Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
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우리 콜 Polytechnique 연방 공과대 학교 드 로잔 (EPFL), 로잔, 스위스, SIM 이미지는 centrioles의 인수 했다에서 피에르 Gönczy BioImaging & 광학 플랫폼 (BIOP) 감사 합니다. 니콜라이 Klena 및 Davide Gambarotto는 유럽 연구 회의 (ERC) 시작 그랜트 (StG) 715289 (악센트) 및 Maeva 르 Guennec, 폴 Guichard, 스위스 국립 과학 재단 (SNSF) PP00P3_157517에 의해 버 지 니 하멜에 의해 지원 됩니다. 수잔 논문집 제네바의 대학에 의해 지원 됩니다.

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저자는 공개 없다.

생물학에서 과제 중 하나는 건축 문맥에 있는 단백질의 정확한 지 방화를 해독 것입니다. 중심소체는 이러한 방법을 적용 하는 이상적인 구조 그것의 길이 따라 재미 있는 ultrastructural 기능을 공개 하는 cryo 전자 단층 촬영을 사용 하 여 그것의 건축 공부 하고있다. 그러나,으로 광학 현미경의 해상도 제한 가까이, 그것은 정확 하 게 사용 하 여 기존의 현미경30중심소체의 구조 하위 영역에 면역 형광 검사 하 여 단백질을 지역화 어렵다.
광학 현미경의 해상도 제공, 대략 200의 측면 최대 해상도 빛의 회절에 의해 제한 된다 광학 현미경24nm. 그러나,이 제한 되었습니다 지난 20 년의 중요 한 돌파구 중 하나에 의해 우회할 광학 현미경: 최고 해결책 방법의 발명. 이러한 접근은 다른 해상도에서 회절 한계를 넘어 이미지 수: 120 SIM에 대 한, 약 50 nm에 자극된 방출 소모 (호텔 위치), 및 20-40 nm 단일 분자 지 방화 현미경 검사 법 (SMLM)24. 이러한 새로운 발전과 함께 슈퍼 해상도 현미경의,는 중심소체의 구조 하위 영역 달성 가능 하다. 그러나, 실제로, 그것은 아직 정확 하 게 성숙한 centrioles 셀 당 2만 부에 존재 하 고 무작위 방향, 해석 하 게 하는 주요 이유로 구조적 요소에 단백질의 지역화가 결정 하기 어려운 지역화 어려운입니다. 이러한 이유로, 프로토콜 설정 했다 연구자 centrioles, 비-모호한 방향 관찰 기회 증가 수가 많은 슈퍼 해상도로 이미지를 수 있도록. 중요 한 것은,이 방법은 절연된 centrioles의 사용에 의존, 우리 제공 하는 그대로 C. reinhardtii 를 정화 하는 방법을 centrioles 성숙한 centrioles 및 procentrioles를 포함 하는.
마지막으로,이 프로토콜 군데 수 중심소체 방향 범위 때문에 단일 입자 분석 적용할 수 있는 전자 현미경 소프트웨어를 사용 하 여. Centrioles 특정 방향에서의 평균 클래스의 생성 결과. 중요 한 것은, 이러한 결과 2 차원 이미지 다음는 중심소체 따라 특정 단백질의 지 방화를 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다. 실제로,이 방법은 듀얼 컬러 슈퍼 고해상도 이미지에 적용할 수 있습니다 그리고 다른 색상 동안 중심소체 해골 (예를 들어, tubulin), 특정 centriolar 단백질에 표시 될 수 있습니다 공개를 한 색상을 사용할 수 있습니다. 한 가지 색 또는 두 가지 색상으로 얻은 평균을 빼서 중심소체 (근 위, 중앙, 또는 말 초)에 따라 단백질을 등록 하기 쉽게 된다. 참고 두 개의 채널 정확 하 게 어떤 잘못 된 해석을 방지 하기 위해 정렬 되어야 한다. 또한, 최고 전망의 평균 단백질 centriolar 루멘, microtubule 벽을 따라 나는 중심소체 외부 내부 localizes 경우 해독 도움이 됩니다.
이 메서드는 다른 유형의 라벨 때문에 그렇지 않으면 지역화 어려울 수 있는 특정 단백질의 지역화를 확인 장점이 있습니다. 참고는 다른 방법으로는 centrioles 내 단백질을 지도 하는에서 기술 되었다 상호 3 차원 시뮬레이션/SMLM, 예를 들어,는 centrioles의 특정 방향 주위 원환을 형성 하는 마커의 타원형 프로 파일을 확인 하 여 평가 중심소체 시뮬레이션 영상에 의해입니다. 이 매개 변수를 사용 하 여 4-5 nm30의 정밀도 가진 단백질을 지역화 가능 하다. Note는 또한 설명 하는 방법을 여기에서는 격리 centrioles 그대로 procentrioles, 중심소체 아키텍처는 가장 가능성이 크게 보존 하는 서명으로. 그러나, 몇몇 건축 기능은 중심소체 직경으로 인간의 centrosome5의 절연 증폭 divalent 양이온의 농도 변화 등 정화 하는 동안 방해를 배제 수 없습니다 합니다.
여기에 제시 된 프로토콜의 중요 한 단계 중 하나는 충분히 집중된 격리 centrioles Fluo-스파 의무가 다른 방향에서 얻을 것입니다. 이렇게 하려면 먼저 확인 순도 중심소체 격리 절차의 효율성. 절연된 centrioles의 낮은 농도 적절 한 이미지와 이미지 처리 되지 것입니다. 이 위해 우리 centrioles 시야 당 수를 풍부 하 게 하는 방법을 제공 하는. 사용 분수에서 centrioles의 수에 따라 집중 장치에 로드 볼륨 조정 되어야 한다, 250 µ L의 최대 볼륨.
중요 한 것은,이 방법은 cw15 C. reinhardtii 세포-세포 벽에 대 한 개발 되었습니다. 이 긴장에서 세포 벽의 취약성은 적절 한 세포 세포의 용 해 및, 따라서, 그 내용의 해방에 대 한 수 있습니다. 이 프로토콜은 야생-타입 C. reinhardtii 에 대 한 효율적인 세포, 세포 벽 방지 적절 한 세포의 용 해로. 쥡니다 또는 autolysin, 세포 벽31을 저하 시킬 수 있는 효소와 세포의 사전 인큐베이션 등 대체 전략 여기 격리 프로토콜을 적용 하기 전에 셀 벽을 변경 하는 장소에 넣어야 할 것입니다.
이 설치는 기존의 confocal 현미경에서 높은 처리량 전용 슈퍼 해상도 현미경에 이르기까지, 현미경의 종류와 함께 사용할 수 있습니다. SMLM 하 고, 특별 한 버퍼는 필요 적절 한 영상 그리고, 따라서, 12mm coverslip는 coverslip 위에 버퍼에 대 한 적응 챔버를 사용 한다. 다음 이미지는 거꾸로 현미경으로 수행 됩니다. 현미경 설정 12 mm coverslip 허용 하지 않으면, 여기에 제시 된 프로토콜에 18 m m coverslips 30 mL 라운드-하단 튜브 및 수정 된 어댑터와 집중 장치를 사용 하 여 적용할 수 있습니다. 그것은 또한 고정 하는 방법으로 주 SMLM에 있는 마지막 개조의 품질은 얼룩의 사용, 기본 항 체의 질에 따라 달라 집니다 중요 하다.
요약 하자면, Fluo-스파 다른 방향에서 centrioles의 평균을 생성 하는 따라서 돕는 정밀 centriolar 단백질을 지역화 하 여 수많은 centrioles 따라 이미지에 적용할 수 있는 메서드를 제공 하는 우리. 중요 한 것은,이 방법을 적용할 수 있습니다 일반적으로 다른 종에서 격리 centrioles, 다른 세포 또는 큰 고분자 어셈블리. 마지막으로, 샘플 준비 방법 여기에 제시, 결합 형광 SMLM 데이터32의 단일 입자 분석 최근 알고리즘 개발, 고분자의 큰 분자 제작에서 개선 더 열 수 있습니다. 어셈블리입니다.

중심소체는 진화론 보존된 세포 기관이 centrosome 동물 세포에서의 핵심에 놓여 있다 고 템플릿 속눈썹 또는 많은 진핵생물1,2flagella (라고도 centrioles이) 기초 본문으로 작동할 수 있다 이다. 이와 같이, centrioles가 근본적인 세포 생물학 프로세스 신호 세포를 스핀 들 어셈블리에서 배열 합니다. 따라서, 중심소체 어셈블리 또는 기능에 결함이 ciliopathies 및 암3를 포함 하 여 여러 가지 인간 병 리와 관련 되어 있다.
Centrioles는 무굴, 대칭, microtubule triplet 기반 원통형 구조는, 일반적으로, ~ 450 nm 긴 고 ~ 250 nm 넓은4,5,,67. 기존의 전자 현미경 및 다른 종에서 centrioles의 cryo 전자 단층 촬영 세 가지 별개의 영역으로 그들의 긴 축을 따라 centrioles 편광은 계시 했다: 인접 지역, 중앙 코어 및 원심 지역5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. 중요 한 것은, 각각이 지역 특정 구조 특징을 나타냅니다. 첫째, 100 nm-긴 인접 지역의 루멘 머 저리 요소12microtubule 세 개에 연결 하는 수레 바퀴 구조를 포함 합니다. 둘째, 300-400 nm-긴 중부 지역 섬유 밀도 microtubules의 내부 얼굴에 따라 루멘 및 구조적 특징에 포함: Y 자 모양의 링커, C 관 꼬리 그리고 A 관9스텁. 마지막으로, 50-100 nm 원심 지역 중심소체5,13의 원심 부분을 둘러싸고 있는 하위 원심 및 원심 부속을 전시 한다.
지난 2 년간 중심소체14,,1516, 의 부분이 되 고 약 100 가지 단백질의 현재 추정에 지도 하는 centriolar 단백질의 증가 수의 발견에 의해 표시 된 17. 이러한 진보에도 불구 하 고는 중심소체 내이 단백질의 정확한 지 방화 구조 하위 영역에서 특히 애매 남아. 중요 한 것은, 정확 하 게 지역화는 중심소체의 구조 지역에 할당 그들의 기능에 대 한 더 나은 이해 결정적 이다. 이 점에서 C. reinhardtii centrioles 수단이 두 측면에서 첫 번째 delimitating 실린더9,,1819, 다음 허용 되는 따라 다른 구조상 특징에 의해 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 하위 구조 영역 단백질의 부분 집합의 지역화를 연결할 연구원. 예를 들어 Bld12p 및 Bld10p, 지역화 인접 지역에 수레 바퀴 구조에 특히 단백질20,21,,2223포함 됩니다. 지역화 하는 구조 단백질의 목록에는 또한 POB15 및 POC16, C. reinhardtii centrioles17의 내부 핵심 영역을 장식 하는 질량 분석에 의해 확인 된 두 개의 소설 단백질 포함 됩니다.
이 문서에서는 격리 하 고 후속 슈퍼 해상도 현미경 및 단일 입자 평균에 대 한 C. reinhardtii centrioles 이미지 개발 방법의 완전 한 설명 합니다. 이 위해 기술 한계 극복 될 필요가 있는 윤곽을 그리 다 중요 하다. 첫째, 중심소체 정화 절연9의 다양 한 단계 동안 자주 손실 되 고 수레 바퀴 구조와 전반적인 아키텍처를 달라질 수 있습니다. 둘째, 크기는 중심소체의 광학 현미경에서 회절 한계에 가까운 매우는입니다. 실제로, confocal 현미경 검사 법에서 얻을 수 있는 수평 해상도 약 200 nm24는 중심소체와 z에 해상도의 직경 비슷합니다-축에 대 한이 2-3 배 낮은, 이방성 볼륨에 선도. 셋째, 항 체 라벨 및 중심소체 오리엔테이션의이 특정 centriolar 하위 영역에 단백질을 지역화 하는 데 필요한 해석을 제한 수 있습니다. 마지막으로, centrioles 어려운 이미지의 많은 수를 확보 하 고 명확한 중심소체 방향을 찾을 수 셀당 두 복사본에 존재 한다. 이러한 기술적인 문제를 회피, 우리 격리 centrioles 다양 한 오리 엔 테이 션을 채택 하는의 큰 숫자에 적용 하는 슈퍼 해상도 현미경에 사용 하는 방법 개발 했다. 우리는 먼저 구조적으로 그대로 centrioles 및 procentrioles 포함 하는 수레 바퀴의 정화를 가능 하 게 하는 C. reinhardtii centrioles 정화 프로토콜을 설명 합니다. 다음, 우리는 centrioles 재래식으로 이미징 또는 슈퍼 해상도 형광 현미경에 대 한 coverslips에 집중 하는 단계별 프로토콜을 설명 합니다. 이 중요 한 단계 centrioles 여러 방향에서 몇 군데의 수를 증가 수 있습니다. 마지막으로, 우리는 단일 입자 평균 centrioles 다른 방향에서의 검출 하는 형광 현미경에 수집 된 데이터에 수행 하는 절차를 설명 합니다. 모두, 다양 한 종 또는 다른 큰 고분자 어셈블리에서 이미지 centrioles에이 메서드를 적용할 수 있습니다.

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	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioles 큰 고분자 어셈블리 세포 분열, 세포 운동 성, 또는 셀 신호 같은 기본적인 세포 생물학 과정의 적절 한 실행에 대 한 중요 한 있습니다. 녹색 조류 Chlamydomonas reinhardtii 중심소체 건축, 기능, 및 단백질 구성의 연구에서 통찰력 모델을 입증 했다. 이해 centriolar 건축으로 큰 발전에도 불구 하 고 현재 과제 중 하나는 더에서 그들의 역할을 이해 하기 위해서는 정확한 국산화는 중심소체의 구조 영역에서 centriolar 구성 요소를 결정 하는 중심소체 속입니다. 주요 제한은이 세포 기관이 회절 한계에 가까운 크기에 단백질 지 방화의 해석을 복잡 형광 현미경의 해상도에 놓여 있습니다. 이 문제를 해결 하기 위해 우리가 정화 및 슈퍼 해상도 현미경을 사용 하 여 다른 방향으로 C. reinhardtii centrioles의 많은 수를 이미지 하는 방법을 제공 하는. 이 기술을 형광 단일 입자 centrioles 취득의 많은 수 때문에 (Fluo-스파) 평균을 통해 데이터의 추가 처리를 허용 한다. Fluo-스파의 평균 생성 따라서 centriolar 하위 영역에 있는 다른 단백질의 지 방화를 촉진 하는 다른 방향에서 C. reinhardtii centrioles 스테인드. 중요 한 것은, 다른 종 또는 다른 큰 고분자 어셈블리에서 이미지 centrioles에이 메서드를 적용할 수 있습니다.

C. reinhardtii 중심소체 격리: Centrioles, cw15- C. reinhardtii 세포 했다 빛 아래에서 몇 일 동안 액체 문화에서 자란 고 씻 겨 PBS 가진 1 x 10 분 Pelleted 세포에 대 한 600 x g 에서 원심 분리에 의해 연속적으로 수송과에서 resuspended 하 고는 버퍼 전에 2 분(그림 1)4.5-4.7의 최종 pH 0.5 M 초 산을 사용 하 여 pH 쇼크를 수행 하 여 deflagellation deflagellation 1 N 코의 pH 7.0 복원 사용 되었다. 셀 시체에서 분리 flagella를 분리, deflagellated 세포는 flagella의 일괄 제거 하 centrifuged 처음 했다. 펠 릿 다음 PBS 가진 2 x 세차 고 천천히 25% 자당 쿠션 (그림 1B)에 그것을 로드 하기 전에 30 ml PBS의 resuspended. 튜브는 분리 flagella의 대부분을 제거 하 4 ° C에서 15 분 동안 600 x g 에서 회전 된다. 원심, 후 셀 시체 자당 쿠션 (그림 1C)에 확산 되었고 제거 되는 ( 그림 1C에서 빨간색 화살표)까지 상쾌한의 약 30 mL. 씻어 셀의 결과 20 mL 차가운 PBS의 20 mL에 resuspended 그리고 10 분 600 x g 에서 centrifuged 했다. 다음으로 상쾌한 했다 무시 하 고 셀 10 mL PBS에에서 resuspended 완전히 했다. 셀 250 mL 병에 전송 하 고 세포의 용 해 버퍼 resuspended 셀에 한 번에 추가 되었습니다. DNase는 세포에 추가 되었고 1 h 4 ° c.에 대 한 인 큐베이 팅 세포 파편을 제거 하는 원심 분리 단계 후 (참조 그림 1D화이트 펠 릿)는 상쾌한 수집 되었고 2 mL 60% 자당 쿠션 4 ° c.에 30 분 10000 x g 에서 원심 분리 이전에 신중 하 게 로드 유의 세포의 100 ml, 15 mL의 8 관 세포의 용 해 버퍼 튜브 당 자당의 2 mL에 로드의 12.5 mL에 해당 하는이 단계를 수행 하는 데 사용 했다. 원심, 후는 상쾌한의 대부분 제거 된 쿠션 위에 최대 1 mL. 나머지 상쾌한의 1 mL 다음 2 mL 쿠션으로 수집 하 고 혼합 되었고 24 mL의 최종 볼륨을 얻기 위해 풀링. 수영장에는 40 로드 다음 %-50%, 70% 자당 그라데이션 및 68,320 x g 1 h 15 분에 4 ° c.에 냈 지 마지막으로 격리 된 centrioles 바늘을 사용 하 여 원심 분리 관의 아래 부분에 구멍을 만들어 수집 했다 고 방울 12 x 500 µ L 분수에서 수집 된. 다른 자당의 높은 밀도 인해 드롭에서 형성 된 아주 느리게 시작 (70% 자당) 그리고 더 빠르게 (40% 자당).
격리 된 Centrioles의 면역 형광 검사 격리 절차의 품질을 평가 하기 위해 각 수집 된 그라데이션 분수의 10 µ L 다음에 coverslip coverslip 지원 어댑터 (그림 2A-2D)를 사용 하 여 centrifuged 했다. 중요 한 것은,는 coverslip를 안전 하 게 제거 하려면 사용자 지정 구부려 진된 장치 설계 되었다 (그림 2B). 다음으로 coverslips 면역 형광에 의해 분석 되었다. CrSAS-6(Bld12p)에 대 한 항 체는 수레 바퀴 구조와 α-tubulin centriolar 벽을 강조 하기 위해 (DMA1)의 존재를 나타내는 데이 연구에 사용 되었다. CrSAS-6와 α-tubulin 시야 당에 대 한 긍정적인 했다 centrioles의 수를 계산 하 고 분수 당 centrioles의 총 수를 계산 하는 다음, 그것은 어떤 분수 절연된 centrioles ( 에 대 한 풍부한 했다 확인할 수 그림 2 층-2 H). 흥미롭게도, 6 분수 했다 농축 centrioles (그림 2F , 2g, 분수 #1-6)에 대 한 분수 # 3에 대 한 피크와 마지막 분수 아니었다, 정화 되었음을 나타내는 동안. Note이 특정 실험에서 총 centrioles의 95 %CrSAS-6 그리고 α-tubulin 분수 # 3에에서 대 한 긍정적인가 했다. 이 가장 고립 된 centrioles 그들의 재주 넘기 유지 나타냅니다. 없는 농축 centrioles의 첫 번째 부분에서 관찰 되는 경우 격리 프로시저 작동 하지 않았다 고 반복 해야 합니다. 참고 일부 flagellar 조각 centrioles 없는 분수에서 주로 관찰 될 수 있다.
다음, centrioles µ L 당의 총 수를 계산 하려면 시야 당 중심소체의 수는 비율으로 그림 2H에 의해 증식 한다. 결과 수 해야 다음에 면역 형광 centrioles µ L 당 수를 사용 하는 분수의 볼륨으로 나눌 수 있습니다. 이 특정 격리 절차에서 가장 풍부한 분수 (92 x 92 µ m2의 필드의 보기)와 0.00846 m m2 의 면적에 약 37 centrioles 포함. 튜브 부분의 표면 반경 176 m m2의 총 표면에 7.5 m m 이었다. 해당 비율 이었다 다음 176/0.00846 = 20,803.8, 그래서 10 µ L에서 769,740 centrioles (37 x 20, 803.8)의 총. 따라서, 1 µ L에 centrioles 수 76,974 했다.
Coverslips에 고립 된 Centrioles의 농도: Centrioles 필드의 수를 늘리면 더 입자 평균 절차에 대 한 사용할 수 있는 비슷한 방향 검출의 기회를 증가 뿐만 아니라 명확한 중심소체 방향 탐지의 가능성이 높아집니다. 집중된 분수에서 centrioles는 여전히는 coverslip에 스파스, 우리 원심 액세서리를 coverslip (그림 3A) 집중 장치 라는 중간 centrioles 집중 개발 했다. 3 차원 인쇄에 대 한 정확한 조치.stl 파일이이 원고와 함께 제공 되는 참고.
첫째, 12 m m의 한 coverslip 집중 장치 (그림 3B)에 탑재 했다. 라운드-하단 튜브 거꾸로 되었고 조립된 어댑터 및 집중 배치와 어댑터는 coverslip 위에 배치 되었다. 라운드-하단 튜브는 다음 부드럽게 반전, 샘플 (프로토콜 단계 4.2)의 로드 되므로. centrioles 했다 다음 4 ° c.에서 10 분 동안 10000 x g 에서 centrifuged 그 후,는 centrioles 면역 형광 검사를 받게 되었고 CrSAS-6/Bld12p 및 α-tubulin (그림 3C-3E) 스테인드. 중요 한 것은, 집중 장치, 없이 약 30 centrioles 보였다 시야그림 3(C), 당 때 집중 장치 사용된 (그림 3D-3 층) 183 centrioles 시야 당 보인 반면. 참고는 centrioles는 coverslip 한가운데 직경에서 4 mm의 디스크에만 적용 합니다. 이 결과 농도 단계 작동 하 고 coverslips, 따라서 그들의 탐지를 완화 하 고 이미지의 정의 된 영역에서 centrioles의 6-fold 농축 수를 보여 줍니다.
형광 단일 입자 평균 절연 C. reinhardtii Centrioles: 약 120의 해상도 도달할 수 있는 SIM 현미경을 사용 하 여 여기, nm, monoglutamylated tubulin (GT335, 그림 4), centriolar microtubules에 tubulin 수정에 대 한 스테인드 centrioles 군데24했다. C. reinhardtii centrioles는 약 500 nm, 쌍에서 항상 길고 자주 발견과 관련, 새로 복제 probasal 시체 (라고 하 procentrioles이 하) 및 microtubule 관련 섬유19전기. 따라서,이 최종 조립 큰 약 1 µ m 이었다. 이러한 이유로, 그리고 전체에서 centrioles 이미지 순서, Z-스택 격리 centrioles에 취득 하는 것이 좋습니다.
여기, 인수, 후 최종 이미지 ImageJ28 (이미지/스택/Z 프로젝트/최대 강도 프로젝션, 그림 4B)를 사용 하 여 최대 강도 투영을 수행 하 여 생성 되었습니다. 이러한 이미지에서 cryo 전자 현미경 검사 법 소프트웨어를 사용 하 여 단일 입자 분석 centrioles 유사한 방향으로의 클래스를 만들기 위해 수행 하 고 수행한 다음 평균. 이렇게 하려면, 이미지 컬러는 처음 더 나은 시각화 개체 (그림 4C) 위하여 반전 됩니다. Centrioles 가운데 자유롭게 사용할 수 있는 Scipion 소프트웨어29 을 통합 하는 Xmipp3 등 여러 전자 현미경 소프트웨어 프로그램을 사용 하 여 각 입자에는 상자에 수동으로 선택 했다 (그림 4D). 상자의 크기는 사용자에 의해 정의 되어야 하는 참고. 여기, 50 x 50 픽셀 31.84의 픽셀 크기의 상자 nm 사용 되었다. 다음으로, 모든 입자 했다 (그림 4E)을 추출 하 고 Xmipp3를 사용 하 여 정렬 (그림 4F). 다음, 12 픽셀 반경에 원형 마스크 centriolar-쌍 (그림 4G)에서 각 중심소체 분리에 적용 되었습니다. 입자 다음, 여러 평균을 생성 하는 Xmipp3를 사용 하 여 분류 되었다. 단지 동종 클래스 평균 유지 했다, 클래스 평균에서 갈리는 입자 수동으로 제외 된 의미. 이 단계는 선택한 한 완벽에 가까운 평균을 생성 하기 위해 반복 되었다. 평균 두 클래스 생성 된 5 개의 반복 후: 63 개체 (그림 4H)에서 상위 뷰와 측면 monoglutamylated centrioles의 (그림 4나) 98 입자에서 볼. 개체의 크기는 monoglutamylation 신호에 따라 강도 플롯 프로필의 봉우리 사이의 거리를 측정 하 여 결정 했다.
중요 한 것은,의 사이드 뷰 클래스 평균 길이가 260 nm 직경 250 nm, 지역화 중심소체17의 핵심 내 길이 286 ± 33 nm의 영역을 표시 했다 측정된 monoglutamylated tubulin 신호에 비해.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> 그림 1 : 정화 C. reinhardtii centrioles. (A) 이것은 C. reinhardtii centrioles의 격리로 이어지는 각 단계에 대 한 도식 표현 이다. 그것은 25% 자당 기온 변화도에 원심 분리 후 전에 프로토콜 (B)와 (C)의 대표적인 단계를 포함합니다. 패널 C 에 빨간색 화살표는 원심 분리 후 계속 최소 볼륨을 나타냅니다. (D)이이 패널 원심 분리 후 lysed 세포의 흰색 펠 릿을 보여줍니다. 검은색 화살표는 펠 릿을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> 그림 2 : 원심 분리 설정에 면역 형광 검사를 수행 하기 위해 절연 centrioles. 각 수집 된 분수의 (A) 10 µ L를 먼저 희석 하 여 100 µ L 10 m m K-파이프 (pH 7.2)에서. (B) 15 mL 라운드-하단 튜브, 12 m m coverslip coverslip, 대 한 어댑터를 포함 하는 원심 분리 장치 및 원심 분리 후에 coverslip 복구 주문 품 구부려 진된 장치 도식 표현입니다. 패널 C 와 D 는 coverslip 원심 분리 후 복구 하는 방법을 설명 하는 그림을 표시 합니다. (C) 장소는 어댑터의 슬롯된 가장자리에 있는 구멍에 구부려 진된 도구와 (D) 부드럽게 당겨. (E) 이러한 면역 형광 이미징 수행 하는 데 필요한 습기 챔버의 사진입니다. 화살표는 12mm coverslip을 나타냅니다. (F) 이들은 63 X (2 줌) 그라데이션 분수 #1-8, 정화 절차 동안 수집된의 대표적인 confocal 이미지와 CrSAS-6 (레드)와 α-tubulin (녹색)에 대 한 스테인드. 인세트 낮은 확대 보기에서 흰색 상자로 표시 된 영역에 해당 합니다. 눈금 막대 = 10 µ m. (G) CrSAS-6 및 각 분수에 시야 당 α-tubulin centrioles 긍정적인의 수를 나타내는 그래프입니다. 분수 #1-6에서 농축 note Centrioles 필드 각 분수에서의 평균 수: #1 16.3 ± 4.7 #2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37.0 ± 17.0, #4 = 23.3 ± 11.4, #5 = 14.3 ± 2.1, #6 = 13.7 ± 9.3, #7 = 2.7 ± 1.2, #8 = 1.0 ± 0.0, #9 = 1.0 ± 0.0, #10 = 0.0 ± 0.0, # 11를 = 0.3 ± 0.6, #12 = = 0.0 ± 0.0. 각 부분에 대 한 3 임의의 필드 몇 군데 있었다. 가장 풍부한 분수 #3 세, 우리 발견은 centrioles의 95%는 CrSAS-6 및 α-tubulin 긍정적인 참고 (n = 205 centrioles). (H) A centrioles는 현미경의 측정된 영역에 존재의 수의 비율 centrioles 튜브의 영역에 존재의 총 수를 계산 하는 데 사용 됩니다. 중심소체 수 µ L 당 10 µ L 원래 centrifuged 분수에서 계산할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> 그림 3 : 절연된 centrioles 집중 장치를 사용 하 여 centrifuged는. (A)이이 패널 centrioles 면역 형광 검사, 등 15 mL 라운드-하단 튜브, 집중 장치, 12 mm coverslip 지원 어댑터 장치 이전 coverslips에 집중 하는 데 필요한 원심 분리 장치를 보여 줍니다. (B)이이 패널 원심 분리 장치를 조립 하는 단계를 보여 줍니다. 패널 C-E CrSAS-6 (레드)와 α-tubulin (그린) (C) 없이 또는 (D-E)에 대 한 집중 장치 물 centrioles의 공초점 이미지를 표시 합니다. 인세트 낮은 확대 보기에서 흰색 상자로 표시 된 영역에 해당 합니다. 눈금 막대는 10 µ m. 노트 centrioles 풍성 하 게 (점선 나타냅니다 집중 영역의 테두리) coverslip 중간 (F)이이 그래프 보기의 필드와 집중 장치 없이 당 centrioles의 수를 나타냅니다. 5 무작위 분야의 보기는 분석 했다. Centrioles의 평균 수는, 집중, 집중, 29.8 ± 2.9, 없이 182.6 ± 11.5, P < 0.0001. 통계적 의미는 짝이 없는 t에 의해 평가 되었다-테스트. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> 그림 4 : 단일 입자에 고립 된 평균 C. reinhardtii centrioles. (A)이이 패널 centrioles GT335로 얼룩진 고 SIM 현미경을 사용 하 여 인수의 스택 이미지를 보여주는 Z. (B) 이러한 패널 스택된 이미지의 최대 강도 Z 투영 표시. 눈금 막대 = 1 µ m. (C)이 패널 표시 대표 이미지는 거꾸로 대조. 삽입 더 나은 centrioles 시각화를 줌에 나타냅니다. (D)이 패널 표시 입자 따기. 삽입 된 입자 했다 선택 하는 방법을 나타냅니다. (E) 이들은 5 추출의 예 입자. (F)이이 패널 정렬 후 입자를 보여줍니다. (G)이이 패널 마스크를 적용 한 후 입자를 보여줍니다. 패널 H 와 나 두 클래스 평균을 표시: (H)는 상단 보기 (63 입자)와 (나) 측면 보기 (98 입자). 이중 화살표는 GT335 신호 크기를 나타냅니다. 눈금 막대 = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
보조 파일 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 파일 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

절연 및 Chlamydomonas Centrioles의 단일 입자 재건을 위한 형광 이미징

우리 정화 하 여 슈퍼 해상도 현미경 및 단일 입자 평균에 대 한 의무가 다른 방향에서 centrioles 많은 이미지 전략을 개발 했습니다.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

이 방법은 센티미터의 특정 영역에 단백질을 국소화와 같은 중심 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 우리가 여러 방향으로 그들을 얻기 위해 센티미터를 집중하는 수단을 제공합니다. 이 방법은 클라미도모나스 중심 생물학에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 그것은 또한 고립 된 인간과 파라메슘 중심과 같은 다른 시스템에 적용 될 수있다.절차를 시연하는 것은 박사 과정 학생 니콜라이 클레나, 또 다른 박사 과정 학생 Maeva Le Guennec, 그리고 실험실 다비드 감바로토의 포스트 독이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 먼저 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 미디어 와 C.Reinhardtii 세포를 준비합니다. 준비된 세포를 50밀리리터 원물 튜브로 옮기고 원심분리기를 600배 g에서 10분 동안 이송합니다.1x PBS의 50 밀리리터로 한 번 펠릿을 씻고 10 분 동안 600 배 g에서 다시 세포를 회전시십시오. 파이펫을 사용하여 실온 탈색 버퍼의 100 밀리리터에서 펠릿을 다시 놓습니다. 비커를 자기 교반기 위에 놓고 0.5 개의 어금니 아세트산을 4.5 ~ 4.7의 최종 pH에 천천히 추가하십시오.이 혼합물을 실온에서 2 분 동안 배양하십시오. 이 후 천천히 7.0에 pH를 복원하기 위해 하나의 정상 칼륨 수산화칼륨의 방울을 추가 한 후, 50 밀리리터 튜브로 세포를 전송하고, 원심 분리는 10 분 동안 600 배 g에서 그들을 원심분리, 어떤 분리 된 플래그엘라를 제거합니다. 상체를 버리고 씻을 준비가 될 때까지 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.준비되면 세척당 섭씨 4도에서 1x PBS 50 밀리리터를 사용하여 펠릿을 두 번 씻으십시오. 세척된 펠릿을 600g, 섭씨 4도에서 10분간 회전합니다. 1x PBS의 30 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다.그런 다음, 천천히 혼합하지 않고 25 % 자당의 20 밀리리터 쿠션에 서스펜션을 로드합니다. 남은 기포라를 제거하고 자당에 세포를 퍼뜨리기 위해 15분 동안 600배 g와 섭씨 4도에서 회전하십시오. 흡혈구를 사용하여, 신중하게 최하위 20 밀리리터를 유지 하는 슈퍼 내탈자를 흡인.감기 1x PBS 20 밀리리터를 추가하여 남은 자당을 씻으셔도 됩니다. 원심분리기는 600배, 섭씨 4도에서 10분간. 10 밀리리터의 10밀리리터에서 섭씨 4도에서 펠릿을 다시 중단하고 용액에 덩어리가 없는지 확인합니다.재중단 된 펠릿을 새로운 250 밀리리터 병에 옮기고, 세포를 포함하는 병에 5, 000 단위의 DNase로 보충된 용해 버퍼를 추가합니다. 1시간 동안 섭씨 4도에서 배양하고, 병을 조심스럽게 반전시켜 15분마다 섞어 주세요. 용액 세포를 50 밀리리터 원물 튜브및 원심분리기로 600g, 섭씨 4도에서 10분 동안 옮긴다.파이펫을 사용하여 상체를 수집하고 60 % 자크로 쿠션의 두 밀리리터가 들어있는 얼음에 30 밀리리터 라운드 하단 튜브에 로드합니다. 원심 분리기는 섭씨 4도에서 30분 동안 10, 000배 g로 이쪽. 그 후, 자당 쿠션 위에 최대 1 밀리리터까지 슈퍼너티드를 흡인시합니다.남은 상류체의 1밀리리터와 자당 쿠션의 두 밀리리터 사이의 노란색 인터페이스를 유의하십시오. 절단 P1000 팁을 사용하여, 부드럽게 자당과 나머지 상수와 혼합. 모든 자당 쿠션을 풀고 얼음 위에 보관하십시오.다음으로, 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 얇은 벽38.5 밀리리터 폴리프로필렌 튜브에서 40%에서 70%의 자당 그라데이션을 준비한다. 풀이 된 인터페이스를 그라데이션에 천천히 로드합니다. 튜브의 밸런스를 10 밀리머 K-PIPES 버퍼, 원심분리기는 68, 320배, 섭씨 4도에서 75분간 균형을 이릅니다.그 후 0.8mm 바늘을 사용하여 튜브 바닥에 구멍을 뚫고 다른 자당 층을 방해하지 않도록하십시오. 이 구멍을 사용하여 섭씨 4도에서 12 500 마이크로리터 분획을 수집합니다. 절단 P200 팁을 사용하여, 면역 형광 중에 사용할 각 분획에서 추가 10 마이크로 리터 알리쿼트를 준비합니다.그런 다음 액체 질소의 분획을 스냅 고정합니다. 먼저 멸균 12mm 커버슬립을 농축기의 오목한 하단 에 놓고 PDL 코팅 측면을 아래로 유지하십시오. 어댑터를 맨 위에 직접 놓고 커버슬립을 캡합니다.그런 다음 라운드 하단 튜브를 반전시키고 농축기, 커버 슬립 및 어댑터 위에 놓습니다. 핀셋을 사용하여 튜브 바닥에 도달 할 때까지 부드럽게 앙상블을 밀어 튜브를 반전시면 됩니다. 농축기 의 상단에 도달 할 때까지 K-PIPES 버퍼의 10 밀리머를 추가합니다.농축기의 중앙 실린더에 거품이 없는지 확인합니다. 10 밀리머 K-PIPES 버퍼100 마이크로리터를 농축 된 원골 분수의 알리쿼트 중 하나에 부드럽게 추가하고 P200 파이펫을 사용하여 완전히 혼합하십시오. 다음으로, 농축기의 중공 중심에서 K-PIPES 버퍼 100마이크로리터를 제거하고, 버퍼 분획 혼합물의 100마이크로리터를 추가하여 내용이 농축기의 중공 중앙에 남아 있는지 확인합니다.섭씨 4도까지 미리 냉각되는 원심분리기에서 10, 000배 g에서 10분간 회전합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 농축기를 제거합니다. 어댑터의 구멍에 수제 후크 장치를 삽입하고 커버슬립을 복구하기 위해 부드럽게 들어 올립니다.튜브 의 상단에 도달하면 장갑을 낀 손가락을 사용하여 어댑터 가장자리를 트랩하고 핀셋을 사용하여 커버슬립을 제거하며 커버슬립의 어느 쪽에 센트리올이 포함되어 있는지 염두에 두십시오. 그런 다음 농축 된 중심의 고정 및 면역 형광 염색을 수행합니다. 시작하려면, 5 분 동안 영하 20도에서 100 % 메탄올로 채워진 준비 된 크리스탈 폴리스티렌 전송 실험실 상자에 센트리올로 커버립을 배양하십시오.핀셋을 사용하여 커버립을 1x PBS 50 밀리리터로 채워진 투명한 실험실 상자로 옮습니다. 실온에서 5분 동안 PBS에서 슬라이드를 세척하십시오. 그런 다음, 1차 항체의 파이펫 60 마이크로리터가 가습 챔버에서 실험실 밀봉 랩의 조각에 혼합된다.조심스럽게 커버립을 항체 믹스 위에 놓고, 센트리올은 드롭을 직접 마주한다. 커버립을 45분 동안 배양합니다. 그 후 커버립을 제거하고 PBS가 포함된 상자에 5분간 세척합니다.PBS 1%BSA 및 0.05%Tween-20의 이차 항체를 45분 동안 세척된 커버립을 배양합니다. 커버립을 제거하고 PBS가 들어있는 상자에 5 분 동안 씻으실 수 있습니다. 일반 페이딩 안티 마운트 배지를 사용하여 커버슬립을 슬라이드에 장착합니다.그런 다음, 1.4의 N.A.를 가진 63X 오일 목표에서 공초점 현미경에 고립 된 중심을 이미지하면서 deconvolution을 적용합니다. 각각 센트리올 신호 위와 아래에 Z 스택의 위쪽 및 하단 위치를 설정하고 총 중심 신호를 포함하는 큰 이미지 스택을 획득한다. 스택을 투영하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단일 파티클 평균을 수행합니다.대표적인 면역형광은 6개의 분수가 격리된 센티미터를 위해 농축되고, 마지막 2개의 분수는 그렇지 않은 반면, 정제가 성공적임을 나타낸다. 집중력없이 시야당 약 30 센트만 볼 수 있으며 183은 농축기와 함께 볼 수 있습니다. 이는 농축기 단계가 성공적이며 정의된 영역에서 센트리올을 6배 더 농축하여 쉽게 감지하고 이미지화할 수 있음을 보여줍니다.슈퍼 해상도 현미경 검사는 다음 모노 글루타밀레이션 튜룰린에 대한 염색 된 중심을 이미지하는 데 사용되며, 소프트웨어는 선택한 각 방향에 대한 거의 완벽한 평균을 생성하는 데 사용됩니다. 5회 반복 후, 평균 의 두 클래스는 모노글루타큘레이션 중심의 생성되었다: 63 개의 개체에서 상단 보기와 98 입자에서 측면 보기. 측면 뷰 클래스 평균의 길이는 직경 250 나노미터로 260 나노미터이며, 센티미터의 코어 내에서 국소화되는 측정된 단박골 투룰린 신호와 비교할 수 있습니다.이 절차를 수행하는 동안, 얼음에 고립 된 중심을 유지하고 격리 후 그들을 스냅 동결 기억하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 냉동 전자 현미경 및 질량 분광법과 같은 다른 방법은 센트리올 또는 센트리올 단백질 조성물의 네이티브 아키텍처와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수있다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

번식과 Tetrad 분리 Chlamydomonas reinhardtii 유전자 분석을위한

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

연구

생물학

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

전체 심장 이미징에 대한 형광 광 프로젝션 Tomography에 대한 출생 정규화

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

단일 입자 수준에서 바이러스성 퓨전 속도론의 측정 방법

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

에 대한 Mesoscopic 형광 Tomography 인 - 생체내</em개발> 이미징 Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

랜덤 코니컬 틸트 메서드를 사용하여 Exosome 단지의 단일 입자의 전자 현미경의 재건

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

엑기스의 Intravital 형광 이미징을위한 Microiontophoresis 및 미세 조작

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

이미징 및 배아 제브라 피쉬의 뇌 혈관 구조의 3 차원 재구성

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

하나 나노 미터의 정확도와 형광 이미징 (피오나)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...