Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

אנו מודים פייר Gönczy, את BioImaging & אופטיקה פלטפורמה (BIOP) ב אקול פוליטכניק Fédérale דה לוזאן (EPFL), לוזאן, שווייץ, שבו נרכשו הדימויים centrioles ה-SIM. ניקולאי Klena Davide Gambarotto נתמכים על ידי המועצה האירופית למחקר (ERC) התחלתי גרנט (StG) 715289 (דגש) ו- Maeva Le Guennec, פול Guichard, תוכנית בידור האמל מאת PP00P3_157517 השוויצרי הלאומי למדע קרן (SNSF). Susanne Borgers נתמך על ידי באוניברסיטת ג'נבה.

<ol>
	<li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+in+cells+and+organisms.">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li><li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+and+only+once:+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease.">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrioles,+centrosomes,+and+cilia+in+health+and+disease.">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li><li>G&#246;nczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly.">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li><li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+organization+and+centriole+architecture:+their+sensitivity+to+divalent+cations.">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li><li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+structure.">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+basal+bodies+in+paramecium.">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).</li><li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis.">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li><li>Li, S., Fernandez, J. -. J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography.">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li><li>Guichard, P., Chr&#233;tien, D., Marco, S., Tassin, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography.">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry.">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li><li>Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartwheel+assembly.">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes.">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li><li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure.">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li><li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging.">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis.">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li><li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii.">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).</li><li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus:+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body.">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, 2663-2674 (2004).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy.">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms.">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813 (2017).</li><li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology.">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li><li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Approaches+to+the+Study+of+the+Role+of+Metals+in+the+Metabolism+of+Microorganisms.">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li><li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles.">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li><li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyVolution-the+smart+path+to+confocal+super-resolution.">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+3D-SIM/SMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+&#8764;4-5+nm.">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of &#8764;4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li><li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+lytic+enzymes+(autolysins)+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+(hydroxy)proline-specific+proteases.">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li><li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images.">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

אחד האתגרים בביולוגיה הוא לפענח את ההתאמה המדויקת של חלבונים בהקשר אדריכלי. צנטריול הוא מבנה אידיאלי כדי להחיל שיטות אלה, כפי הארכיטקטורה נחקרה באמצעות טומוגרפיה הקפאה אלקטרונים, חושף תכונות מעניינות ultrastructural לאורכו. עם זאת, בשל המידות קרוב מגבלת רזולוציה במיקרוסקופ אופטי, קשה למקם בדיוק חלבון מאת immunofluorescence לאזור תת מבנית של צנטריול באמצעות מיקרוסקופים קונבנציונאלי30.
רזולוציית במיקרוסקופ אופטי הוא מוגבל על ידי בשבירת קרני האור שנותן, בערך, רוחבי ברזולוציה מקסימלית של 200 ננומטר מיקרוסקופ אופטי24. עם זאת, מגבלה זו כבר by-passed על ידי אחד של פריצות הדרך הגדולות של 20 השנים האחרונות מיקרוסקופ אופטי: המצאת שיטות סופר רזולוציה. גישות אלה יכולים ליצור תמונות מעבר לגבולות עקיפה ברזולוציות שונות: 120 ננומטר עבור SIM, כ-50 nm עבור דלדול פליטה מאולצת (STED) ו- 20-40 ננומטר עבור מולקולה בודדת לוקליזציה מיקרוסקופ (SMLM)24. ההתפתחויות של מיקרוסקופ ברזולוציה סופר, מחוזות משנה מבניים צנטריול תמצאו בר-השגה. עם זאת, בפועל, זה עדיין קשה לקבוע במדויק הלוקליזציה של חלבון לרכיב המבני עבור הסיבה העיקרית כי centrioles בוגרת קיימים רק שני עותקים לכל תא ויש אוריינטציות אקראי, מה שהופך את הפרשנות של לוקליזציה קשה. מסיבה זו, פרוטוקול הוקם המאפשר לחוקרים תמונה על ידי סופר רזולוציה מספר גדול של centrioles, יגדיל את הסיכוי לצפות אוריינטציות חד משמעיים. חשוב, כפי בשיטה זו נסמכת על השימוש centrioles מבודדים, אנו מספקים שיטה לטהר ללא פגע reinhardtii ג centrioles המכילות בוגרת centrioles ו- procentrioles.
בסופו של דבר, בשל הטווח של אוריינטציות צנטריול זה יכול לדימות עם פרוטוקול זה, ניתוח חד-חלקיק יכול להיות מיושם באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תוכנה. התוצאה הדור של מחלקות הממוצע של centrioles בכיוון מסוים. חשוב, אלה תמונות דו-ממד וכתוצאה מכך ואז ניתן להעריך הלוקליזציה של חלבון ספציפי לאורך צנטריול. אכן, בשיטה זו ניתן להחיל תמונות סופר-ברזולוציה כפול-צבע, צבע אחד יכול לשמש כדי לחשוף השלד צנטריול (למשל, טובולין), בעוד אחרים הצבע ניתן לייחס centriolar חלבון ספציפי. על-ידי חיסור את הממוצעים שהושג עם צבע אחד או בשני צבעים, הוא הופך להיות יותר קל לרשום חלבון לאורך צנטריול (proximal, מרכזי או דיסטלי). שימו לב כי בין שני הערוצים במדויק יש ליישר כדי למנוע כל פרשנויות מטעה. יתר על כן, ממוצעים של תצוגות העליון יסייעו לפענח אם חלבון. רגישה בפנים centriolar לומן, לאורך הקיר microtubule או החוצה את צנטריול.
בשיטה זו יש יתרון לאמת הלוקליזציה של חלבונים מסוימים זה יכול להיות קשה להתאים לשפה אחרת בשל תיוג הטרוגנית. שימו לב כי שיטות אחרות כדי למפות חלבונים בתוך centrioles תוארו בכתבי correlative תלת-ממדי SIM/SMLM עם, למשל, להעריך את כיווני ספציפית של centrioles על-ידי קביעת הפרופיל אליפטית של סמן ויוצרים הטורוס סביב צנטריול מאת SIM הדמיה. שימוש בפרמטר זה, אפשרי להתאים לשפה חלבון עם דיוק של 4 – 5 nm30. שימו לב גם כי השיטה המתוארת כאן משתמש centrioles מבודדים עם procentrioles ללא פגע, סימן כי הארכיטקטורה צנטריול הוא כנראה במידה רבה והתפאורה. עם זאת, נוכל לפסול חלק מהתכונות אדריכליים הם והפריעו במהלך טיהור, כגון צנטריול קוטר משתנה עם הריכוז של קטיונים דו ערכיים כפי מוגבר עם הבידוד של האדם centrosome5.
אחד הצעדים הקריטיים של פרוטוקול המוצג כאן הוא לקבל centrioles מבודדים מספיק מרוכז נוטה Fluo-ספא שונים הכיוונים. לשם כך, תחילה ודא את הטוהר ואת היעילות של ההליך בידוד צנטריול. ריכוז נמוך של centrioles מבודדים תמנע נאות הדמיה ועיבוד תמונה נוספת. למטרה זו, אנו מספקים שיטה להעשיר את מספר centrioles לכל שדה ראייה. בהתאם למספר centrioles ב השבר בשימוש, האחסון שטעון במסוע צריך להיות מותאם, עם נפח מירבי של 250 µL.
חשוב, שיטה זו פותחה עבור חומה תא פחות תאים cw15-סי reinhardtii . זן זה, מאפשרת השבריריות של דופן התא של פירוק תקין של התאים, לפיכך, לשחרור התוכן שלה. פרוטוקול זה אינו יעיל עבור פראי-סוג reinhardtii ג תאים, כמו קיר התא מונעת פירוק תקין של. אסטרטגיות אלטרנטיביות כגון sonication או של דגירה מראש של התאים עם autolysin, אנזים זה יכול לבזות את דופן התא31, יצטרך לשים במקום לשנות קיר התא לפני החלת פרוטוקול בידוד המוצג כאן.
זה יכול לשמש עם סוגים שונים של מיקרוסקופים, ועד מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי מיקרוסקופים סופר רזולוציה תפוקה גבוהה ייעודי. שימו לב כשאתם עושים את SMLM, מאגר מיוחד נדרש עבור הדמיה נכונה, לפיכך, חדר מותאם של coverslip 12 מ מ עם המאגר מעל coverslip אמור לשמש. הדמיה לאחר מכן יבוצעו עם מיקרוסקופים הפוכה. אם הסידור מיקרוסקופ אינו מאפשר coverslip של 12 מ מ, ניתן ליישם את הפרוטוקול המובאת כאן coverslips 18 מ מ באמצעות צינור עגול-התחתון 30 מ ל ו מתאם ששונה רכז. חשוב גם הערה כי האיכות של השחזור האחרון ב- SMLM תהיה תלויה האיכות של ההכתמה ושל הנוגדן העיקרי בשימוש, כמו גם השיטה של קיבעון.
לסיכום, אנו מספקים שיטה שבה ניתן להחיל על התמונה centrioles רבים אחריו על ידי Fluo-ספא שתפיק ממוצעים של centrioles ב נטיות שונות, ובכך מסייעת למקם חלבון centriolar עם דיוק. חשוב לציין, בשיטה זו ניתן להחיל באופן כללי יותר centrioles מבודדים מפני זנים אחרים, organelles אחרים, או מכלולים macromolecular גדולים. בסופו של דבר, הגישה הכנה לדוגמה המוצגת כאן, בשילוב עם האחרונים פיתוח אלגוריתמים לניתוח יחיד-חלקיקים של SMLM פלורסנט נתונים32, יכול לפתוח עוד שיפור מולקולרית הקרטוגרפיה של גדול macromolecular הרכבות.

צנטריול הוא אברון אבולוציונית שנשמרת שוכנת בליבה של centrosome בתאים בעלי חיים, יכול לשמש גוף בזאלי (המכונה centrioles להלן) cilia תבנית או שוטון פרוקריוטים רבים1,2. בתור שכזה, centrioles הם קריטיים עבור התא הבסיסי הנע בין מכלול ציר לתא איתות תהליכים ביולוגיים. לכן, פגמים צנטריול הרכבה או בפונקציה קושרו עם מספר פתולוגיות האנושי כולל ciliopathies ו סרטן3.
Centrioles הם nine-fold, סימטרי, microtubule גלילי מבני זה מבוסס שלישיה הם, בדרך כלל, ~ 450 nm ארוך ו ~ 250 ננומטר רחב4,5,6,7. מיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונאלי וטומוגרפיה אלקטרונים הקפאה של centrioles של מינים שונים חשפו כי centrioles הם מקוטב לאורך ציר זמן שלהם עם שלושה אזורים נפרדים: אזור proximal הליבה המרכזית, אזור דיסטלי5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. חשוב, כל אחד \ ת באיזורים הבאים מציג תכונות מבניות ספציפיות. ראשית, לומן של האזור proximal 100 ננומטר באורך מכיל את מבנה cartwheel מחובר על שלישיה microtubule באמצעות רכיב ראש סיכה12. שנית, 300-400 nm באורך באזור המרכז מכיל סיבי צפיפויות תכונות לומן מבניים לאורך הפנים הפנימי של microtubules: את מקשר בצורת Y, הזנב צנורית-C ו- A-צנורית דפק9. בסופו של דבר, האזור דיסטלי של nm 50 – 100 תערוכות תוספות תת דיסטלי ו דיסטלי המקיפים את החלק הדיסטלי של5,צנטריול13.
בשני העשורים האחרונים סומנו על ידי הגילוי של מספר גדל והולך של חלבונים centriolar, המוביל הערכה הנוכחית של-100 חלבונים ברורים להיות חלק ה צנטריול14,15,16, 17. למרות ההתפתחויות הללו, ההתאמה המדויקת של חלבונים אלה בתוך צנטריול נותרת חמקמקה, במיוחד בתוך אזורים תת מבניים. חשוב לציין, הקצאת לוקליזציה מדויק של מבנה מחוזות צנטריול חיונית הבנה טובה יותר של תפקידם. במובן זה, reinhardtii ג centrioles סייעו שני היבטים על ידי התכונות מבניים שונים לאורך גליל9,18,19, אשר לאחר מכן מותר delimitating הראשון חוקרים לתאם הלוקליזציה של תת-קבוצה של חלבונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לאזור תת מבנית. זה כולל, לדוגמה, את החלבונים Bld12p ו Bld10p, אשר בתרגום באזור צינתור, במבנה cartwheel בפרט20,21,22,23. הרשימה של חלבונים בתיוג לשפות אחרות כוללת גם POB15, POC16, שני חלבונים הרומן המזוהה באמצעות ספקטרומטר מסה המעטרים את האזור לליבה המרכזית של reinhardtii ג centrioles17.
מאמר זה מספק תיאור מלא של השיטה שפותחה כדי לבודד תמונה reinhardtii ג centrioles הבאים סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה, ממוצע של חלקיק בודד. כדי להשיג מטרה זו, חשוב על המגבלות הטכניות שצריך להתגבר. ראשית, טיהור צנטריול יכול להשפיע על הארכיטקטורה הכוללת, עם המבנה cartwheel לעיתים קרובות אבדו במהלך השלבים השונים של בידוד9. שנית, הממדים של צנטריול נמצאים קרוב מאוד לגבול עקיפה במיקרוסקופ אופטי. אכן, הרזולוציה לרוחב שניתן להשיג במיקרוסקופיה קונפוקלית הוא כ-200 nm24, דומה לקוטר של צנטריול את, ואת את הרזולוציה z-ציר הוא על 2-3 x נמוך יותר, המוביל אל אמצעי אחסון אנאיזוטרופי. שלישית, הטרוגניות של תיוג נוגדן וכיוון צנטריול יכול להגביל את הפרשנות צריכה להתאים לשפה חלבון באזור תת centriolar מסוים. לבסוף, centrioles קיימים רק שני עותקים לכל תא, ולכן קשה למצוא אוריינטציה ברורה וחד משמעית צנטריול לרכוש מספר גדול של תמונות. כדי לעקוף בעיות טכניות אלה, פיתחנו שיטה המסתמכת על החלת סופר-רזולוציה מיקרוסקופ על מספרים גדולים של centrioles מבודדים שמאמצים כיוונים שונים. ראשית נתאר פרוטוקול לטהר reinhardtii ג centrioles המאפשרת הטיהור של centrioles מבנית, procentrioles המכיל את cartwheel. לאחר מכן, נתאר את פרוטוקול צעד אחר צעד להתרכז centrioles על coverslips לדימות מאת קונבנציונאלי או מיקרוסקופ פלואורסצנטי סופר רזולוציה. שלב חשוב זה מאפשר הגדלת מספר centrioles עם תמונה הכיוונים מרובים. לבסוף, נתאר את הליך ביצוע יחיד-חלקיקים בממוצע על נתונים רכשה במיקרוסקופ פלואורסצנטי המקל על הגילוי של centrioles ב נטיות שונות. בסך הכל, בשיטה זו ניתן להחיל תמונה centrioles מינים שונים או הרכבות macromolecular גדולות אחרות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioles הם להרכבות גדולות macromolecular החשובים עבור ביצוע נאות של התא הבסיסי תהליכים ביולוגיים כגון חלוקת התא, התא תנועתיות או איתות התא. האצות הירוק Chlamydomonas reinhardtii הוכיחה להיות מודל תובנה במחקר של אדריכלות צנטריול פונקציה, הרכב החלבון. למרות ההתקדמות הגדולה לקראת הבנה אדריכלות centriolar, אחד האתגרים הנוכחיים היא לקביעת ההתאמה המדויקת של רכיבים centriolar בתוך מבנה מחוזות צנטריול כדי להבין טוב יותר את תפקידם ב- צנטריול להן. מגבלה משמעותית טמון ברזולוציה של מיקרוסקופ פלורסצנטיות, אשר מסבך את הפרשנות של חלבון לוקליזציה של אברון זה עם ממדים קרוב לגבול עקיפה. כדי להתמודד עם שאלה זו, אנו מספקים שיטה לטהר, תמונה מספר רב של reinhardtii ג centrioles עם נטיות שונות באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה-העל. טכניקה זו מאפשרת עיבוד נוסף של נתונים דרך ניאון יחיד-חלקיקים בממוצע (Fluo-SPA) בשל המספר הגדול של centrioles רכשה. Fluo-ספא יוצר ממוצעים של צבעונית centrioles reinhardtii ג ב נטיות שונות, ובכך להקל על הלוקליזציה של חלבונים שונים באיזורים תת centriolar. חשוב, בשיטה זו ניתן להחיל על התמונה centrioles מינים אחרים או הרכבות macromolecular גדולות אחרות.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

בידוד והדמיה פלורסצנטיות עבור שחזור יחיד-חלקיקים של Chlamydomonas Centrioles

פיתחנו אסטרטגיה טיהור וגירוש של תמונה מספר רב של centrioles ב לשכנוע סופר-רזולוציה מיקרוסקופיה של יחיד-חלקיקים ממוצע של נטיות שונות.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום centriole, כגון לוקליזציה של חלבון לאזור מסוים של centriole. היתרון העיקרי של טכניקות אלה שאנו מספקים את האמצעים להתרכז centriole כדי לקבל אותם בכיוון מרובה. למרות שיטה זו יכולה לספק תובנות לביולוגיה Centriole Chlamydomonas, זה יכול להיות מיושם גם על מערכת אחרת, כגון centrioles אדם ופרמקיום מבודדים.הפגנת ההליך תהיה דוקטורנט ניקולאי קלנה, דוקטורנט נוסף מאיבה לה גונק, והפוסט-דוקטורט במעבדה Davide Gambarotto. כדי להתחיל בהליך זה, הכן תחילה את כל המדיה והתרבות של התאים C.Reinhardtii כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מעבירים את התאים המוכנים לצינורות חרוטיים 50 מיליליטר וצנטריפוגה אותם ב 600 פעמים g במשך 10 דקות.לשטוף את גלולה פעם אחת עם 50 מיליליטר של 1x PBS ולסובב את התאים שוב ב 600 פעמים גרם במשך 10 דקות. השתמש פיפטה כדי לנצל מחדש את גלולה ב 100 מיליליטר של חיץ deflagellation טמפרטורת החדר. מניחים את המזווה על ערבוב מגנטי, ומוסיפים לאט 0.5 חומצה אצטית טוחה ל- pH סופי של 4.5 עד 4.7.תן תערובת זו דגירה בטמפרטורת החדר במשך שתי דקות. לאחר מכן לאט להוסיף טיפות של אחד נורמלי אשלגן הידרוקסיד כדי לשחזר את ה- pH ל 7.0, להעביר את התאים 50 צינורות מיליליטר, צנטריפוגה אותם ב 600 פעמים g במשך 10 דקות, כדי להסיר כל דגלה מנותקת. השליכו את העל-טבעי ואחסנו את גלולת הקרח עד שהם מוכנים לכביסה.כאשר מוכן, לשטוף את גלולה פעמיים באמצעות 50 מיליליטר של 1x PBS בארבע מעלות צלזיוס לכל לשטוף. לסובב את גלולה שטף ב 600 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. תן שימוש חוזר את גלולה ב30 מיליליטר של 1x PBS.לאחר מכן, לאט לטעון את ההשעיה על כרית 20 מיליליטר של 25% סוכרוז, ללא ערבוב. סובב במהירות של פי 600 גר' ו-4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להסיר את כל הדגלה שנותרה ולהפיץ את התאים בסופרוס. באמצעות שאפה, בזהירות שאף את supernatant שמירה רק התחתון ביותר 20 מיליליטר.לשטוף את סוכרוז הנותרים על ידי הוספת 20 מיליליטר של קר 1x PBS. צנטריפוגה ב 600 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. תן מחדש את גלולה ב 10 מיליליטר של 1x PBS בארבע מעלות צלזיוס, לוודא כי אין גושים בפתרון.מעבירים את גלולת resuspended לבקבוק חדש 250 מיליליטר, מוסיפים את מאגר תיזה, בתוספת 5, 000 יחידות של DNase, לבקבוק המכיל את התאים. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת, תוך ערבוב כל 15 דקות על ידי היפוך זהיר של הבקבוק. מעבירים את התאים lysed לצינור חרוט 50 מיליליטר וצנטריפוגה ב 600 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.באמצעות פיפטה, לאסוף את supernatant ולהעמיס אותו לתוך צינור עגול תחתון 30 מיליליטר על קרח המכיל שני מיליליטר של כרית סוכרוז 60%. צנטריפוגה זה ב 10, 000 פעמים g במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שאף את העל-טבעי עד למיליליטר אחד מעל כרית סוכרוז.שים לב לממשק הצהוב בין המיליליטר היחיד של העל-טבעי שנותר, לבין שני המיליליטרים של כרית סוכרוז. בעזרת קצה P1000 חתוך, מערבבים בעדינות את העל-טבעי הנותר עם הסוכרוז. בריכה כל כריות סוכרוז ולאחסן אותם על קרח.לאחר מכן, הכינו שיפוע של 40%-70% סוכרוז בצינור פוליפרופילן דק-קירות של 38.5 מיליליטר כמפורט בפרוטוקול הטקסט. טען באיטיות את הממשקים המאגרים לתוך מעבר הצבע. לאזן את הצינורות עם חיץ K-PIPES 10 מילימולאר, וצנטריפוגה ב 68, 320 פעמים g וארבע מעלות צלזיוס במשך 75 דקות.לאחר מכן, השתמש במחט 0.8 מילימטר כדי להפוך חור בתחתית הצינור, הקפדה לא להפריע שכבות סוכרוז שונות. השתמש בחור זה כדי לאסוף 12 500 שברי מיקרוליטר בארבע מעלות צלזיוס. בעזרת קצה P200 חתוך, הכינו 10 מיליליטר נוספים מכל שבר שישמש במהלך הכשל החיסוני.לאחר מכן, להקפיא את השברים בחנקן נוזלי. כדי להתחיל, מניחים כיסוי סטרילי של 12 מילימטרים על הקצה התחתון שקוע של הקונצנטרי, הקפד לשמור על הצד מצופה PDL למטה. מניחים את המתאם ישירות על גבי, כדי לכסות את כיסוי.לאחר מכן, הפוך את הצינור התחתון העגול והצב אותו מעל הקונצנטרי, הכיסוי והמתאם. באמצעות פינצטה, בעדינות לדחוף את ההרכב עד שהוא מגיע לתחתית הצינור, ולאחר מכן להפוך את הצינור. הוסף 10 מילימולר של מאגר K-PIPES עד שהוא מגיע לראש הקונצנטרי.ודא כי אין בועות בצילינדר המרכזי של הקונצנטרי. הוסיפו בעדינות 100 מיקרוליטרים של חיץ K-PIPES 10 מילימולרי לאחד האליקוטים של שבר המרכז המועשר ומערבבים ביסודיות באמצעות פיפטה P200. לאחר מכן, הסר 100 מיקרוליטרים של מאגר K-PIPES מהמרכז החלול של הקונצנטרי, והוסף 100 מיקרוליטרים של תערובת שברי המאגר, וודא שהתוכן נשאר במרכז החלול של הקונצנטרי.מסתובבים ב 10, 000 פעמים גרם במשך 10 דקות בצנטריפוגה כי הוא מקורר מראש לארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, השתמש פינצטה כדי להסיר את הקונצנטרי. הכנס מכשיר מחובר בעבודת יד לתוך החור הנוכחי בקצה מחורר של המתאם ולהרים בעדינות כדי לשחזר את המכסה.ברגע שהוא מגיע לראש הצינור, להשתמש באצבע כפפה כדי ללכוד את קצה המתאם ולהשתמש פינצטה כדי להסיר את כיסוי, להיות מודע איזה צד של coverslip מכיל centrioles. לאחר מכן, לבצע קיבעון וכתמים immunofluorescence של centrioles מרוכז. כדי להתחיל, דגירה של כיסויים עם centrioles בתיבת מעבדת העברת פוליסטירן גביש מוכן מלא 100% מתנול במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.בעזרת פינצטה, מעבירים את הכיסויים לקופסת מעבדה שקופה מלאה ב-50 מיליליטר של 1x PBS. תן לשקופיות לשטוף ב- PBS במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, פיפטה 60 מיקרוליטרים של תערובת נוגדנים ראשונית על פיסת איטום מעבדה לעטוף בתא לח.בזהירות להניח את כיסויים על גבי תערובת הנוגדנים עם centrioles ישירות מול הירידה. תן לכיסויים דגירה במשך 45 דקות. לאחר מכן, להסיר את coverslips ולשטוף אותם בקופסה המכילה PBS במשך חמש דקות.הדגירה של הכיסויים השטופים למשך 45 דקות, עם נוגדנים משניים ב-PBS 1%BSA ו-0.05%Tween-20. מוציאים את הכיסויים ושוטפים אותם במשך חמש דקות בקופסה המכילה PBS. באמצעות מדיום הרכבה רגיל נגד דהיה, הרכבה של המכסה על שקופית.לאחר מכן, דמיין את המרכזים המבודדים על מיקרוסקופ קונפוקל ביעד שמן 63X עם N.A.of 1.4, תוך החלת deconvolution. הגדר את המיקום העליון והתחתון של מחסנית Z מעל ומתחת לאות centriole, בהתאמה, ולרכוש ערימה גדולה של תמונות הכולל אות centriole. הקרן את המחסנית ובצע ממוצע של חלקיק יחיד כמפורט בפרוטוקול הטקסט.כשל חיסוני מייצג מגלה כי שישה שברים מועשרים עבור centrioles מבודדים, עם שיא עבור שבר מספר שלוש, בעוד שני החלקים האחרונים אינם, המציין כי הטיהור הוא מוצלח. רק כ-30 סנטריולים נראים לכל שדה מבט ללא הרכז, בעוד 183 נראים עם הרכז. זה מוכיח כי צעד הרכז הוא מוצלח, ומאפשר העשרה של פי שישה של centrioles באזור מוגדר, מה שהופך אותו קל יותר לזהות ולדמיין אותם.מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר משמשת לאחר מכן לתמונה centrioles מוכתמים עבור טובולין monoglutamylated, תוכנה משמשת כדי ליצור ממוצע כמעט מושלם עבור כל אוריינטציה שנבחרה. לאחר חמש איטראציות, שתי מחלקות של ממוצעים נוצרו של centrioles monoglutamylated:מבט עליון מ 63 אובייקטים ותצוגה צדדית מ 98 חלקיקים. אורך הממוצע של המחלקה בצד התצוגה הוא 260 ננומטר עם קוטר של 250 ננומטר, דומה לאות טובולין monoglutamylated נמדד כי הוא ראה לוקליזציה בתוך הליבה של centriole.בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור לשמור את המרכז המבודד על הקרח ולהקפיא אותם לאחר הבידוד. בעקבות הליך זה, שיטה אחרת, כמו מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים וספקטרומטריית מסה יכולה להתבצע על מנת לענות על שאלה נוספת, כגון הארכיטקטורה המקורית של centriole או הרכב חלבון centriole.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

הזדווגות והפרדה של הטטרדה Chlamydomonas reinhardtii עבור ניתוח גנטי

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

נורמליזציה נולד עבור טומוגרפיה Fluorescence הקרנה אופטית עבור הדמיה בלב שלם

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

זמן לשגות הדמיה של מיטוזה לאחר transfection siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

חלקיק יחיד מיקרוסקופית אלקטרונים שיקום במתחם Exosome שימוש בשיטה אקראיים הטיה חרוטי

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis ו המיקרומניפולציה עבור דימות פלואורסצנטי Intravital של microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

ראפיד ניתוח וחקירה של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...