milliliter van 60% sacharose kussen. Centrifuge dit op 10.000 keer g gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Daarna zuigt u de supernatant tot een milliliter boven het sacharosekussen.Let op de gele interface tussen de een milliliter van de resterende supernatant, en de twee milliliter van sacharose kussen. Met behulp van een gesneden P1000 tip, voorzichtig mengen de resterende supernatant met de sacharose. Pool alle sacharose kussens en bewaar ze op ijs.Bereid vervolgens een sucrosegradiënt van 40% tot 70% in een dunwandige 38,5 milliliter polypropyleenbuis zoals beschreven in het tekstprotocol. Laad de gepoolde interfaces langzaam in het verloop. Balanceer de buizen met de 10 millimolar K-PIPES buffer, en centrifuge op 68, 320 keer g en vier graden Celsius gedurende 75 minuten.Gebruik hierna een naald van 0,8 millimeter om een gat in de bodem van de buis te maken, zodat u de verschillende sacharoselagen niet verstoort. Gebruik dit gat om 12 500 microliterfracties te verzamelen bij vier graden Celsius. Met behulp van een gesneden P200-tip, bereid een extra 10 microliter aliquot van elke fractie te gebruiken tijdens immunofluorescentie.Vervolgens, snap-freeze de fracties in vloeibare stikstof. Om te beginnen plaatst u een steriele 12 millimeter coverslip op de verzonken onderkant van de concentrator, zorg ervoor dat de PDL-gecoate kant naar beneden te houden. Plaats de adapter direct op de top, om de coverslip cap.Vervolgens, omkeren van de ronde bodem buis en plaats het over de concentrator, coverslip, en adapter. Met behulp van een pincet, voorzichtig duw het ensemble totdat het de onderkant van de buis bereikt, en vervolgens omkeren van de buis. Voeg 10 millimolar K-PIPES buffer toe tot deze de bovenkant van de concentrator bereikt.Zorg ervoor dat er geen bellen in de centrale cilinder van de concentrator zitten. Voeg voorzichtig 100 microliters van 10 millimolar K-PIPES buffer toe aan een van de aliquots van de verrijkte centriolar fractie en meng grondig met behulp van een P200 pipet. Verwijder vervolgens 100 microliter K-PIPES-buffer uit het holle midden van de concentrator en voeg 100 microliter van het bufferfractiemengsel toe, zodat de inhoud in het holle midden van de concentrator blijft.Draai 10.000 keer g gedurende 10 minuten in een centrifuge die voorgekoeld is tot vier graden Celsius. Gebruik hierna een pincet om de concentrator te verwijderen. Steek een met de hand van de hand aan de hand van een handgemaakt apparaat in het gat dat aanwezig is in de sleufrand van de adapter en til voorzichtig op om de coverslip te herstellen.Zodra het de bovenkant van de buis bereikt, gebruik een gehandschoende vinger om de rand van de adapter te vangen en pincet te gebruiken om de coverslip te verwijderen, waarbij rekening wordt gehouden met welke kant van de coverslip centrioles bevat. Voer vervolgens fixatie en immunofluorescentie kleuring van de geconcentreerde centrioles uit. Om te beginnen, incubeer de coverslips met de centrioles in de voorbereide kristal polystyreen transmissie lab doos gevuld met 100% methanol bij min 20 graden Celsius gedurende 5 minuten.Breng met behulp van een pincet de coverslips over naar een transparante laboratoriumdoos gevuld met 50 milliliter 1x PBS. Laat de glijbanen vijf minuten wassen in de PBS bij kamertemperatuur. Vervolgens, pipet 60 microliters van primaire antilichaam mix op een stuk van het laboratorium afdichting wrap in een bevochtigde kamer.Leg de coverslips voorzichtig op de antilichaammix met de centrioles direct tegenover de druppel. Laat de covers 45 minuten uitbroeden. Verwijder hierna de afdeklipjes en was ze vijf minuten in een doos met PBS.Incubeer de gewassen covers gedurende 45 minuten, met secundaire antilichamen in PBS 1%BSA en 0,05%Tween-20. Verwijder de deklips en was ze gedurende vijf minuten in een doos met PBS. Monteer met een regelmatig anti-fading montagemedium de coverslip op een glijbaan.Beeld vervolgens de geïsoleerde centrioles op een confocale microscoop bij een 63X oliedoelstelling met een N.A.van 1.4, terwijl deconvolutie wordt toegepast. Stel respectievelijk de boven- en onderkant van de Z-stack boven en onder het centriolesignaal in en verwerf een grote stapel beelden die het totale centriolesignaal bevatten. Projecteer de stapel en voer een gemiddelde van één deeltje uit zoals beschreven in het tekstprotocol.Representatieve immunofluorescentie blijkt dat zes fracties zijn verrijkt voor geïsoleerde centrioles, met een piek voor fractie drie, terwijl de laatste twee fracties dat niet zijn, wat aangeeft dat de zuivering succesvol is. Slechts ongeveer 30 centrioletjes worden gezien per gezichtsveld zonder de concentrator, terwijl 183 worden gezien met de concentrator. Dit toont aan dat de concentratorstap succesvol is en een verzesvoudiging van centrioles in een gedefinieerd gebied mogelijk maakt, waardoor het gemakkelijker wordt om ze te detecteren en te beelden.Super-resolutie microscopie wordt vervolgens gebruikt om het beeld centrioles gekleurd voor gemonoxtamylated tubuline, en software wordt gebruikt om een bijna perfecte gemiddelde voor elke gekozen oriëntatie te genereren. Na vijf iteraties werden twee klassen van gemiddelden gegenereerd van gemonoxtamyleerde centrioles: een bovenaanzicht van 63 objecten en een zijaanzicht van 98 deeltjes. De lengte van het zijaanzichtklassegemiddelde is 260 nanometer met een diameter van 250 nanometer, vergelijkbaar met het gemeten gemonoxtyleerde tubulinesignaal dat wordt gezien om te lokaliseren in de kern van het centriole.Tijdens het uitvoeren van deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de geïsoleerde centriole op ijs te houden en snap-freeze ze na isolatie. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals cryo-elektronenmicroscopie en massaspectrometrie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals de inheemse architectuur van de centriole of de centriole eiwitsamenstelling.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Paring en Viertal Scheiding van Chlamydomonas reinhardtii Voor Genetische analyse

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Geboren Normalisatie voor fluorescentie optische projectie Tomografie voor Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Methode voor het meten van virale Fusion Kinetics bij de Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopische Fluorescentie Tomografie voor In-vivo Imaging van de ontwikkelingslanden Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse Imaging van mitose Na siRNA transfectie

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single Particle Electron Microscopy Reconstructie van de Exosome Complex Met behulp van de Random conische Tilt Methode

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis en Micromanipulatie voor intravitale Fluorescentie Imaging van de microcirculatie

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imaging en 3D Reconstructie van cerebrovasculair Structuren in embryonale zebravis

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescentie Imaging met One-nanometer nauwkeurigheid (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...