Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Nous remercions Pierre Gönczy BioImaging et plate-forme optique (BIOP) à l’École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne (Suisse), où les images SIM des centrioles ont été acquis. Nikolai Klena et Davide Gambarotto sont pris en charge par le Conseil européen de la recherche (CER) Starting Grant (StG) 715289 (ACCENT) et Maeva Le Guennec, Paul Guichard et Virginie Hamel par la PP00P3_157517 de Swiss National (FNS). Susanne Borgers est pris en charge par l’Université de Genève.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Un des défis en biologie est de déchiffrer la localisation précise des protéines dans un contexte architectural. Le centriole est une structure idéale pour appliquer ces méthodes, car son architecture a été étudiée en utilisant la tomographie cryo-électronique, révélant des caractéristiques ultrastructurales intéressantes sur toute sa longueur. Toutefois, en raison de ses dimensions proches de la limite de résolution en microscopie optique, il est difficile de localiser avec précision une protéine par immunofluorescence à une sous-région structurelle de la centriole à l’aide de microscopes classiques30.
La résolution en microscopie optique est limitée par la diffraction de la lumière qui donne, en gros, une résolution latérale maximale de 200 nm en microscopie optique24. Toutefois, cette limite a été contournée par l’un des progrès majeurs de ces 20 dernières années en microscopie optique : l’invention des méthodes Super-résolution. Ces approches peuvent l’image au-delà des limites de diffraction à différentes résolutions : 120 nm pour SIM, environ 50 nm pour l’épuisement de l’émission stimulée (STED) et 20 à 40 nm pour la localisation de la molécule unique microscopie (SMLM)24. Avec ces nouveaux développements de la microscopie de Super-résolution, les sous-régions structurelles de la centriole sont réalisables. Cependant, en pratique, il est encore difficile de déterminer avec précision la localisation d’une protéine à un élément structurel pour la raison principale que les centrioles matures existent seulement 2 copies par cellule et ont des orientations aléatoires, ce qui rend l’interprétation des localisation difficile. Pour cette raison, un protocole a été mis en place qui permet aux chercheurs d’image par Super-résolution un grand nombre de centrioles, augmentant la chance d’observer des orientations non ambiguë. Ce qui est important, car cette méthode repose sur l’utilisation des centrioles isolés, nous fournissons une méthode pour purifier intact c. reinhardtii centrioles qui contiennent des centrioles matures et procentrioles.
Enfin, en raison de la diversité des orientations de centriole qui peut être photographiée avec ce protocole, analyse de la particule peut être appliqué à l’aide de logiciels de microscopie électronique. Cela se traduit par la génération des classes moyennes de centrioles dans une orientation particulière. Ce qui est important, ces images 2D résultantes puis permet d’évaluer la localisation d’une protéine spécifique le long du centriole. En effet, cette méthode peut être appliquée aux images de Super-résolution bicolores, et une couleur peut être utilisée pour révéler le squelette de centriole (p. ex., tubuline), tandis que l’autre couleur peut être attribué à une protéine spécifique du centriole. En soustrayant les moyennes obtenues avec une seule couleur ou deux couleurs, il devient plus facile d’enregistrer une protéine le long le centriole (centrale, proximale ou distale). Notez que les deux canaux devraient être alignés avec précision afin d’éviter toute interprétation trompeuse. En outre, les moyennes des vues haut aidera déchiffrer si une protéine se localise à l’intérieur de la lumière centriolaire, le long du mur de microtubules, ou à l’extérieur le centriole.
Cette méthode a l’avantage d’établir la localisation des protéines spécifiques qui pourraient être difficiles à localiser par ailleurs dû aux inscriptions hétérogènes. Notez qu’autres méthodes pour cartographier les protéines à l’intérieur les centrioles ont été décrites dans corrélatif SIM/SMLM 3D avec, par exemple, évaluer les orientations spécifiques des centrioles en déterminant le profil elliptique d’un marqueur formant un tore autour de la centriole par imagerie de SIM. Vous utilisez ce paramètre, il est possible de localiser des protéines avec une précision de 4 à 5 nm30. Notez également que la méthode décrite ici utilise centrioles isolés avec procentrioles intacte, un signe que l’architecture de centriole est probablement en grande partie conservée. Toutefois, nous ne pouvons exclure que certains éléments architecturaux sont dérangés pendant la purification, tels que le diamètre de centriole varie avec la concentration des cations divalents comme amplifié avec l’isolement du centrosome humain5.
Une des étapes critiques du protocole présenté ici est d’obtenir des centrioles isolés suffisamment concentrées dans des orientations différentes se prête au Fluo-SPA. Pour ce faire, tout d’abord assurer la pureté et l’efficacité de la technique d’isolation centriole. Une faible concentration de centrioles isolés n’empêchera imagerie appropriée et autre traitement de l’image. À cette fin, nous fournissons une méthode afin d’enrichir le nombre des centrioles par champ de vision. Selon le nombre de centrioles dans la fraction utilisée, le volume chargé dans le concentrateur doit être ajusté, avec un volume maximal de 250 µL.
Ce qui est important, cette méthode a été développée pour une paroi cellulaire moins mission AC 15-C. reinhardtii cellules. Cette souche, la fragilité de la paroi cellulaire permet une bonne lyse des cellules et, par conséquent, la libération de son contenu. Ce protocole n’est pas efficace pour sauvage c. reinhardtii cellules, car la paroi empêche une lyse adéquate. Des stratégies alternatives comme la sonication ou une pré-incubation des cellules avec autolysine, une enzyme qui peut dégrader la paroi cellulaire31, devra être mis en place pour modifier la paroi cellulaire avant d’appliquer le protocole présenté ici.
Cette configuration peut être utilisée avec différents types de microscopes, allant de microscopes confocaux classiques à haut débit dédié Super-résolution microscopes. Notez que lorsque vous faites des SMLM, un tampon spécial est requis pour l’imagerie appropriée et, par conséquent, une chambre adaptée pour une lamelle de 12 mm avec le tampon sur le dessus de la lamelle doit être utilisée. L’imagerie ultérieur est effectué avec des microscopes inversés. Si la mise en place de microscope ne permet pas une lamelle de 12 mm, le protocole présenté ici peut être appliqué à 18 mm lamelles couvre-objet à l’aide d’un tube de 30 mL fond rond et un adaptateur modifié et concentrateur. Il est également important de remarque que la qualité de la reconstruction finale en SMLM dépendra de la qualité de la coloration et de l’anticorps primaire utilisé, ainsi que la méthode de fixation.
En résumé, nous fournissons une méthode qui peut être appliquée à l’image de nombreux centrioles suivis par Fluo-SPA qui va générer des moyennes des centrioles dans des orientations différentes, ce qui permet de localiser des protéines centriolaire avec précision. Ce qui est important, cette méthode peut être appliquée plus généralement aux centrioles isolés des autres espèces, d’autres organites ou à gros assemblages macromoléculaires. Enfin, la démarche de préparation d’échantillon présenté ici, combiné avec le récent développement d’algorithmes pour l’analyse de la particule de fluorescent SMLM données32, pourrait ouvrir davantage amélioration dans la cartographie moléculaire du grand macromoléculaire assemblys.

Le centriole est un organite évolutivement conservé qui se trouve au cœur du centrosome dans les cellules animales et peut agir comme un corps basal (appelé centrioles ci-après) aux cils de modèle ou de flagelles dans nombreux eucaryotes1,2. Ainsi, les centrioles sont critiques pour les processus biologiques fondamentaux cellule allant de montage de la broche de signalisation cellulaire. Par conséquent, tout défaut de centriole assembly ou de la fonction ont été associés à plusieurs pathologies humaines, y compris les cancers et les ciliopathies3.
Centrioles sont neuf fois, symétrique, microtubule triplet axée sur les structures cylindriques, qui sont, en règle générale, ~ 450 nm de long et de ~ 250 nm de large4,5,6,7. La microscopie électronique conventionnelle et la tomographie cryo-électronique des centrioles provenant de différentes espèces ont révélé que les centrioles sont polarisés le long de leur axe longitudinal avec trois régions distinctes : une zone proximale, un noyau central et une partie distale5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. ce qui est important, chacune de ces régions affiche des caractéristiques structurelles spécifiques. Tout d’abord, la lumière de la région proximale de 100 nm de long contient la structure de la roue de charrette connectée pour le triplet de microtubules grâce à l' élément de tête d’épingle12. En second lieu, la région centrale de 300 à 400 nm de long contient des densités fibreuses dans les caractéristiques structurelles et de la lumière le long de la face interne des microtubules : l’éditeur de liens en forme de Y, la queue C-tubule et les tubules A talon9. Enfin, la région distale de 50 – 100 nm pièces Sub distales et distales des appendices qui entourent la partie distale du centriole5,13.
Les deux dernières décennies ont été marquées par la découverte d’un nombre croissant de protéines centriolaire, conduisant à une estimation actuelle d’environ 100 protéines distinctes faisant partie du centriole14,15,16, 17. Malgré ces progrès, la localisation précise de ces protéines dans le centriole demeure difficile à atteindre, en particulier dans les sous-régions structurelles. Ce qui est important, assignant une localisation précise à des régions structurales du centriole est crucial pour une meilleure compréhension de leur fonction. À cet égard, c. reinhardtii centrioles ont grandement contribués à ces deux aspects de première délimitant les différentes caractéristiques structurelles le long du cylindre9,18,19, qui a alors permis chercheurs à établir une corrélation entre la localisation d’un sous-ensemble des protéines par microscopie fluorescente à une région infra structurelle. Cela inclut, par exemple, les protéines Bld12p et Bld10p, dont la localisation dans la région proximale et dans la structure de la roue de charrette en particulier20,,21,22,23. La liste des protéines de la sous-structure localisé comprend également POB15 et POC16, deux nouvelles protéines identifiées par spectrométrie de masse qui ornent la région intérieure centrale de c. reinhardtii centrioles17.
Cet article fournit une description complète de la méthode développée pour isoler et image c. reinhardtii centrioles pour microscopie Super-résolution ultérieures et une moyenne de particule. Pour atteindre cet objectif, il est important de délimiter les limites techniques qui doivent être surmontés. Tout d’abord, purification de centriole peut affecter l’architecture globale, avec la structure de la roue étant souvent perdue durant les différentes étapes de l’isolement,9. Deuxièmement, les dimensions de la centriole sont très proches de la limite de diffraction en microscopie optique. En effet, la résolution latérale qui peut être obtenue en microscopie confocale est environ 200 nm24, semblable au diamètre de la centriole et la résolution dans le z-axe est de 2 à 3 x plus faible, conduisant à un volume anisotrope. Troisièmement, l’hétérogénéité de l’orientation de l’étiquetage et le centriole anticorps pourrait limiter l’interprétation nécessaire pour localiser une protéine dans une sous-région centriolaire spécifique. Enfin, les centrioles existent dans seulement deux copies par cellule, rendant difficile d’acquérir un grand nombre d’images et de trouver une orientation claire centriole. Pour contourner ces problèmes techniques, nous avons développé une méthode qui repose sur l’application de la microscopie de Super-résolution sur un grand nombre de centrioles isolés qui adoptent diverses orientations. Nous décrirons tout d’abord un protocole pour purifier les centrioles c. reinhardtii qui permet la purification de centrioles structurellement intacts et procentrioles contenant la roue de la charrette. Ensuite, nous allons décrire un protocole étape par étape pour concentrer les centrioles sur lamelles couvre-objet pour l’imagerie conventionnelle ou microscopie fluorescente Super-résolution. Cette étape importante permet d’accroître le nombre des centrioles imagés à orientations multiples. Enfin, nous allons décrire une procédure pour effectuer une particule avec une moyenne sur les données acquises sur les microscopes fluorescents qui facilite la détection des centrioles dans différentes orientations. Au total, cette méthode peut être appliquée aux centrioles image de diverses espèces ou autres grands assemblages macromoléculaires.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioles sont grands assemblages macromoléculaires importants pour la bonne exécution des processus biologiques fondamentaux cellule telles que la division cellulaire, la motilité cellulaire ou la signalisation de cellules. L’algue Chlamydomonas reinhardtii s’est avéré pour être un modèle perspicace dans l’étude de l’architecture de centriole, fonction et composition en protéines. Malgré les grands progrès vers architecture centriolaire compréhension, l’un des défis actuels est de déterminer la localisation précise des composants centriolaire dans des régions structurales de la centriole afin de mieux comprendre leur rôle dans biogenèse centriole. Une limitation majeure réside dans la résolution de la microscopie en fluorescence, ce qui complique l’interprétation de la localisation de la protéine dans cet organite avec des dimensions proches de la limite de diffraction. Pour s’attaquer à cette question, nous fournissons une méthode pour purifier et l’image d’un grand nombre de c. reinhardtii centrioles avec différentes orientations Super-résolution par microscopie. Cette technique permet le traitement ultérieur des données par le biais de fluorescent particule en moyenne (Fluo-SPA) en raison du grand nombre de centrioles acquis. Fluo-SPA génère des moyennes de teint c. reinhardtii centrioles dans des orientations différentes, facilitant ainsi la localisation des protéines distinctes dans les sous-régions centriole. Ce qui est important, cette méthode peut être appliquée aux centrioles image d’autres espèces ou d’autres grands assemblages macromoléculaires.

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Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolement et imagerie de Fluorescence pour la Reconstruction de la particule de Chlamydomonas Centrioles

Nous avons développé une stratégie visant à purifier et un grand nombre de centrioles dans différentes orientations se prête pour la microscopie de Super-résolution et particule avec une moyenne de l’image.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le champ centriole, comme la localisation des protéines dans une région spécifique du centriole. Le principal avantage de ces techniques que nous fournissons les moyens de concentrer centriole pour les obtenir dans de multiples orientations. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu de la biologie centriole chlamydomonas, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, tels que les centrioles humains isolés et paramecium.Nikolai Klena, doctorant, Maeva Le Guennec, une autre doctorante, et le postdoc du laboratoire Davide Gambarotto feront la démonstration de la procédure. Pour commencer cette procédure, préparez d’abord tous les médias et la culture des cellules C.Reinhardtii telles que décrites dans le protocole de texte. Transférer les cellules préparées dans des tubes coniques de 50 millilitres et les centrifuger à 600 fois g pendant 10 minutes.Lavez la pastille une fois avec 50 millilitres de 1x PBS et faites tourner les cellules à nouveau à 600 fois g pendant 10 minutes. Utilisez une pipette pour resuspendre la pastille en 100 millilitres de tampon de déflagellation à température ambiante. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et ajoutez lentement 0,5 acide acétique molaire à un pH final de 4,5 à 4,7.Laisser incuber ce mélange à température ambiante pendant deux minutes. Après cela ajouter lentement des gouttes d’un hydroxyde de potassium normal pour restaurer le pH à 7,0, transférer les cellules à 50 tubes millilitres, et les centrifuger à 600 fois g pendant 10 minutes, pour enlever toute flagelle détachée. Jeter le surnatant et conserver la pastille sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être lavée.Une fois prêt, lavez la pastille deux fois à l’aide de 50 millilitres de 1x PBS à quatre degrés Celsius par lavage. Faites tourner la pastille lavée à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Resuspendez la pastille en 30 millilitres de 1x PBS.Ensuite, chargez lentement la suspension sur un coussin de 20 millilitres de 25% de saccharose, sans mélange. Tourner à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes pour enlever toute flagelle restante et étendre les cellules dans le saccharose. À l’aide d’un aspirateur, aspirez soigneusement le supernatant en ne gardant que les 20 millilitres les plus bas.Laver le saccharose restant en ajoutant 20 millilitres de 1x PBS froid. Centrifugeuse à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de 1x PBS à quatre degrés Celsius, en vous assurant qu’il n’y a pas de touffes dans la solution.Transférer la pastille résuspendue dans une nouvelle bouteille de 250 millilitres, ajouter le tampon de lyse, complété par 5000 unités de DNase, à la bouteille contenant les cellules. Incuber à quatre degrés Celsius pendant une heure, tout en mélangeant toutes les 15 minutes en inversant soigneusement la bouteille. Transférer les cellules lysées dans un tube conique et une centrifugeuse de 50 millilitres à 600 fois g et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.À l’aide d’une pipette, recueillir le supernatant et le charger dans un tube à fond rond de 30 millilitres sur de la glace contenant deux millilitres de coussin de saccharose de 60 %. Centrifugeuse à 10 000 fois g pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius. Après cela, aspirer le surnatant jusqu’à un millilitre au-dessus du coussin saccharose.Notez l’interface jaune entre le millilitre de supernatant restant, et les deux millilitres de coussin saccharose. À l’aide d’une pointe P1000 coupée, mélanger délicatement le surnatant restant avec le saccharose. Mettre en commun tous les coussins de saccharose et les conserver sur la glace.Ensuite, préparez un gradient de saccharose de 40 % à 70 % dans un tube de polypropylène de 38,5 millilitres à paroi mince tel que décrit dans le protocole textuel. Chargez lentement les interfaces poolées dans le gradient. Équilibrez les tubes avec le tampon K-PIPES de 10 millimillons et la centrifugeuse à 68, 320 fois g et quatre degrés Celsius pendant 75 minutes.Après cela, utilisez une aiguille de 0,8 millimètre pour faire un trou dans le fond du tube, en vous assurant de ne pas déranger les différentes couches de saccharose. Utilisez ce trou pour recueillir 12 fractions de 500 microlitres à quatre degrés Celsius. À l’aide d’une pointe P200 coupée, préparer un aliquot supplémentaire de 10 microlitres de chaque fraction à utiliser pendant l’immunofluorescence.Ensuite, casser-congeler les fractions dans l’azote liquide. Pour commencer, placez un couvercle stérile de 12 millimètres sur l’extrémité inférieure encastrée du concentrateur, en vous assurant de garder le côté recouvert de PDL vers le bas. Placez l’adaptateur directement sur le dessus, pour couronner le coverslip.Ensuite, inversez le tube à fond rond et placez-le sur le concentrateur, le coverslip et l’adaptateur. À l’aide d’une pince à épiler, poussez doucement l’ensemble jusqu’à ce qu’il atteigne le fond du tube, puis inversez le tube. Ajouter 10 millimolaires de tampon K-PIPES jusqu’à ce qu’il atteigne le sommet du concentrateur.Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans le cylindre central du concentrateur. Ajouter délicatement 100 microlitres de tampon K-PIPES de 10 millimolaires à l’un des aliquots de la fraction centriolaire enrichie et bien mélanger à l’aide d’une pipette P200. Ensuite, retirez 100 microlitres de tampon K-PIPES du centre creux du concentrateur, et ajoutez 100 microlitres du mélange de fraction tampon, en vous assurant que le contenu reste au centre creux du concentrateur.Tournez à 10 000 fois g pendant 10 minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie à quatre degrés Celsius. Après cela, utilisez une pince à épiler pour enlever le concentrateur. Insérez un dispositif crocheté à la main dans le trou présent dans le bord fendté de l’adaptateur et soulevez-le doucement pour récupérer le coverslip.Une fois qu’il atteint le dessus du tube, utilisez un doigt ganté pour piéger le bord de l’adaptateur et utilisez des pinces à épiler pour enlever le coverslip, en gardant à l’esprit de quel côté de la couverture contient centrioles. Ensuite, effectuez la fixation et la coloration d’immunofluorescence des centrioles concentrées. Pour commencer, incuber les coverslips avec les centrioles dans la boîte préparée de laboratoire de transmission en polystyrène cristal rempli de 100% de méthanol à moins 20 degrés Celsius pendant 5 minutes.À l’aide d’une pince à épiler, transférer les coverslips dans une boîte de laboratoire transparente remplie de 50 millilitres de 1x PBS. Laissez les glissières laver dans le PBS pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, pipette 60 microlitres d’anticorps primaires se mélangent sur un morceau d’enveloppe d’étanchéité de laboratoire dans une chambre humidifiée.Déposer délicatement les coverslips sur le dessus du mélange d’anticorps avec les centrioles directement face à la goutte. Laissez les coverslips incuber pendant 45 minutes. Après cela, retirez les coverslips et lavez-les dans une boîte contenant du PBS pendant cinq minutes.Incuber les coverslips lavés pendant 45 minutes, avec des anticorps secondaires dans PBS 1%BSA et 0,05%Tween-20. Retirez les coverslips et lavez-les pendant cinq minutes dans une boîte contenant du PBS. À l’aide d’un support anti-décoloration régulier, monter le coverslip sur une diapositive.Ensuite, imagez les centrioles isolés sur un microscope confocal à un objectif d’huile de 63X avec un N.A.de 1.4, tout en appliquant la déconvolution. Installez la position supérieure et inférieure de la pile Z au-dessus et au-dessous du signal centriole, respectivement, et acquérez une grande pile d’images comprenant le signal centriole total. Projeter la pile et effectuer une seule particule moyenne telle que décrite dans le protocole de texte.L’immunofluorescence représentative révèle que six fractions sont enrichies pour les centrioles isolées, avec un pic pour la fraction numéro trois, tandis que les deux dernières fractions ne le sont pas, ce qui indique que la purification est réussie. Seulement environ 30 centrioles sont vus par champ de vision sans le concentrateur, tandis que 183 sont vus avec le concentrateur. Cela démontre que l’étape du concentrateur est réussie, et permet un enrichissement six fois des centrioles dans une région définie, ce qui facilite leur détection et leur image.La microscopie super-résolution est ensuite utilisée pour l’image centrioles tachées pour la tubuline monoglutamylated, et le logiciel est utilisé pour générer une moyenne presque parfaite pour chaque orientation choisie. Après cinq itérations, deux classes de moyennes ont été générées de centrioles monoglutamylated : une vue supérieure de 63 objets et une vue latérale de 98 particules. La longueur de la moyenne de la classe de vue latérale est de 260 nanomètres avec un diamètre de 250 nanomètres, comparable au signal de tubuline monoglutamylated mesuré qui est vu pour se localisér dans le noyau du centriole.Lors de l’exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de garder le centriole isolé sur la glace et de les congeler après l’isolement. Suivant cette procédure, d’autres méthodes, comme la microscopie cryo-électronique et la spectrométrie de masse peuvent être effectuées afin de répondre à d’autres questions, telles que l’architecture indigène du centriole ou la composition protéique centriole.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

L&#39;accouplement et la séparation des Tétrade Chlamydomonas reinhardtii Pour l&#39;analyse génétique

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

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