Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
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Wir danken Pierre Gönczy und BioImaging & Optik-Plattform (BIOP) an der École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Schweiz, wo die SIM-Bilder der Centriolen erworben wurden. Nikolai Klena und Davide Gambarotto werden vom European Research Council (ERC) Starting Grant (StG) 715289 (ACCENT) und Maeva Le Guennec, Paul Guichard und Virginie Hamel durch den Schweizerischen Nationalfonds (SNF) PP00P3_157517 unterstützt. Susanne Borgers wird unterstützt von der Universität Genf.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Eine der Herausforderungen in der Biologie ist die präzise Lokalisierung der Proteine im architektonischen Kontext zu entschlüsseln. Die Zentriol ist eine ideale Struktur, um diese Methoden anwenden, da seine Architektur mit Cryo-Elektron Tomographie, offenbart interessante Ultrastrukturforschung Features entlang seiner Länge untersucht worden ist. Jedoch wegen seiner Größe in der Nähe der Auflösungsgrenze in der optischen Mikroskopie ist es schwierig, ein Protein durch Immunfluoreszenz, eine strukturelle Teilbereich des Zentriol, die mit konventionellen Mikroskopen30genau zu lokalisieren.
Die Auflösung in der optischen Mikroskopie ist begrenzt durch die Beugung des Lichts, das gibt, grob gesagt, laterale Auflösungen von bis 200 nm in optischen Mikroskopie24. Diese Grenze wurde jedoch durch-geführt von einem der großen Durchbrüche der letzten 20 Jahre in der optischen Mikroskopie: die Erfindung der Höchstauflösung Methoden. Diese Ansätze können die Beugung Grenzen mit unterschiedlichen Auflösungen Bild: 120 nm für SIM, etwa 50 nm für stimulierte Emission Depletion (STED) und 20-40 nm für Einzelmolekül-Lokalisierung Mikroskopie (SMLM)24. Mit diesen neuen Entwicklungen der Höchstauflösung Mikroskopie sind die strukturellen Teilregionen der Zentriol erreichbar. In der Praxis ist es jedoch nach wie vor schwierig festzustellen genau die Lokalisation eines Proteins, ein tragendes Element für den Hauptgrund, dass Reife Centriolen sind in nur 2 Kopien pro Zelle vorhanden und zufällige Ausrichtungen haben, wodurch die Interpretation der Lokalisierung schwierig. Aus diesem Grund wurde ein Protokoll eingerichtet, die Forscher mit super-Resolution Imaging eine große Anzahl von Centriolen, erhöht die Chance, eindeutige Orientierungen zu beobachten zu können. Wichtig ist, da diese Methode stützt sich auf die Verwendung von isolierten Centriolen, bieten wir eine Methode, um intakte C. Reinhardtii reinigen Centriolen, die Reife Centriolen und Procentrioles enthalten.
Zu guter Letzt kann dank der Reihe von Zentriol Orientierungen, die mit diesem Protokoll abgebildet werden können, Single-Partikelanalyse angewendet werden mittels Elektronenmikroskopie Software. Dies führt zu der Generation von durchschnittlichen Klassen der Centriolen in einer bestimmten Ausrichtung. Wichtig ist, lässt diese entstehenden 2-D-Bilder dann die Lokalisierung eines spezifischen Proteins entlang der Zentriol zu beurteilen. In der Tat, diese Methode kann auf zweifarbige super-Resolution-Bilder angewendet werden, und eine Farbe kann zur offenbaren ein bestimmtes centriolar Protein Zentriol Skelett (z.B. Tubulin), während die andere Farbe zugeordnet werden kann. Durch Subtraktion der Mittelwerte bezogen mit ein oder zwei Farben, wird es einfacher, ein Protein entlang der Zentriol (proximalen, zentral oder distal) zu registrieren. Beachten Sie, dass die beiden Kanäle exakt ausgerichtet werden sollte, um irreführenden Auslegungen zu verhindern. Darüber hinaus hilft Durchschnitte von Draufsichten entschlüsseln, wenn ein Protein im Inneren der centriolar Lumen, entlang der Mikrotubuli-Wand oder außerhalb des Zentriol lokalisiert.
Diese Methode hat den Vorteil, zu prüfen, die Lokalisierung von bestimmten Proteinen, die sonst aufgrund heterogener Markierung Lokalisierung schwierig sein könnte. Beachten Sie, dass andere Methoden, um Proteine innerhalb der Centriolen Karte in korrelativen 3-d-SIM/SMLM mit, zum Beispiel Beurteilung der spezifischen Ausrichtung der Centriolen beschrieben wurden durch die Bestimmung der elliptischen Profils eines Markers bilden einen Torus um die Zentriol durch SIM-Bildgebung. Bei Verwendung dieses Parameters, ist es möglich, mit einer Genauigkeit von 4 – 5 nm30Protein zu lokalisieren. Beachten Sie auch, dass die beschriebene Methode hier isolierende Centriolen mit intakten Procentrioles, ein Zeichen verwendet, die die Zentriol Architektur am wahrscheinlichsten weitgehend erhalten geblieben ist. Jedoch können wir nicht ausschließen, die einige architektonischen Besonderheiten während der Reinigung, wie z. B. der Zentriol Durchmesser Variation mit der Konzentration von zweiwertigen kationen wie mit der Isolierung des menschlichen Centrosome5verstärkt gestört sind.
Einer der kritischen Schritte des hier vorgestellten Protokolls ist hinreichend konzentrierte isolierende Centriolen in verschiedenen Ausrichtungen Fluo-SPA zugänglich zu erhalten. Zu diesem Zweck zunächst sicherstellen Sie die Reinheit und die Effizienz des Verfahrens Zentriol isoliert. Eine niedrige Konzentration von isolierten Centriolen verhindert richtige Bildgebung und weitere Bildverarbeitung. Zu diesem Zweck bieten wir eine Methode, um die Anzahl der Centriolen pro Gesichtsfeld zu bereichern. Abhängig von der Anzahl der Centriolen in der Fraktion verwendet sollte die Lautstärke in der Konzentrator geladen mit einem maximalen Volumen von 250 µL angepasst werden.
Wichtig ist, wurde diese Methode für eine Zellwand abzüglich cw15 C. Reinhardtii Zellen entwickelt. In dieser Sorte ermöglicht die Zerbrechlichkeit der Zellwand eine ordnungsgemäße Lyse der Zellen und damit die Befreiung seines Inhalts. Dieses Protokoll ist nicht effizient für Wildtyp C. Reinhardtii Zellen, da die Zellwand verhindert, eine ordnungsgemäße Lyse dass. Alternativstrategien wie Beschallung oder einer Vorinkubation der Zellen mit Autolysin, ein Enzym, das die Zellwand31, beeinträchtigen kann müssten geschaffen werden, die Zellwand vor dem Aufbringen der Isolierung Protokoll hier vorgestellten zu ändern.
Diese Einrichtung kann mit verschiedenen Arten von Mikroskopen, von konventionellen konfokale Mikroskope bis hin zu hohen Durchsatz gewidmet Höchstauflösung Mikroskope verwendet werden. Beachten Sie, dass dabei SMLM, ein spezieller Puffer erforderlich für die ordnungsgemäße Bildgebung ist und somit eine Kammer für ein 12 mm-Deckglas mit dem Puffer auf dem Deckglas angepasst verwendet werden sollte. Nachträgliche Bildbearbeitung erfolgt mit umgekehrten Mikroskopen. Wenn das Mikroskop-Set-up ein 12 mm-Deckglas nicht zulässt, kann die hier vorgestellten Protokoll auf 18 mm Deckgläsern mit eine 30 mL Rundboden Röhrchen und einem modifizierten Adapter und Konzentrator angewendet werden. Es ist auch wichtig, beachten Sie, dass die Qualität der endgültige Wiederaufbau in SMLM hängt von der Qualität der Färbung und von den primären Antikörper verwendet, sowie die Art der Fixierung.
Zusammenfassend lässt sich sagen bieten wir eine Methode, die angewendet werden können, Bild zahlreiche Centriolen gefolgt von Fluo-SPA, die Durchschnitte der Centriolen in verschiedenen Ausrichtungen generieren wird damit zur centriolar Protein mit Genauigkeit zu lokalisieren. Wichtig ist, diese Methode im allgemeinen isoliert Centriolen von anderen Arten, andere Organellen oder großen makromolekularen Baugruppen einsetzbar. Zu guter Letzt Vorbereitung beispielhafte hier vorgestellten, kombiniert mit den letzten Algorithmenentwicklung für Single-Partikelanalyse von fluoreszierenden SMLM Daten32, konnte weitere Verbesserung in der molekularen Kartographie des großen makromolekularen öffnen Baugruppen.

Die Zentriol ist ein evolutionär konservierte Organell, das liegt an den Kern der Centrosome in tierischen Zellen und kann als eine Basaltemperatur (bezeichnet als Centriolen nachstehend) Vorlage Cilien oder Flagellen in vielen Eukaryoten1,2. Als solche sind Centriolen entscheidend für grundlegende Zelle biologischen Prozesse von Spindel Baugruppe zu Zelle signalisieren. Daher wurden Mängel in Zentriol Montage oder Funktion mit mehreren menschlichen Krankheiten einschließlich Ciliopathies und Krebserkrankungen3verbunden.
Centriolen sind multiplizieren, symmetrisch, Mikrotubuli Triplett-basierte zylindrische Strukturen, die sind, in der Regel ~ 450 nm lang und ~ 250 nm breite4,5,6,7. Konventionelle Elektronenmikroskopie und Cryo-Elektron Tomographie der Centriolen verschiedener Arten haben gezeigt, dass Centriolen entlang ihrer Längsachse mit drei verschiedene Regionen polarisiert sind: einen proximalen Bereich, einen zentralen Kern und einem distalen Region5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. wichtig ist, jede dieser Regionen zeigt strukturelle Besonderheiten. Zunächst enthält das Lumen der 100 nm langen proximalen Bereich die Wagenrad-Struktur an die Mikrotubuli Triplett durch die Pinhead Element12angeschlossen. Zweitens enthält der zentralen Region von 300 – 400 nm langen faserige dichten in das Lumen und strukturelle Eigenschaften entlang der Innenseite der Mikrotubuli: der y-förmigen Linker, die C-Röhrchen Tail und die A-Röhrchen stub9. Schließlich weist der 50 – 100 nm distalen Region Sub distale und distale Gliedmaßen, die den distalen Teil des Zentriol5,13umgeben.
Die letzten zwei Jahrzehnte waren geprägt von der Entdeckung einer wachsenden Zahl von centriolar Proteinen, was zu einer aktuellen Schätzung etwa 100 verschiedene Proteine, die als Teil der Zentriol14,15,16, 17. Trotz dieser Fortschritte bleibt die präzise Lokalisierung dieser Proteine innerhalb der Zentriol schwer, vor allem in strukturellen Unterregionen. Wichtiger ist es entscheidend für ein besseres Verständnis ihrer Funktion, strukturelle Regionen die Zentriol eine präzise Lokalisierung zuweisen. In dieser Hinsicht wurden C. Reinhardtii Centriolen beide Aspekte maßgeblich durch erste Abgrenzung der verschiedenen strukturellen Merkmale entlang der Zylinder9,18,19, die dann erlaubt Forscher, die Lokalisierung einer Teilmenge von Proteinen mit Fluoreszenz-Mikroskopie zu einer Sub-strukturelle Region zu korrelieren. Dazu gehören beispielsweise die Proteine Bld12p und Bld10p, die in den proximalen Bereich und in der Wagenrad Struktur insbesondere lokalisieren20,21,22,23. Die Liste der Unterkonstruktion lokalisiert Proteine enthält auch POB15 und POC16, zwei neue Proteine durch Massenspektrometrie identifiziert, die die innere zentrale Kernregion C. Reinhardtii Centriolen17schmücken.
Dieses Dokument enthält eine vollständige Beschreibung der Methode entwickelt, um zu isolieren und Bild C. Reinhardtii Centriolen für nachfolgende Höchstauflösung Mikroskopie und Single-Teilchen im Durchschnitt. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es wichtig, die technischen Grenzen abzugrenzen, die überwunden werden müssen. Erstens kann Zentriol Reinigung die Gesamtarchitektur, mit oft verloren werden, während die verschiedenen Schritte der Isolierung9Wagenrad-Struktur beeinflussen. Zweitens sind die Abmessungen der Zentriol sehr nah an die Beugungsgrenze in der optischen Mikroskopie. In der Tat ist die laterale Auflösung, die in der konfokalen Mikroskopie gewonnen werden können rund 200 nm24, ähnlich wie der Durchmesser der Zentriol und die Auflösung in der Z-Achse ist über 2 – 3 X niedriger, führt zu einem anisotropen Volumen. Drittens könnte die Heterogenität der Antikörper labeling und Zentriol Ausrichtung die Auslegung erforderlich, um ein Protein in einer bestimmten centriolar Sub-Region zu lokalisieren einschränken. Schließlich gibt es die Centriolen in nur zwei Kopien pro Zelle, macht es schwierig, eine große Anzahl von Bildern zu erwerben und eine eindeutige Zentriol Orientierung zu finden. Um diese technischen Probleme zu umgehen, haben wir eine Methode, die stützt sich auf die Anwendung Höchstauflösung Mikroskopie über die große Zahl der isolierten Centriolen, die verschiedenen Orientierungen annehmen. Zunächst beschreiben wir ein Protokoll C. Reinhardtii Centriolen zu reinigen, die Reinigung von strukturell intakt Centriolen und Procentrioles, enthält das Wagenrad ermöglicht. Dann beschreiben wir Schritt für Schritt Protokoll um die Centriolen auf Deckgläsern für Bildgebung durch konventionelle oder Höchstauflösung Fluoreszenz-Mikroskopie zu konzentrieren. Dieser wichtige Schritt ermöglicht zur Erhöhung der Zahl der Centriolen abgebildet in mehrere Richtungen. Zu guter Letzt werden wir beschreiben, ein Verfahren zum Ausführen, Single-Teilchen im Durchschnitt auf Daten, die auf Fluoreszenz Mikroskope, die erleichtert die Erkennung der Centriolen in verschiedenen Ausrichtungen. Insgesamt kann diese Methode von verschiedenen Arten oder anderen großen makromolekularen Versammlungen auf Bild Centriolen angewendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centriolen sind großen makromolekularen Versammlungen wichtig für die ordnungsgemäße Durchführung des grundlegenden biologischen Zellprozesse wie Zellteilung, Zelle Motilität oder Zelle signalisieren. Die Grünalge Chlamydomonas Reinhardtii erweist sich eine aufschlussreiche Modell in der Studie der Proteinzusammensetzung Zentriol Architektur und Funktionalität. Trotz der großen Fortschritte in Richtung Verständnis centriolar Architektur gehört zu den aktuellen Herausforderungen, die präzise Lokalisierung der centriolar Komponenten innerhalb der strukturellen Regionen die Zentriol festzustellen, um besser zu verstehen, ihre Rolle bei der Zentriol Biogenese. Eine große Einschränkung liegt in der Auflösung der Fluoreszenz-Mikroskopie, die die Interpretation der Protein-Lokalisierung in dieser Organellen mit Dimensionen in der Nähe der Beugungsgrenze erschwert. Um diese Frage zu lösen, bieten wir eine Methode, um zu reinigen und eine große Anzahl von C. Reinhardtii Centriolen mit unterschiedlichen Ausrichtungen Höchstauflösung Mikroskopie mit Bild. Diese Technik ermöglicht die Weiterverarbeitung von Daten durch fluoreszierende Single-Teilchen im Durchschnitt (Fluo-SPA) wegen der großen Zahl der Centriolen erworben. Fluo-SPA erzeugt Durchschnitte der gebeizt C. Reinhardtii Centriolen in verschiedenen Ausrichtungen, und erleichtert so die Lokalisierung von unterschiedlichen Proteinen in centriolar Sub-Regionen. Wichtig ist, kann diese Methode von anderen Spezies oder anderen großen makromolekularen Versammlungen auf Bild Centriolen angewendet werden.

C. Reinhardtii Zentriol Isolation: Centriolen, cw15- isolieren C. Reinhardtii Zellen waren für mehrere Tage unter Licht in Flüssigkultur angebaut und anschließend pelleted durch Zentrifugation bei 600 X g für 10 min. Pelleted Zellen 1 X mit PBS gewaschen wurden und resuspendierte in einem deflagellation Puffer vor der deflagellation durch die Durchführung eines pH-Schocks mit 0,5 M Essigsäure zu einem endgültigen pH-Wert von 4,5-4,7 für 2 min(Abbildung 1). Ein Zusatz von 1 N KOH wurde verwendet, um pH 7.0 wiederherstellen. Um freistehende Flagellen vom Zellkörper zu trennen, wurden deflagellated Zellen zuerst zentrifugiert, um den Großteil der Flagellen zu entfernen. Das Pellet wurde dann 2 X mit PBS gewaschen und Nukleinsäuretablette in 30 mL PBS vor dem laden es langsam auf einem 25 %-Saccharose-Kissen (Abbildung 1B). Das Rohr war 600 X g für 15 min bei 4 ° C, die meisten der freistehenden Flagellen entfernen gesponnen. Nach Zentrifugation, waren die Zellkörper in die Saccharose-Kissen (Abbildung 1C) zu verbreiten und erholt durch Entfernen der etwa 30 mL des Überstandes (bis der rote Pfeil in Abbildung 1C). Die daraus resultierende 20 mL gewaschenen Zellen wurden dann Nukleinsäuretablette in 20 mL kaltem PBS und 600 X g für 10 min zentrifugiert. Als nächstes der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden komplett in 10 mL PBS Nukleinsäuretablette. Die Zellen wurden zu einem 250-mL-Flasche und der Lyse-Puffer wurde hinzugefügt, um die resuspendierte Zellen auf einmal. DNase wurde hinzugefügt, um die Lyse und für 1 h bei 4 ° c inkubiert Nachdem ein Zentrifugationsschritt, Zelle Ablagerungen zu entfernen (siehe die weiße Kugel in Abbildung 1D), der Überstand wurde gesammelt und sorgfältig verladen eine 2 mL 60 % Saccharose Kissen vor der Zentrifugation bei 10.000 X g für 30 min bei 4 ° C. Beachten Sie, dass für 100 mL Lyse, 8 Tuben von 15 mL wurden verwendet, um diesen Schritt entspricht 12,5 mL Lyse Puffer geladen, auf 2 mL Saccharose pro Röhre ausführen. Nach Zentrifugation, war die meisten des Überstands entfernt bis zu 1 mL über das Kissen. 1 mL der restlichen überstand wurde dann mit 2 mL Kissen gesammelt und dann gemischt und gebündelt zu einem Endvolumen von 24 mL. Der Pool wurde verladen auf einem 40 %, 50 %, 70 % Saccharose gradient und gesponnene 68.320 x g für 1 h und 15 min bei 4 ° c Isolierte Centriolen wurden schließlich durch ein Loch im Unterteil der Zentrifugation Röhre mit einer Nadel und die Tropfen wurden in 12 x 500 µL Fraktionen gesammelt. Aufgrund der hohen Dichte von den verschiedenen Saccharose gebildet die Tropfen sehr langsam am Anfang (70 % Saccharose) und dann mehr schnell (40 % Saccharose).
Immunfluoreszenz von isolierten Centriolen Um die Qualität des Verfahrens isoliert zu beurteilen, wurde 10 µL der einzelnen gesammelten gradient Fraktionen dann auf einem deckgläschen mit einem Deckglas-Unterstützung-Adapter (Abbildung 2A-2D) zentrifugiert. Wichtig ist, um das Deckglas sicher zu entfernen, ein benutzerdefiniertes Gerät angeschlossen wurde (Abbildung 2B). Als nächstes wurden die Deckgläsern durch Immunfluoreszenz analysiert. Antikörper gegen CrSAS-6(Bld12p) wurden in dieser Studie verwendet, um das Vorhandensein der Wagenrad Struktur und α-Tubulin (DMA1) an die centriolar Wand markieren. Durch zählen der Centriolen, die für CrSAS-6 und α-Tubulin pro Gesichtsfeld positiv waren und dann berechnen die Gesamtzahl der Centriolen pro Brüche, war es möglich, festzustellen, welche Fraktionen für isolierte Centriolen ( angereichert waren Abbildung 2F-2 H). Interessanterweise wurden 6 Fraktionen Centriolen (Abbildung 2F und 2 G, Brüche #1 – 6), bereichert mit einem Spitzenwert für Bruchteil #3, während die letzten Fraktionen nicht, darauf hinweist waren, dass die Reinigung gearbeitet. Beachten Sie, dass in diesem besonderen Experiment, 95 % der gesamten Centriolen für CrSAS-6 und α-Tubulin in Bruchteil #3 positiv waren. Dies bedeutet, dass am stärksten isolierte Centriolen ihrer Wagenräder beibehalten. Wenn keine Bereicherung der Centriolen in den ersten Sekundenbruchteilen beobachtet wird, die Isolierung Verfahren funktionierte nicht und sollte wiederholt werden. Beachten Sie, dass einige flagellar Stücke meist in den Fraktionen frei von Centriolen beobachtet werden können.
Als nächstes sollte um die Gesamtzahl der Centriolen pro Mikroliter zu berechnen, die Anzahl der Zentriol pro Gesichtsfeld durch das Verhältnis wie in Abbildung 2Hpräsentiert multipliziert werden. Die sich daraus ergebende Zahl sollte dann durch das Volumen des Anteils für die Immunfluoreszenz verwendet, um die Anzahl der Centriolen pro Mikroliter erhalten unterteilt werden. In diesem Verfahren besondere Isolierung enthalten die meisten angereicherte Fraktion etwa 37 Centriolen für eine Fläche von 0,00846 mm2 (mit einem Sichtfeld von 92 x 92 µm2). Die Oberfläche des Rohrs war 7,5 mm Radius mit einer Gesamtfläche von 176 mm2. Das entsprechende Verhältnis war dann 176/0.00846 = 20,803.8, also insgesamt 769.740 Centriolen (37 x 20, 803.8) in 10 µL. Daher war die Anzahl der Centriolen in 1 µL 76.974.
Konzentration der isolierten Centriolen auf Deckgläsern: Erhöhung der Zahl der Centriolen pro Feld erhöht die Chance auf eindeutige Zentriol Orientierung erkennen, als auch erhöhen die Wahrscheinlichkeit der Erkennung von ähnlichen Orientierungen, die für die weitere Teilchen durchschnittlich Vorgehensweise verwendet werden können. Centriolen aus konzentrierteren Fraktionen noch spärlich auf dem Deckglas sind, entwickelten wir eine Zentrifugation Zubehör Centriolen in der Mitte das Deckglas(Abbildung 3)benannt einen Konzentrator zu konzentrieren. Beachten Sie, dass eine .stl-Datei mit den genauen Maßnahmen für den 3D-Druck mit dieser Handschrift versehen ist.
Erstens ein Deckglas 12 mm wurde auf der Konzentrator (Abbildung 3B) montiert. Der Adapter wurde auf das Deckglas platziert, Rundboden Röhrchen wurde invertiert und über die montierte Adapter und Konzentrator gelegt. Rundboden-Rohr wurde dann sanft invertiert, so dass die Belastung der Probe (Protokoll Schritt 4.2). Die Centriolen wurden dann 10.000 x g für 10 min bei 4 ° c zentrifugiert. Danach wurden die Centriolen Immunfluoreszenz unterzogen und gebeizt für CrSAS-6/Bld12p und α-Tubulin (Abbildung 3-3E). Wichtig ist, wurden ohne Konzentrator, etwa 30 Centriolen pro Gesichtsfeld (Abb. 3C), gesehen, während 183 Centriolen pro Gesichtsfeld gesehen wurden, wenn der Konzentrator verwendet (Abbildung 3D-3F) war. Beachten Sie, dass die Centriolen nur eine Scheibe aus 4 mm im Durchmesser in der Mitte das Deckglas abgedeckt. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Konzentration Schritt arbeitet und eine 6-fold Bereicherung der Centriolen in einer definierten Region von Deckgläsern erlaubt, damit Lockerung ihrer Entdeckung und imaging.
Fluoreszierende Single-Teilchen im Durchschnitt von isolierten C. Reinhardtii Centriolen: Hier mittels SIM-Mikroskopie, die eine Auflösung von etwa 120 erreichen kann nm, Centriolen gebeizt für Monoglutamylated Tubulin (GT335, Abbildung 4), eine Tubulin-Änderung in centriolar Mikrotubuli vorhanden waren abgebildeten24. C. Reinhardtii Centriolen sind etwa 500 nm lang, immer paarweise, und oft fand mit verbundenen, neu Probasal Körper (bezeichnet als Procentrioles im folgenden) dupliziert und gekerbter Mikrotubuli-assoziierten Fasern19. Daher war diese Endmontage ca. 1 µm groß. Aus diesem Grund und um die Centriolen in ihrer Gesamtheit Bild empfehlen wir erwerben einen Z-Stack auf die isolierte Centriolen.
Hier wurde nach der Übernahme, eine endgültige Bild generiert, durch Ausführen einer Beihilfehöchstintensität Projektion mit ImageJ28 (Bild/Stapel/Z Projekt/Max Intensität Projektion, Abbildung 4B). Von solchen Bildern war eine Single-Partikelanalyse mit Cryo-Elektron Mikroskopie Software um Klassen der Centriolen mit ähnlicher Ausrichtung zu machen und dann durchschnittlich durchgeführt wurde. Hierzu wurde die Bildfarbe zunächst invertiert, um die Objekte (Abb. 4C) besser zu visualisieren. Centriolen abgeholt wurden manuell in einer Box zentriert über jedes Teilchen mit der frei verfügbaren Scipion Software29 , die mehrere Elektronen-Mikroskopie-Software-Programme wie Xmipp3 integriert (Abbildung 4D). Beachten Sie, dass die Größe des Kastens muss vom Benutzer definiert werden. Hier, Boxen von 50 x 50 Pixel für eine Pixelgröße von 31.84 nm verwendet wurden. Als nächstes wurden alle Partikel (Abbildung 4E) extrahiert und mit Xmipp3 ausgerichtet (Abbildung 4F). Als nächstes wurde eine kreisförmige Maske von 12 Pixel Radius angewandt, um jedes Zentriol aus dem centriolar-Paar (Abb. 4G) zu isolieren. Die Partikel wurden dann klassifiziert, mit Xmipp3, um mehrere Durchschnitte zu erzeugen. Nur wurden homogene Klasse Durchschnittswerte gehalten, was bedeutet, dass Partikel, die von der Klasse Durchschnitt abweichen manuell ausgeschlossen wurden. Dieser Schritt wurde wiederholt, um eine nahezu perfekte Durchschnitt für jede gewählte Ausrichtung zu generieren. Nach fünf Wiederholungen wurden zwei Klassen von Durchschnittswerten generiert: eine Draufsicht aus 63 Objekte (Abbildung 4H) und eine Seite Anzeigen von 98 Partikeln (Abbildung 4ich) des Monoglutamylated Centriolen. Die Abmessungen des Objekts wurden durch Messen des Abstands zwischen den Gipfeln der Intensität Plot Profil entlang des Monoglutamylation-Signals bestimmt.
Wichtig ist, ist die Länge der Seitenansicht Klassendurchschnitt 260 nm mit einem Durchmesser von 250 nm, vergleichbar mit den gemessenen Monoglutamylated-Tubulin-Signal, das gezeigt wurde, zu einer Region von 286 ± 33 nm Länge innerhalb des Kerns der Zentriol17zu lokalisieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> Abbildung 1 : Reinigung von C. Reinhardtii Centriolen. (A) Dies ist eine schematische Darstellung der einzelnen Schritte führen zur Isolation des C. Reinhardtii Centriolen. Freuen Sie sich auf repräsentative Schritte des Protokolls (B) vor und (C) nach Zentrifugation auf 25 % Saccharose Farbverlauf. Der rote Pfeil im Feld C gibt das minimale Volumen nach Zentrifugation zu halten. (D) dieses Panel zeigt die weiße Kugel lysierten Zellen nach Zentrifugation. Der schwarze Pfeil zeigt das Pellet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> Abbildung 2 : Zentrifugation Setup durchführen Immunfluoreszenz auf isolierte Centriolen. (A) 10 µL der einzelnen gesammelten Fraktionen wird zuerst in 100 µL 10 mM K-Rohre (pH 7,2) verdünnt. (B) Dies ist eine schematische Darstellung der Zentrifugation Geräte, umfasst eine 15 mL Rundboden-Schlauch, ein 12 mm-Deckglas, einen Adapter für das Deckglas und eine maßgeschneiderte angeschlossen Gerät das Deckglas nach Zentrifugation zu erholen. Tafeln, C und D zeigen Zeichnungen erklären, wie man das Deckglas nach Zentrifugation zu erholen. (C) Ort das hakenförmige Werkzeug in das Loch im gekerbtem Rand des Adapters und (D) ziehen. (E) sind Bilder der feuchten Kammer Immunfluoreszenz Bildgebung durchführen musste. Der Pfeil zeigt die 12 mm-Deckglas. (F) sind repräsentative konfokale Bilder bei 63 X (zoom 2) gradient Brüche #1-8, gesammelt während der Reinigungsprozedur und gebeizt für CrSAS-6 (rot) und α-Tubulin (grün). Die Intarsien entsprechen der Region durch ein weißes Feld in der unteren Vergrößerung Ansichten angezeigt. Maßstabsleiste = 10 µm. (G) Dies ist ein Diagramm der Centriolen positiv für CrSAS-6 und α-Tubulin pro Gesichtsfeld in jede Fraktion darstellt. Beachten Sie die Bereicherung in Sekundenbruchteilen #1-6. Die durchschnittliche Anzahl der Centriolen pro Feld in jedem Bruchteil: #1 = 16,3 ± 4,7, #2 = 24,0 ± 4,6, #3 = 37,0 ± 17,0, #4 = 23,3 ± 11,4, #5 = 14,3 ± 2.1, #6 = 13,7 ± 9,3, #7 = 2,7 ± 1,2, #8 = 1,0 ± 0.0, #9 = 1,0 ± 0.0, #10 = 0.0 ± 0.0, #11 = 0,3 ± 0,6, #12 = 0.0 ± 0,0. Für jede Fraktion wurden 3 ZUFALLSFELDER abgebildet. Beachten Sie, dass bei den meisten angereicherten Bruch #3 zählen, wir fanden, dass 95 % der Centriolen für CrSAS-6 und α-Tubulin positiv (n = 205 Centriolen). (H) A Verhältnis der Anzahl der Centriolen im gemessenen Bereich von den mikrographen wird verwendet, um die Gesamtzahl der Centriolen in der Gegend des Rohres zu berechnen. Die Zentriol Anzahl pro Mikroliter kann aus 10 µL ursprünglich zentrifugiert Brüche berechnet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> Abbildung 3 : Isolierte Centriolen sind zentrifugiert mit Konzentratoren. (A) dieses Panel zeigt die Zentrifugation Geräte Centriolen auf Deckgläsern vor Immunfluoreszenz, einschließlich eine 15 mL Rundboden-Tube, einem Konzentrator, ein 12 mm-Deckglas und eine Unterstützung Adapter Apparat konzentrieren musste. (B) dieses Panel zeigt die Schritte der Zentrifugation Gerät zusammenzubauen. Seitenteile C-E zeigen konfokale Bilder der Centriolen (D-E), CrSAS-6 (rot) oder α-Tubulin (grün) (C) ohne mit der Konzentrator befleckt. Die Intarsien entsprechen der Region durch ein weißes Feld in der unteren Vergrößerung Ansichten angezeigt. Der Maßstab ist 10 µm. Beachten Sie, dass die Centriolen sind in der Mitte das Deckglas (die gestrichelte Linie stellt die Grenze des Bereichs konzentriert) angereichert. (F) dieses Diagramm stellt die Anzahl der Centriolen pro Gesichtsfeld ohne und mit der Konzentrator. Fünf zufällige Gesichtsfelder wurden analysiert. Die durchschnittliche Anzahl der Centriolen ist, ohne Konzentrator, 29,8 ± 2,9, und mit Konzentrator, 182,6 ± 11,5, P < 0,0001. Die statistische Signifikanz wurde durch eine ungepaarte tbeurteilt-testen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> Abbildung 4 : Single-Teilchen im Durchschnitt auf isolierten C. Reinhardtii Centriolen. (A) dieses Panel zeigt Z Bilder Stapeln der Centriolen mit GT335 befleckt und erwarb mit einem SIM-Mikroskop. (B) zeigen diese Platten eine maximale Intensität Z Projektion der gestapelten Bilder. Maßstabsleiste = 1 µm. (C) Diese Tafeln zeigen ein repräsentatives Bild mit einer umgekehrten Kontrast. Der Inset repräsentiert eine Zoom-in, die Centriolen besser zu visualisieren. (D) Diese Tafeln zeigen Teilchen Kommissionierung. Der Inset zeigt an, wie die Partikel abgeholt wurden. (E) sind Beispiele für 5 extrahiert Partikel. (F) dieses Panel zeigt die Partikel nach dem ausrichten. (G) dieses Panel zeigt die Partikel nach dem Auftragen einer Maske. Panels H und ich zeigen zwei Klasse Durchschnitte: (H) ein Top View (63 Partikel) und (ich) eine Seitenansicht (98 Partikel). Die doppelte Pfeile zeigen die Dimensionen des GT335 Signals. Maßstabsleiste = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
Ergänzende Datei 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
Ergänzende Datei 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>

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Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolation und Fluoreszenz-Imaging für Single-Particle-Rekonstruktion der Chlamydomonas Centriolen

Wir haben eine Strategie, um zu reinigen und Bild eine große Anzahl von Centriolen in verschiedenen Ausrichtungen für Höchstauflösung Mikroskopie und Single-Teilchen im Durchschnitt entwickelt.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Centriole-Feld zu beantworten, wie z. B. die Lokalisierung von Protein entosamung in eine bestimmte Region des Centriole. Der Hauptvorteil dieser Techniken, dass wir die Mittel zur Verfügung stellen, um Centriole zu konzentrieren, um sie in mehreren Ausrichtungen zu bekommen. Obwohl diese Methode Einblicke in Chlamydomonas centriole Biologie bieten kann, kann es auch auf andere System angewendet werden, wie isolierte menschliche und Paramecium-Zenriole.Demonstriert wird das Verfahren von Doktorand Nikolai Klena, einer weiteren Doktorandin Maeva Le Guennec und dem Postdoc im Labor Davide Gambarotto. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zunächst alle Medien und Kultur die C.Reinhardtii Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben vorzubereiten. Die vorbereiteten Zellen in 50 Milliliter konische Schläuche übertragen und 10 Minuten lang bei 600 mal g zentrifugieren.Waschen Sie das Pellet einmal mit 50 Millilitern 1x PBS und drehen Sie die Zellen wieder bei 600 mal g für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet in 100 Milliliter Raumtemperaturdeflagellationspuffer wieder aufzuhängen. Legen Sie das Becherglas auf einen Magnetischen Rührer und fügen Sie langsam 0,5 Molessigsäure zu einem endgültigen pH-Wert von 4,5 bis 4,7 hinzu.Lassen Sie diese Mischung bei Raumtemperatur für zwei Minuten inkubieren. Danach fügen Sie langsam Tropfen eines normalen Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,0 wiederherzustellen, übertragen Sie die Zellen auf 50 Milliliter-Röhren, und zentrifugieren Sie sie bei 600 mal g für 10 Minuten, um alle abgelösten Flagella zu entfernen. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet auf Eis, bis es zum Waschen bereit ist.Wenn Sie fertig sind, waschen Sie das Pellet zweimal mit 50 Millilitern 1x PBS bei vier Grad Celsius pro Wäsche. Drehen Sie das gewaschene Pellet bei 600 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Das Pellet in 30 Millilitern 1x PBS wieder aufhängen.Dann die Aufhängung langsam auf ein 20-Milliliter-Kissen mit 25% Saccharose laden, ohne zu mischen. Drehen Sie bei 600 mal g und vier Grad Celsius für 15 Minuten, um alle verbleibenden Flagella zu entfernen und die Zellen in der Saccharose zu verbreiten. Mit einem Aspirator, vorsichtig aspirieren sie den Überstand halten nur die untersten 20 Milliliter.Waschen Sie die restliche Saccharose, indem Sie 20 Milliliter kalte 1x PBS hinzufügen. Zentrifuge bei 600 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter 1x PBS bei vier Grad Celsius wieder auf, um sicherzustellen, dass sich keine Klumpen in der Lösung befinden.Übertragen Sie das resuspendierte Pellet in eine neue 250-Milliliter-Flasche, fügen Sie den Lysepuffer, ergänzt durch 5.000 Einheiten DNase, in die Flasche mit den Zellen. Bei vier Grad Celsius für eine Stunde inkubieren, während alle 15 Minuten durch sorgfältiges Umkehren der Flasche gemischt wird. Übertragen Sie die lysierten Zellen in ein 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifuge bei 600 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten.Mit einer Pipette den Überstand sammeln und in ein 30-Milliliter-Rundbodenrohr auf Eis mit zwei Millilitern 60%Saccharosekissen laden. Zentrifugieren Sie dies bei 10.000 mal g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Danach den Überstand bis zu einem Milliliter über dem Saccharosekissen ansaugen.Beachten Sie die gelbe Schnittstelle zwischen dem einen Milliliter des verbleibenden Überstandes und den zwei Millilitern Saccharosekissen. Mit einer geschnittenen P1000-Spitze den restlichen Überstand vorsichtig mit der Saccharose vermischen. Alle Saccharosekissen bündeln und auf Eis lagern.Als nächstes bereiten Sie einen 40% bis 70% Saccharosegradienten in einem dünnwandigen 38,5 Milliliter Polypropylenrohr vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Laden Sie die gepoolten Schnittstellen langsam in den Farbverlauf. Balancieren Sie die Rohre mit dem 10 Millimolaren K-PIPES Puffer und Zentrifuge bei 68, 320 mal g und vier Grad Celsius für 75 Minuten.Danach verwenden Sie eine 0,8-Millimeter-Nadel, um ein Loch in der Unterseite des Rohres zu machen, um sicherzustellen, dass die verschiedenen Saccharoseschichten nicht gestört werden. Verwenden Sie dieses Loch, um 12 500 Mikroliter-Fraktionen bei vier Grad Celsius zu sammeln. Mit einer geschnittenen P200-Spitze, bereiten Sie eine zusätzliche 10 Mikroliter Aliquot aus jeder Fraktion während der Immunfluoreszenz verwendet werden.Dann fangen Sie die Fraktionen in flüssigem Stickstoff ein. Legen Sie zunächst einen sterilen 12-Millimeter-Deckel auf das eingelassene untere Ende des Konzentrators, um die PDL-beschichtete Seite nach unten zu halten. Legen Sie den Adapter direkt oben, um den Deckelzuschlag zu kappen.Dann das rund-untere Rohr umkehren und über den Konzentrator, den Deckelund den Adapter legen. Mit einer Pinzette schieben Sie das Ensemble vorsichtig, bis es den Boden des Rohres erreicht, und dann das Rohr umkehren. Fügen Sie 10 Millimolar K-PIPES Puffer hinzu, bis er die Oberseite des Konzentrators erreicht.Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Zentralzylinder des Konzentrators befinden. 100 Mikroliter 10 Millimolar K-PIPES Puffer vorsichtig zu einem der Aliquots der angereicherten Zentrriolarfraktion geben und mit einer P200 Pipette gründlich mischen. Als nächstes entfernen Sie 100 Mikroliter K-PIPES Puffer aus der Hohlmitte des Konzentrators, und fügen Sie 100 Mikroliter der Pufferfraktionsmischung hinzu, um sicherzustellen, dass der Inhalt im Hohlzentrum des Konzentrators verbleibt.Drehen Sie bei 10.000 mal g für 10 Minuten in einer Zentrifuge, die auf vier Grad Celsius vorgekühlt ist. Danach verwenden Sie eine Pinzette, um den Konzentrator zu entfernen. Legen Sie ein handgefertigtes Gerät in das Loch ein, das in der Schlitzkante des Adapters vorhanden ist, und heben Sie es vorsichtig an, um den Deckelzuschlag wiederherzustellen.Sobald es die Oberseite des Rohres erreicht, verwenden Sie einen Gehandicapfinger, um die Kante des Adapters zu fangen und verwenden Sie eine Pinzette, um den Deckelschlupf zu entfernen, wobei Sie darauf achten, welche Seite des Deckels Zenrios enthält. Führen Sie dann fixierende und immunfluoreszenzfärbung der konzentrierten Zenrios durch. Zunächst die Deckellipsen mit den Zenriolen in der vorbereiteten Kristall-Polystyrol-Getriebe-Laborbox, gefüllt mit 100%Methanol bei minus 20 Grad Celsius, für 5 Minuten inkubieren.Mit einer Pinzette die Abdeckungen in eine transparente Laborbox mit 50 Millilitern 1x PBS zu übertragen. Lassen Sie die Dias in der PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur waschen. Dann mischen sich 60 Mikroliter Primärantikörper in einer befeuchteten Kammer auf ein Stück Labordichtungsfolie.Legen Sie die Abdeckungen vorsichtig auf die Antikörpermischung mit den Centriolen direkt auf den Tropfen. Lassen Sie die Abdeckungen 45 Minuten lang inkubieren. Danach die Abdeckungen entfernen und fünf Minuten lang in einer PBS-Box waschen.Inkubieren Sie die gewaschenen Abdeckungen für 45 Minuten, mit sekundären Antikörpern in PBS 1%BSA und 0.05%Tween-20. Entfernen Sie die Abdeckungen und waschen Sie sie für fünf Minuten in einer Box mit PBS. Montieren Sie den Deckelrutsch mit einem regelmäßigen Anti-Fading-Montagemedium auf einen Schlitten.Dann stellen Sie die isolierten Zentrikel auf einem konfokalen Mikroskop bei einem 63X Ölobjektiv mit einem N.A.von 1,4, während sie Dekonvolution anwenden. Richten Sie die obere und untere Position des Z-Stacks oberhalb bzw. unterhalb des Centriole-Signals ein, und erfassen Sie einen großen Stapel von Bildern, die das gesamte Centriole-Signal umfassen. Projizieren Sie den Stapel, und führen Sie eine Einzelpartikelmittelung aus, wie im Textprotokoll beschrieben.Repräsentative Immunfluoreszenz zeigt, dass sechs Fraktionen für isolierte Zenrios angereichert sind, mit einem Spitzenwert für Fraktion Nummer drei, während die letzten beiden Fraktionen dies nicht sind, was darauf hindeutet, dass die Reinigung erfolgreich ist. Nur etwa 30 Zentimeter werden pro Sichtfeld ohne den Konzentrator gesehen, während 183 mit dem Konzentrator zu sehen sind. Dies zeigt, dass der Konzentratorschritt erfolgreich ist, und ermöglicht eine sechsfache Anreicherung von Zenriolen in einer definierten Region, wodurch sie leichter erkannt und abgebildet werden können.Super-Auflösungsmikroskopie wird dann verwendet, um Centrioles für monoglutamyiertes Tubulin zu beflecken, und Software wird verwendet, um einen nahezu perfekten Durchschnitt für jede gewählte Ausrichtung zu generieren. Nach fünf Iterationen wurden zwei Klassen von Durchschnittswerten von monoglutamyierten Centriolen generiert: eine Ansicht von 63 Objekten und eine Seitenansicht aus 98 Partikeln. Die Länge des Seitenansichtsklassendurchschnitts beträgt 260 Nanometer mit einem Durchmesser von 250 Nanometern, vergleichbar mit dem gemessenen monoglutamylierten Tubulinsignal, das im Kern des Zenriole lokalisiert wird.Während dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den isolierten Centriole auf Eis zu halten und sie nach der Isolierung einzufrieren. Nach diesem Verfahren kann eine andere Methode wie Kryo-Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die native Architektur des Centriole oder die Centriole-Proteinzusammensetzung.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Paarung und Tetrad Trennung von Chlamydomonas reinhardtii Für genetische Analysen

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Forschung

Biologie

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