Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Vi takker Pierre Gönczy og BioImaging & optikk plattform (BIOP) på École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Sveits, hvor SIM bilder av centrioles ble anskaffet. Nikolai Klena og Davide Gambarotto støttes av europeiske Research Council (ERC) starter Grant (StG) 715289 (aksent) og Maeva Le Guennec, Paul Guichard og Virginie Hamel av det sveitsiske National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers er støttet av universitetet i Geneve.

<ol>
	<li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+in+cells+and+organisms.">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li><li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+and+only+once:+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease.">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrioles,+centrosomes,+and+cilia+in+health+and+disease.">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li><li>G&#246;nczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly.">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li><li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+organization+and+centriole+architecture:+their+sensitivity+to+divalent+cations.">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li><li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+structure.">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+basal+bodies+in+paramecium.">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).</li><li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis.">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li><li>Li, S., Fernandez, J. -. J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography.">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li><li>Guichard, P., Chr&#233;tien, D., Marco, S., Tassin, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography.">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry.">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li><li>Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartwheel+assembly.">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes.">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li><li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure.">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li><li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging.">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis.">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li><li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii.">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).</li><li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus:+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body.">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, 2663-2674 (2004).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy.">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms.">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813 (2017).</li><li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology.">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li><li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Approaches+to+the+Study+of+the+Role+of+Metals+in+the+Metabolism+of+Microorganisms.">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li><li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles.">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li><li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyVolution-the+smart+path+to+confocal+super-resolution.">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+3D-SIM/SMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+&#8764;4-5+nm.">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of &#8764;4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li><li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+lytic+enzymes+(autolysins)+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+(hydroxy)proline-specific+proteases.">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li><li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images.">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

En av utfordringene i biologi er å dechiffrere den nøyaktige lokaliseringen av proteiner i arkitektonisk sammenheng. Centriole er en ideell struktur bruke disse metodene, som sin arkitektur har studert ved bruk av cryo-elektron tomografi, avslørende interessante ultrastructural funksjoner langs. Men fordi dimensjoner nær oppløsning grensen i optisk mikroskopi er det vanskelig å nøyaktig lokalisere et protein av immunofluorescence til en strukturell sub regionen centriole bruker konvensjonell mikroskop30.
Oppløsningen i optisk mikroskopi er begrenset av Diffraksjon lys som gir, grovt, lateral maksimal oppløsning på 200 nm i optisk mikroskopi24. Men denne grensen har vært består av en av de store gjennombrudd i de siste 20 årene i optisk mikroskopi: oppfinnelsen av super-oppløsning metoder. Disse metodene kan bildet utover Diffraksjon grensene i forskjellige oppløsninger: 120 nm for SIM, 50 nm for tilsvarende nedbryting (STED) og 20-40-nm for single-molekylet lokalisering mikroskopi (SMLM)24. Med denne nye utviklingen av super-oppløsning mikroskopi er de strukturelle underregionene av centriole oppnåelig. Men i praksis er det fortsatt vanskelig å nøyaktig bestemme lokaliseringen av et protein til en strukturell element for den viktigste grunnen til at de eldre centrioles finnes bare 2 eksemplarer per celle og ha tilfeldig orientering, som gjør tolkningen av lokalisering er vanskelig. Derfor ble en protokoll satt opp som tillater forskere å bilde av super-oppløsning et stort antall centrioles, øke sjansen til å observere ikke-tvetydig orientering. Viktigere, som denne metoden er avhengig av bruken av isolerte centrioles, vi gir en metode for å rense intakt C. reinhardtii centrioles som inneholder eldre centrioles og procentrioles.
Til slutt, på grunn av området av centriole retninger som kan avbildes med denne protokollen, enkelt-partikkel analyse kan brukes med elektronmikroskop programvare. Dette resulterer i generasjon av gjennomsnittlig klasser av centrioles i en bestemt retning. Viktigere, kan disse 2D bildene deretter brukes til å vurdere lokaliseringen av et bestemt protein langs centriole. Faktisk denne metoden kan brukes på to-farge super oppløsning, og én farge kan brukes til å vise centriole skjelettet (f.eks, tubulin) mens andre fargen kan tilskrives en bestemt centriolar protein. Ved å trekke gjennomsnitt med én eller to farger, blir det enklere å registrere et protein langs centriole (proksimale, sentral eller distale). Merk at de to kanalene skal justeres nøyaktig for å hindre noen villedende tolkninger. Videre hjelper gjennomsnitt over topp utsikt dechiffrere hvis et protein regionaliserer inne det centriolar lumen, langs microtubule veggen, eller utenfor centriole.
Denne metoden har fordelen å fastslå lokaliseringen av spesifikke proteiner som kan være vanskelig å lokalisere ellers på grunn av heterogene merking. Merk at andre metoder for å tilordne proteiner i centrioles er beskrevet i correlative 3D SIM/SMLM, for eksempel vurdere spesifikk retningene av centrioles ved å bestemme elliptiske profilen på en markør danner en torus rundt den centriole av SIM tenkelig. Bruke denne parameteren, er det mulig å lokalisere protein med en presisjon på 4-5 nm30. Merk også at metoden beskrevet her bruker isolert centrioles med intakt procentrioles, et tegn på at centriole arkitektur er mest sannsynlig i stor grad konservert. Men kan ikke vi utelukke at noen arkitekturdetaljer er forstyrret under rensing, som centriole diameter varierende med konsentrasjonen av divalent kasjoner som forsterket med isolering av menneskelig centrosome5.
En av de viktige trinnene av protokollen presenteres her er å skaffe tilstrekkelig konsentrert isolerte centrioles i forskjellige retninger mottakelig for Fluo-SPA. Gjør først sørge for renhet og effektiviteten av centriole isolasjon prosedyren. En lav konsentrasjon av isolerte centrioles forhindrer riktig bildebehandling og ytterligere bildebehandling. For dette formålet gir vi en metode for å berike antall centrioles per synsfelt. Hvor mange centrioles i fraksjonen brukes, skal volumet i presisjonstørking justeres med største volum 250 µL.
Viktigere, har denne metoden blitt utviklet for en cellevegg minus cw15-C. reinhardtii celler. I denne stammen gir cellen vegg skjørhet en riktig lysis av celler, og dermed frigjøringen av innholdet. Denne protokollen er ikke effektiv for vill-type C. reinhardtii celler, som cellen vegg forhindrer en riktig lysis. Alternative strategier som sonication eller en pre-inkubering av cellene med autolysin, et enzym som kan redusere cellevegg31, må settes på plass å endre cellen vegg før du installerer isolasjon protokollen presenteres her.
Dette oppsettet kan brukes med ulike typer mikroskoper, alt fra konvensjonelle AC confocal mikroskop til høy gjennomstrømning dedikert super-oppløsning mikroskop. Merk at når du gjør SMLM, en spesiell buffer er nødvendig for riktig bildebehandling, og dermed et kammer tilpasset en 12 mm dekkglassvæske med buffer på dekkglassvæske skal brukes. Etterfølgende imaging utføres med invertert mikroskop. Hvis mikroskop oppsett ikke tillater en 12 mm dekkglassvæske, brukes protokollen presenteres her til 18 mm coverslips bruker en 30 mL runde bunn rør og en modifisert adapter og konsentrator. Det er også viktig å Merk at kvaliteten på den endelige rekonstruksjonen i SMLM vil avhenge av kvaliteten på den flekker og den primære antistoff brukes, samt metoden fiksering.
I sammendraget gir vi en metode som kan brukes på bildet mange centrioles etterfulgt av Fluo-SPA som vil generere gjennomsnitt av centrioles i forskjellige retninger, dermed bidra til å lokalisere centriolar protein med presisjon. Viktigere, brukes denne metoden mer generelt til isolerte centrioles fra andre arter, andre, eller store macromolecular samlinger. Endelig utvalg forberedelse tilnærming presenteres her, kombinert med ny algoritme utvikling for single-partikkel analyse av fluorescerende SMLM data32, kan åpne ytterligere forbedring i den molekylære kartografi av store macromolecular samlinger.

Centriole er et evolusjonært bevarte organelle som ligger i kjernen av centrosome i dyreceller og kan fungere som en basal kropp (referert til som centrioles heretter) mal flimmerhårene eller flagella i mange eukaryoter1,2. Slik er centrioles kritiske for grunnleggende celle biologiske prosesser fra spindelen montering til celle signalisering. Derfor er mangler i centriole samling eller funksjonen forbundet med flere menneskelige patologi inkludert ciliopathies og kreft3.
Centrioles er nine-fold, symmetrisk, microtubule trilling-baserte sylindriske strukturer som er vanligvis ~ 450 nm lang og ~ 250 nm bred4,5,6,7. Konvensjonelle elektronmikroskop og cryo-elektron tomografi av centrioles fra ulike arter har avdekket at centrioles er polarisert langs deres lange aksen med tre forskjellige områder: et proksimale område, en sentral kjerne og en distale regionen5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. viktigst, hver av disse områdene viser strukturelle funksjoner. Først inneholder lumen i 100 nm lange proksimale regionen cartwheel strukturen koblet til microtubule trilling gjennom pinhead element12. Andre 300-400 nm lange sentrale regionen inneholder fibrøs tettheter i funksjonene lumen og strukturelle langs indre ansiktet de piskehale som henger: Y-formet linker, C-tubule halen og A-tubule spire9. Til slutt, 50-100 nm distale regionen utstillinger sub distale og distale vedheng som omgir den distale del av centriole5,13.
De to siste tiårene har vært preget av oppdagelsen av et økende antall centriolar proteiner, fører til en gjeldende estimering av 100 distinkt proteiner blir en del av centriole14,15,16, 17. til tross for disse fremskrittene den nøyaktige lokaliseringen av disse proteinene i centriole forblir unnvikende, spesielt innen strukturelle regioner. Viktigere, er tilordne en nøyaktig lokalisering til strukturelle deler av centriole avgjørende for en bedre forståelse av deres funksjon. I denne forbindelse har C. reinhardtii centrioles vært medvirkende i begge sider av første delimitating forskjellige strukturfunksjonene langs sylinder9,18,19, som deretter lot forskere å korrelere lokalisering av et delsett av proteiner med fluorescerende mikroskopi en sub strukturelle regionen. Dette omfatter for eksempel proteiner Bld12p og Bld10p, som Lokaliser den proksimale regionen og cartwheel strukturen spesielt20,21,22,23. Listen over underkonstruksjonen lokalisert proteiner inkluderer også POB15 og POC16, to nye proteiner identifisert av massespektrometri som dekorerer regionen indre sentrale kjernen C. reinhardtii centrioles17.
Dette dokumentet gir en fullstendig beskrivelse av metoden utviklet for å isolere og image C. reinhardtii centrioles for påfølgende super-oppløsning mikroskopi og enkelt-partikkel snitt. For å oppnå dette målet, er det viktig å avgrense de tekniske begrensningene som må overvinnes. Først kan centriole rensing påvirke den generelle arkitekturen, med cartwheel struktur ofte blir tapt i de ulike trinnene i isolasjon9. Dernest er centriole svært nær Diffraksjon grensen i optisk mikroskopi. Lateral oppløsningen som kan oppnås i AC confocal mikroskopi er faktisk rundt 200 nm24, lik diameteren på centriole og oppløsningen i z-aksen er om 2-3 x lavere, fører til en Anisotrop volum. For det tredje, heterogenitet antistoff merking og centriole orientering kan begrense tolkningen trengs for å lokalisere et protein i en bestemt centriolar regionen. Endelig finnes centrioles i bare to eksemplarer per celle, gjør det vanskelig å få et stort antall bilder og finne en entydig centriole retning. For å omgå disse tekniske problemer, utviklet vi en metode som baserer seg på bruk av super-oppløsning mikroskopi på et stort antall isolerte centrioles som vedta ulike retninger. Først vil vi beskrive en protokoll for å rense C. reinhardtii centrioles som rensing av strukturelt intakt centrioles og procentrioles som inneholder cartwheel. Deretter vil vi beskrive en trinnvis protokoll for å fokusere på centrioles på coverslips for avbildning av konvensjonelle eller fluorescerende super-oppløsning mikroskopi. Dette viktig skritt kan øke antall centrioles fotografert i flere retninger. Til slutt vil vi beskrive en prosedyre for å utføre single-partikkel snitt på informasjon innhentet ved fluorescerende mikroskop som forenkler gjenkjenning av centrioles i forskjellige retninger. Helt, kan denne metoden brukes på bildet centrioles fra ulike arter eller andre store macromolecular samlinger.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioles er store macromolecular samlinger viktig for riktig gjennomføring av grunnleggende celle biologiske prosesser som celledeling, celle motilitet eller celle signalisering. Grønn algene Chlamydomonas reinhardtii har vist seg for å være en innsiktsfull modell i studiet av centriole arkitektur, funksjon og protein komposisjon. Til tross for store fremskritt mot forståelse centriolar arkitektur er en i aktuelle utfordringer å bestemme den nøyaktige lokaliseringen av centriolar komponenter i strukturelle deler av centriole for å bedre forstå deres rolle i centriole biogenesis. En stor begrensning ligger i oppløsningen til fluorescens mikroskopi, kompliserer tolkningen av protein lokalisering i denne organelle med dimensjoner nær Diffraksjon grensen. For å takle dette spørsmålet, gir vi en metode for å rense og bilde et stort antall C. reinhardtii centrioles med forskjellige retninger med super-oppløsning mikroskopi. Denne teknikken kan videre behandling gjennom fluorescerende single-partikkel gjennomsnitt (Fluo-SPA) på grunn av det store antallet centrioles kjøpt. Fluo-SPA genererer gjennomsnitt av farget C. reinhardtii centrioles i forskjellige retninger, dermed tilrettelegge lokalisering av forskjellige proteinene i centriolar regioner. Viktigere, kan denne metoden brukes på bildet centrioles fra andre arter eller andre store macromolecular samlinger.

C. reinhardtii Centriole isolasjon: Isolere centrioles, cw15- C. reinhardtii celler ble dyrket i flytende kultur i flere dager under lys og senere pelleted med sentrifugering 600 x g for 10 min. Pelleted celler ble vasket 1 x med PBS og resuspended i en deflagellation buffer før deflagellation ved å utføre en pH støt med 0,5 M eddiksyre til en siste pH på 4,5-4.7 i 2 minutter (figur 1en). Et tillegg på 1 N KOH ble brukt til å gjenopprette pH 7.0. Separate frittliggende flagella fra cellen legemer, ble deflagellated celler først sentrifugeres for å fjerne meste av flagella. Pellet var så vasket 2 x med PBS og resuspended i 30 mL PBS før lasting det sakte på en 25%-sukrose pute (figur 1B). Røret ble spunnet på 600 x g i 15 min på 4 ° C for å fjerne det meste av frittstående flagella. Etter sentrifugering, cellen legemer var spredt i sukrose pute (figur 1C) og gjenopprettet ved å fjerne den ca 30 mL av nedbryting (til den røde pilen i figur 1C). Den resulterende 20 mL vasket celler ble deretter resuspended i 20 mL kaldt PBS og sentrifugeres 600 x g i 10 min. Deretter nedbryting ble forkastet, og cellene var helt resuspended i 10 mL PBS. Cellene ble overført til en 250 mL flaske og lyseringsbuffer ble lagt til resuspended cellene samtidig. DNase ble lagt til lyse og ruges 1t på 4 ° C. Etter sentrifugering trinn fjerne celle rusk (se den hvite pellet i figur 1D), nedbryting ble samlet inn og nøye lastet inn en 2 mL 60%-sukrose pute før sentrifugering 10.000 x g i 30 min på 4 ° C. Merk at for 100 mL lysis, 8 rør på 15 mL ble brukt til å utføre dette trinnet tilsvarer 12.5 mL lyseringsbuffer lastet på 2 mL av sukrose per rør. De fleste av nedbryting ble fjernet etter sentrifugering, opp til 1 mL over pute. 1 mL av gjenværende nedbryting ble deretter samlet med 2 mL pute blandet og samlet for å få et endelig antall 24 mL. Bassenget var deretter lastet på en 40% - 50%-, 70%-sukrose gradient og spunnet 68,320 x g i 1 h og 15 min på 4 ° C. Endelig de isolerte centrioles samlet inn ved å lage et hull i den nederste delen av sentrifugeringsrøret med en nål og dråpene ble samlet i 12 x 500 µL fraksjoner. På grunn av de ulike sukrose, drop dannet veldig sakte i begynnelsen (70% sukrose) og deretter mer raskt (40% sukrose).
Immunofluorescence av isolerte Centrioles For å vurdere kvaliteten på isolering prosedyren, ble 10 µL av hver samlet gradient fraksjon deretter sentrifugeres på en dekkglassvæske med en dekkglassvæske støtte adapter (figur 2A-2D). Viktigere, for å fjerne trygt på dekkglassvæske, en egendefinert hekta enhet ble utformet (figur 2B). Neste, coverslips ble analysert av immunofluorescence. Antistoffer mot CrSAS-6(Bld12p) ble brukt i denne studien for å indikere tilstedeværelse av cartwheel struktur og α-tubulin (DMA1) for å markere centriolar veggen. Telle antall centrioles som var positivt for både CrSAS-6 og α-tubulin per synsfelt og deretter antall centrioles per fraksjoner, var det mulig å fastslå hvilke fraksjoner ble beriket for isolert centrioles ( Finne 2F-2 H). Interessant, var 6 fraksjoner beriket for centrioles (figur 2F og 2 G, brøker #1-6), med en topp for brøkdel #3, mens de siste fraksjonene ikke var indikerer at rensing jobbet. Merk at i dette bestemte eksperimentet, 95% av de totale centrioles var positivt for CrSAS-6 og α-tubulin i brøkdel #3. Dette indikerer at mest isolerte centrioles beholdt sine cartwheels. Hvis ingen anriking av centrioles er observert i første fraksjoner, isolasjon prosedyren fungerte ikke og skal gjentas. Merk at noen flagellar stykker kan observeres hovedsakelig i fraksjoner uten centrioles.
Deretter vil beregne antall centrioles per µL, skal antall centriole per synsfelt multipliseres med forholdet som vises i figur 2H. Resultatet skal deretter deles av volumet av brøken brukes for immunofluorescence for å få antall centrioles per µL. Her bestemt isolasjon inneholdt mest beriket brøken ca 37 centrioles for et område av 0.00846 mm2 (med en synsfelt av 92 x 92 µm2). Overflaten av slangeseksjonen var 7,5 mm i radius et totalt areal på 176 mm2. Tilsvarende forholdet var 176/0.00846 = 20,803.8, så 769,740 centrioles (37 x 20, 803.8) i 10 µL totalt. Antall centrioles i 1 µL var derfor 76,974.
Konsentrasjonen av isolerte Centrioles på Coverslips: Øke antall centrioles per felt øker sjansen for å oppdage entydig centriole retning, i tillegg til å øke sjansen for å oppdage lignende orientering som kan brukes for ytterligere partikkel snitt prosedyrer. Som centrioles fra konsentrert fraksjoner er fortsatt er sparsommelig på dekkglassvæske, utviklet vi et sentrifugering tilbehør å konsentrere seg centrioles i dekkglassvæske (Figur 3A) kalt en konsentrator. Merk at en .stl fil med presis tiltak for 3D utskriften er utstyrt med dette manuskriptet.
Først en dekkglassvæske 12 mm var montert på presisjonstørking (Figur 3B). Adapteren ble plassert på toppen av dekkglassvæske og runde bunn røret var invertert og plasseres over monterte adapter og konsentrator. Runde bunn røret ble deretter forsiktig invertert, slik at lasting av prøven (protokollen trinn 4.2). Centrioles ble deretter sentrifugeres 10.000 x g i 10 min på 4 ° C. Etter at ble centrioles utsatt for immunofluorescence og farget for CrSAS-6/Bld12p og α-tubulin (Figur 3 c-3E). Viktigere, uten konsentrator, ble ca 30 centrioles sett per synsfelt (Figur 3C), mens 183 centrioles ble sett per synsfelt når du konsentratoren ble brukt (figur 3D-3F). Merk at centrioles dekket bare en diskett 4 mm i diameter i dekkglassvæske. Dette resultatet viser at konsentrasjonen trinnet fungerer og gir en 6-fold anriking av centrioles i et definert område av coverslips, dermed lettelser gjenkjenningen og tenkelig.
Fluorescerende Single-partikkel snitt av isolerte C. reinhardtii Centrioles: Her bruker SIM mikroskopi som kan nå en oppløsning på rundt 120 nm, centrioles farget for monoglutamylated tubulin (GT335, Figur 4), en tubulin endring i centriolar piskehale som henger, ble fotografert24. C. reinhardtii centrioles er ca 500 nm lang, alltid i par, og ofte funnet med forbundet, nylig duplisert probasal organer (referert til som procentrioles heretter) og striated microtubule-assosiert fiber19. Derfor var denne siste samlingen ca 1 µm store. Av denne grunn, og for å image centrioles i sin helhet, anbefales det å anskaffe en Z-stabel på de isolerte centrioles.
Her etter kjøpet, ble en endelige bildet generert ved å utføre en maksimal intensitet projeksjon bruker ImageJ28 (bilde/stabler/Z prosjekt/max intensitet projeksjon, Figur 4B). En enkelt-partikkel analyse bruker cryo-elektron mikroskopi programvare ble utført for å gjøre klasser av centrioles med lignende orientering slike bilder, og deretter gjennomsnitt ble utført. Gjør var bildet fargen først invertert for å bedre bilde objektene (Figur 4C). Centrioles ble plukket manuelt i en sentrert over hver partikkel ved hjelp av fritt tilgjengelig Scipion programvare29 som integrerer flere elektronmikroskop programmer som Xmipp3 (Figur 4D). Merk at størrelsen på boksen defineres av brukeren. Her, esker med 50 x 50 piksler for en pikselstørrelse 31.84 nm ble brukt. Deretter alle partikler ble pakket ut (Figur 4E) og justert med Xmipp3 (Figur 4F). Deretter ble en sirkulær maske av 12 piksler i radius brukt til å isolere hver centriole fra centriolar-paret (Figur 4G). Partiklene var så klassifisert, bruke Xmipp3, til å generere flere gjennomsnitt. Bare ble homogen klasse gjennomsnitt holdt, betyr at partikler som avviker fra klassen gjennomsnitt ble manuelt ekskludert. Dette trinnet ble gjentatt for å generere en nesten perfekt gjennomsnittet for hver valgte orientering. Etter fem gjentakelser, to klasser av gjennomsnitt ble generert: topp utsikt fra 63 objekter (Figur 4H) og en side utsikt fra 98 partikler (Figur 4jeg) av monoglutamylated centrioles. Dimensjoner av objektet ble bestemt ved å måle avstanden mellom toppene av intensitet tomten profilen langs monoglutamylation signalet.
Viktigere, lengden på side-visning klasse gjennomsnittet er 260 nm med en diameter på 250 nm, sammenlignes med målte monoglutamylated tubulin signalet som ble vist å lokalisere til et område av 286 ± 33 nm i lengde i kjernen av centriole-17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> Figur 1 : Rensing av C. reinhardtii centrioles. (A) Dette er en skjematisk fremstilling av hvert trinn som fører til isolasjon av C. reinhardtii centrioles. Det inkluderer representant trinnene i protokoll (B) før og (C) etter sentrifugering på 25%-sukrose graderingen. Den røde pilen i C -panelet angir minimum volumet beholde etter sentrifugering. (D) dette panelet viser den hvite pellet lysed celler etter sentrifugering. Svarte pilen viser pellet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> Figur 2 : Sentrifugering satt opp til å utføre immunofluorescence på isolert centrioles. (A) 10 µL av hver samlet fraksjon er utvannet først i 100 µL av 10 mM K-rør (pH 7.2). (B) Dette er en skjematisk fremstilling av sentrifugering enhetene, omfatter et 15 mL runde bunn rør, en 12 mm dekkglassvæske, en adapter for dekkglassvæske, og en skreddersydd hekta enhet til å gjenopprette dekkglassvæske etter sentrifugering. Paneler C og D Vis tegninger forklarer hvordan gjenopprette dekkglassvæske etter sentrifugering. (C) sted verktøyet hektet i hullet i spor kanten av adapteren og (D) trekk forsiktig. (E) Dette er bilder av fuktig chamber måtte utføre immunofluorescence bildebehandling. Pilen viser 12 mm dekkglassvæske. (F) Dette er representativt AC confocal bilder på 63 X (zoom 2) gradient fraksjoner #1-8, samlet under den rensing prosedyren og farget for CrSAS-6 (rød) og α-tubulin (grønn). Senkninger tilsvarer området angitt av en hvit boks i visningene for lavere forstørrelse. Skala bar = 10 µm. (G) Dette er en graf som representerer antall centrioles positivt for både CrSAS-6 og α-tubulin per synsfelt i hver fraksjon. Merk anriking i fraksjoner #1-6. Gjennomsnittlig antall centrioles per i hver fraksjon: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37.0 ± 17.0, #4 = 23.3 ± 11.4, #5 = 14,3 ± 2.1, #6 = 13,7 ± 9.3, #7 = 2,7 ± 1.2, #8 = 1.0 ± 0,0, #9 = 1.0 ± 0,0, #10 = 0.0 ± 0,0, #11 = 0,3 ± 0,6, #12 = 0.0 ± 0,0. For hver fraksjon, ble 3 tilfeldige felt fotografert. Merk at når teller mest beriket brøken #3, fant vi at 95% av centrioles er positivt for CrSAS-6 og α-tubulin (n = 205 centrioles). (H) A forholdet mellom antall centrioles i micrographs målte området brukes til å beregne antall centrioles i området av røret. Hvor centriole per µL kan beregnes fra 10 µL opprinnelig sentrifugeres fraksjoner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> Figur 3 : Isolert centrioles er centrifuged bruker konsentratorer. (A) dette panelet viser sentrifugering enhetene måtte konsentrere centrioles på coverslips før immunofluorescence, inkludert et 15 mL runde bunn rør, en konsentrator, en 12 mm dekkglassvæske og en støtte adapter apparater. (B) dette panelet viser fremgangsmåten for å montere sentrifugering enheten. Paneler C-E viser AC confocal bilder av centrioles farget CrSAS-6 (rød) og α-tubulin (grønn) (C) uten eller (D-E) med presisjonstørking. Senkninger tilsvarer området angitt av en hvit boks i visningene for lavere forstørrelse. Baren skala er 10 µm. Merk at centrioles er anriket i dekkglassvæske (den stiplede linjen representerer grensen av konsentrert området). (F) denne grafen representerer antall centrioles per synsfelt uten og med presisjonstørking. Fem tilfeldige synsfelt ble analysert. Gjennomsnittlig antall centrioles er, uten konsentrator, 29.8 ± 2.9, og konsentrator, 182.6 ± 11,5, P < 0,0001. Den statistiske betydningen ble vurdert av en kort t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> Figur 4 : Single-partikkel snitt på isolerte C. reinhardtii centrioles. (A) dette panelet viser Z stakk bilder av centrioles farget med GT335 og anskaffes ved hjelp av en SIM mikroskop. (B) disse panelene viser en maksimal intensitet Z projeksjon stablede bilder. Skala bar = 1 µm. (C) disse panelene viser et representativt bilde med en invertert kontrast. Rammemargen representerer en zoome inn å visualisere centrioles bedre. (D) disse panelene Vis partikkel plukking. Rammemargen angir hvordan partiklene ble plukket. (E) Dette er eksempler på 5 utdraget partikler. (F) dette panelet viser partikler etter justeringen. (G) dette panelet viser partikler etter å bruke en maske. Paneler H og jeg vise to klasse gjennomsnitt: (H) en topp utsikt (63 partikler) og (jeg) en side-visning (98 partikler). Dobbeltpilene angir dimensjonene av GT335. Skala bar = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> 
Supplerende filen 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende filen 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolasjon og fluorescens Imaging for Single-partikkel rekonstruksjon av Chlamydomonas Centrioles

Vi har utviklet en strategi for å rense og bilde et stort antall centrioles i forskjellige retninger mottakelig for super-oppløsning mikroskopi og enkelt-partikkel snitt.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i centriole-feltet, for eksempel å lokalisere protein til en bestemt region av centriolet. Den største fordelen med disse teknikkene som vi gir midler til å konsentrere centriole for å få dem i flere orienteringer. Selv om denne metoden kan gi innsikt i Chlamydomonas centriole biologi, kan den også brukes på andre system, for eksempel isolerte menneskelige og paramecium centrioles.Demonstrerte prosedyren vil være ph.d.-student Nikolai Klena, en annen ph.d.-student Maeva Le Guennec, og postdoktor i laboratoriet Davide Gambarotto. For å starte denne prosedyren, først forberede alle medier og kultur C.Reinhardtii cellene som beskrevet i tekstprotokollen. Overfør de tilberedte cellene til 50 milliliter koniske rør og sentrifuge dem på 600 ganger g i 10 minutter.Vask pellet en gang med 50 milliliter 1x PBS og spinn cellene igjen på 600 ganger g i 10 minutter. Bruk en pipette til å bruke pelleten på nytt i 100 milliliter romtemperaturdeflagellasjonsbuffer. Plasser begeret på en magnetisk rører, og tilsett sakte 0,5 molar eddiksyre til en endelig pH på 4,5 til 4,7.La denne blandingen inkubere ved romtemperatur i to minutter. Etter dette sakte legge dråper av en normal kaliumhydroksid for å gjenopprette pH til 7,0, overføre cellene til 50 milliliter rør, og sentrifuge dem på 600 ganger g i 10 minutter, for å fjerne eventuelle frittliggende flagella. Kast det overnaturlige og oppbevar pellet på isen til den er klar til vask.Når du er klar, vask pellet to ganger med 50 milliliter 1x PBS ved fire grader Celsius per vask. Spinn den vasket pellet på 600 ganger g og fire grader Celsius i 10 minutter. Resuspend pellet i 30 milliliter av 1x PBS.Deretter legger du langsomt suspensjonen på en 20 milliliter pute på 25% sukrose, uten å blande. Spinn på 600 ganger g og fire grader Celsius i 15 minutter for å fjerne eventuelle gjenværende flagella og spre cellene i sukrose. Ved hjelp av en aspirator, forsiktig aspirere supernatant holde bare de nederste 20 milliliter.Vask resten av sukrose ved å tilsette 20 milliliter kald 1x PBS. Sentrifuge på 600 ganger g og fire grader Celsius i 10 minutter. Resuspend pellet i 10 milliliter av 1x PBS ved fire grader Celsius, og sørg for at det ikke er klumper i løsningen.Overfør den gjenbrukte pelleten til en ny 250 ml flaske, tilsett lysisbufferen, supplert med 5000 enheter DNase, til flasken som inneholder cellene. Inkuber ved fire grader Celsius i en time, mens du blander hvert 15. Overfør de lysede cellene til et 50 milliliter konisk rør og sentrifuge ved 600 ganger g og fire grader Celsius i 10 minutter.Bruk en pipette til å samle supernatanten og legg den inn i et 30 milliliter rund bunnrør på is som inneholder to milliliter med 60 % sukrosepute. Sentrifuge dette på 10,000 ganger g i 30 minutter ved fire grader Celsius. Etter dette aspirerer du overnatanten opptil en milliliter over sukroseputen.Legg merke til det gule grensesnittet mellom den ene milliliteren av gjenværende supernatant, og de to milliliter sukrosepute. Bruk en kuttet P1000-spiss, bland forsiktig de gjenværende supernatante med sukrose. Pool alle sukrose puter og lagre dem på is.Deretter forbereder du en 40% til 70% sukrose gradient i en tynnvegget 38,5 milliliter polypropylenrør som beskrevet i tekstprotokollen. Last de samlede grensesnittene langsomt inn i graderingen. Balansere rørene med 10 millimolar K-PIPES buffer, og sentrifuge på 68, 320 ganger g og fire grader Celsius i 75 minutter.Etter dette, bruk en 0,8 millimeter nål for å lage et hull i bunnen av røret, og pass på at du ikke forstyrrer de forskjellige sukroselagene. Bruk dette hullet til å samle 12 500 mikroliterfraksjoner ved fire grader Celsius. Ved hjelp av en kutt P200 tips, forberede en ekstra 10 mikroliter aliquot fra hver brøkdel som skal brukes under immunofluorescence.Deretter snap-fryse brøkene i flytende nitrogen. Til å begynne med legger du en steril 12 millimeter deksler på den innfelte bunnen av konsentratoren, og pass på å holde den PDL-belagte siden ned. Plasser adapteren direkte på toppen, for å dekke dekkglasset.Deretter inverterer du det runde bunnrøret og plasserer det over konsentratoren, dekkslippen og adapteren. Bruk pinsett, skyv forsiktig ensemblet til det når bunnen av røret, og deretter inverter røret. Tilsett 10 millimolar K-PIPES buffer til den når toppen av konsentratoren.Pass på at det ikke er bobler i den sentrale sylinderen på konsentratoren. Tilsett forsiktig 100 mikroliter med 10 millimolar K-PIPES-buffer til en av aliquotene til den berikede centriolarfraksjonen og bland grundig ved hjelp av en P200-pipette. Deretter fjerner du 100 mikroliter K-PIPES-buffer fra det hule midten av konsentratoren, og legger til 100 mikroliter av bufferfraksjonblandingen, og pass på at innholdet forblir i det hule midten av konsentratoren.Spinn på 10 000 ganger g i 10 minutter i en sentrifuge som er forhåndskjølt til fire grader Celsius. Etter dette, bruk pinsett for å fjerne konsentratoren. Sett en håndlaget hekta enhet inn i hullet som er tilstede i den slissede kanten av adapteren og løft forsiktig opp for å gjenopprette dekkslippen.Når den når toppen av røret, bruk en hanskefinger til å fange kanten av adapteren og bruke pinsett for å fjerne dekkslipsen, vær oppmerksom på hvilken side av dekkslippen inneholder centrioles. Deretter utfører fiksering og immunfluorescence farging av konsentrerte centrioles. Til å begynne, inkubere dekkglassene med centriolene i den tilberedte krystallpolystyrenoverføringslabboksen fylt med 100% metanol ved minus 20 grader Celsius i 5 minutter.Bruk pinsett, overfør dekkslips til en gjennomsiktig laboratorieboks fylt med 50 milliliter 1x PBS. La lysbildene vaskes i PBS i fem minutter ved romtemperatur. Deretter, pipette 60 mikroliter av primære antistoff blandes på et stykke laboratorietetningswrap i et fuktet kammer.Legg forsiktig dekkglassene på toppen av antistoffblandingen med centriolene rett mot dråpen. La dekkglassene inkubere i 45 minutter. Etter dette fjerner du dekkslipsene og vasker dem i en boks som inneholder PBS i fem minutter.Inkuber de vasket dekkslepper i 45 minutter, med sekundære antistoffer i PBS 1% BSA og 0,05% Tween-20. Fjern dekkglassene og vask dem i fem minutter i en boks som inneholder PBS. Bruk et vanlig anti-falmende monteringsmedium til å montere dekkglasset på et lysbilde.Deretter kan du se de isolerte centriolene på et konfokalt mikroskop ved et 63X oljemål med en N.A.på 1,4, mens du bruker dekonisjon. Sett opp topp- og bunnposisjonen til Z-stabelen over og under centriole-signalet, henholdsvis, og få en stor bunke bilder som består av det totale centriolesignalet. Projisere stabelen og utfør enkeltpartikkelsnitt som beskrevet i tekstprotokollen.Representativ immunofluorescence avslører at seks fraksjoner er beriket for isolerte centrioles, med en topp for brøkdel nummer tre, mens de to siste brøkene ikke er det, noe som indikerer at rensingen er vellykket. Bare om lag 30 centrioles er sett per synsfelt uten konsentratoren, mens 183 er sett med konsentratoren. Dette viser at konsentratortrinnet er vellykket, og gir mulighet for en seksdobling av berikelse av centrioles i en definert region, noe som gjør det lettere å oppdage og bilde dem.Superoppløsning mikroskopi brukes deretter til å bilde centrioles farget for monoglutamyated tubulin, og programvare brukes til å generere et nesten perfekt gjennomsnitt for hver valgt orientering. Etter fem iterasjoner ble to klasser av gjennomsnitt generert av monoglutamyated centrioles:en toppvisning fra 63 objekter og en sidevisning fra 98 partikler. Lengden på sidevisningsklassegjennomsnittet er 260 nanometer med en diameter på 250 nanometer, som kan sammenlignes med det målte monoglutamylert tubulinsignalet som anses å lokalisere i kjernen av centriolet.Mens du utfører denne prosedyren, er det viktig å huske å holde den isolerte centriole på is og snap-fryse dem etter isolasjon. Etter denne prosedyren kan annen metode, som kryoelektronmikroskopi og massespektrometri, utføres for å svare på ytterligere spørsmål, for eksempel den innfødte arkitekturen til centriolet eller centrioleproteinsammensetningen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Bildebehandling og 3D Rekonstruksjon av cerebrovaskulære Structures i Embryonale Sebrafisk

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Rapid Analyse og Utforskning av fluorescens mikros Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescens Imaging med One-nanometer Nøyaktighet (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...