Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Мы благодарим Пьер Gönczy и BioImaging и оптики платформы (BIOP) École политехнической школе Лозанны (ФПШЛ), Лозанна, Швейцария, где были приобретены SIM изображения centrioles. Николай клёна и Давиде Gambarotto, поддерживаются начиная грант Совета европейских исследований (ERC) (ПТГ) 715289 (ACCENT) и Maeva Le Guennec, Пол Гишар и Virginie Hamel, швейцарского национального фонда науки (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers поддерживается Женевского университета.

<ol>
	<li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+in+cells+and+organisms.">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li><li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+and+only+once:+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease.">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrioles,+centrosomes,+and+cilia+in+health+and+disease.">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li><li>G&#246;nczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly.">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li><li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+organization+and+centriole+architecture:+their+sensitivity+to+divalent+cations.">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li><li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+structure.">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+basal+bodies+in+paramecium.">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).</li><li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis.">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li><li>Li, S., Fernandez, J. -. J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography.">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li><li>Guichard, P., Chr&#233;tien, D., Marco, S., Tassin, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography.">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry.">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li><li>Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartwheel+assembly.">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes.">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li><li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure.">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li><li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging.">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis.">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li><li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii.">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).</li><li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus:+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body.">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, 2663-2674 (2004).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy.">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms.">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813 (2017).</li><li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology.">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li><li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Approaches+to+the+Study+of+the+Role+of+Metals+in+the+Metabolism+of+Microorganisms.">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li><li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles.">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li><li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyVolution-the+smart+path+to+confocal+super-resolution.">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+3D-SIM/SMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+&#8764;4-5+nm.">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of &#8764;4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li><li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+lytic+enzymes+(autolysins)+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+(hydroxy)proline-specific+proteases.">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li><li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images.">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Одна из проблем в области биологии является расшифровать точной локализации белков в контексте архитектуры. Центриоль является идеальной структурой применять эти методы, как его архитектура была изучена с помощью томографии крио электрон, раскрывая интересные ультраструктурные особенности вдоль его длины. Однако из-за его размеры близко к пределу резолюции в оптической микроскопии, трудно точно локализовать белок, иммунофлюоресценции для структурной субрегиона Центриоль, с использованием обычных Микроскопы30.
В резолюции в оптической микроскопии ограничены дифракцией света, который дает, грубо говоря, боковые максимальное разрешение 200 Нм в оптической микроскопии24. Однако, этот предел был одним из основных достижений за последние 20 лет проходили в оптической микроскопии: изобретение суперразрешением методов. Эти подходы можно изображения за пределами дифракции в разных разрешениях: 120 Нм для SIM, около 50 Нм для истощения простимулированное излучение (интереса) и 20-40 Нм для локализации одной молекулы микроскопии (SMLM)24. С этими новыми событиями суперразрешением микроскопии структурные субрегионах Центриоль достижимы. Однако на практике, это все еще трудно точно определить локализация протеина структурного элемента для основная причина что пожилые centrioles существуют только 2 копий на ячейки и имеют случайные ориентации, который делает толкование Локализация трудно. По этой причине протокол был создан, позволяет исследователям изображения супер резолюции большое количество centrioles, увеличивая шанс наблюдать не двусмысленным ориентации. Важно то, как этот метод полагается на использование изолированных centrioles, мы предоставляем способ очистить нетронутыми C. reinhardtii centrioles, которые содержат Зрелые centrioles и procentrioles.
Наконец ввиду ряда Центриоль ориентиры, которые могут быть образы с настоящим Протоколом, анализ сингл частиц может применяться в том с помощью электронной микроскопии программного обеспечения. Это приводит к формированию среднего класса centrioles в определенной ориентации. Важно отметить, что эти полученные изображения 2-D затем может использоваться для оценки локализации определенного белка вдоль Центриоль. Действительно этот метод может быть применен к двойной цвет супер-разрешение изображения, и один цвет может использоваться для раскрыть Центриоль скелета (например, тубулин), а другой цвет можно отнести к конкретным centriolar белка. Вычитая средние значения, полученные с одного или двух цветов, она становится легче зарегистрировать белок вдоль Центриоль (проксимальной, Центральный или дистальной части). Обратите внимание, что два канала должны быть точно согласованы для предотвращения каких-либо заблуждение интерпретаций. Кроме того средние Топ просмотров поможет расшифровать Если белок локализует внутри centriolar люмен, вдоль стены микротрубочек, или за пределами Центриоль.
Этот метод имеет преимущество для определения локализации специфических белков, которые могут быть трудно локализовать иначе из-за разнородных маркировки. Обратите внимание, что другие методы для сопоставления белков внутри centrioles были описаны в коррелятивных 3-D SIM/SMLM с, например, оценки конкретных направлений centrioles, определяя эллиптической профиль маркера, образуя Тор вокруг Центриоль у Вообразимый SIM. С помощью этого параметра, возможна локализация протеина с точностью до 4-5 Нм30. Обратите внимание, что метод, описанный здесь использует изолированное centrioles с нетронутыми procentrioles, знак того, что архитектура Центриоль скорее во многом сохраняется. Однако мы не можем исключать которые некоторые архитектурные особенности нарушается во время очистки, такие как диаметр Центриоль различной концентрации катионов двухвалентной как усиленный с изоляцией человека Центросома5.
Одним из важнейших шагов протокола, представленные здесь является получение достаточно концентрированной изолированных centrioles в различных ориентациях поддаются Fluo-спа. Чтобы сделать это, сначала обеспечить чистоту и эффективность процедуры изоляции Центриоль. Низкая концентрация изолированных centrioles будет препятствовать правильной визуализации и дальнейшей обработки изображений. Для этой цели мы предоставляем способ обогатить число centrioles в поле зрения. В зависимости от количества centrioles в фракции используется следует скорректировать объем загруженной в концентратор, объемом 250 мкл.
Важно отметить, что этот метод был разработан для клеточной стенки минус cw15-C. reinhardtii клетки. В этот штамм хрупкость клеточной стенки позволяет для надлежащего лизис клеток и, таким образом, освобождение его содержание. Этот протокол не является эффективным для одичал тип C. reinhardtii клетки, как клеточной стенки предотвращает надлежащего lysis. Альтернативные стратегии, такие как sonication или предварительной инкубации клеток с autolysin, фермента, который может ухудшить клеточной стенки31, придется положить в место для изменения клеточной стенки до применения Протокол изоляции, представленные здесь.
Эта настройка может использоваться с различными типами Микроскопы, начиная от обычных конфокальные микроскопы для высокой пропускной способности посвятил суперразрешением микроскопы. Обратите внимание, что при выполнении SMLM, Специальный буфер не требуется для правильной обработки изображений, и, таким образом, следует использовать камеру, адаптированные для coverslip 12 мм с буфером поверх coverslip. Последующие изображения будет выполняться с Перевернутый микроскопы. Если Микроскоп настройки не позволяют coverslip 12 мм, протокол, представленные здесь может применяться к 18 мм coverslips с помощью 30 мл трубки раунд дно и изменение адаптер и концентратор. Важно также, обратите внимание, что качество окончательной реконструкции в SMLM будет зависеть качество окрашивания и первичного антитела, используемые, а также метод фиксации.
Таким образом мы обеспечиваем метод, который может быть применен к изображению, а затем многочисленные centrioles Fluo-спа, который будет генерировать средние centrioles в различных ориентациях, тем самым помогая локализовать centriolar белка с точностью. Важно отметить, что этот метод может применяться в более общем изолированных centrioles от других видов, другие органеллы или для больших сборок высокомолекулярных соединений. Наконец подход подготовки образцов представлены здесь, в сочетании с последние разработки алгоритмов для анализа сингл частиц флуоресцентный SMLM данных32, может открыть дальнейшие улучшения в молекулярных картографии большой высокомолекулярных соединений сборки.

Центриоль является эволюционно сохранены органелл, который лежит в основе центросом в животных клетках и может выступать в качестве органа базальную (именуемый centrioles далее) реснички шаблон или жгутиков многих эукариот1,2. Таким образом centrioles имеют решающее значение для основных клеток биологические процессы, начиная от шпинделя Ассамблеи в ячейку сигнализации. Таким образом дефекты Центриоль Ассамблеи или функции были связаны с несколько человеческих патологий, в том числе рака и ciliopathies3.
Centrioles девятикратного, симметрично, микротрубочки, триплет-на основе цилиндрических структур, которые являются, как правило, ~ 450 нм длиной и ~ 250 Нм широкий4,5,6,7. Обычных электронной микроскопии и крио электронная томография centrioles от разных видов показали, что centrioles являются поляризованный вдоль их оси с трех различных регионов: проксимальный региона, центральное ядро и дистальной регион5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Важно отметить, что каждый из этих регионов отображает структурных особенностей. Во-первых в просвет проксимальных регионе 100 Нм Лонг содержит структуру колесом, подключенных к микротрубочек триплет через элемент булавочную головку12. Во-вторых, 300 – 400 Нм Лонг центрального региона содержит волокнистых плотности в просвет и структурные особенности вдоль внутренней стороны микротрубочек: Y-образный компоновщик, C-трубочку хвост и A-трубочку заглушки9. Наконец 50 – 100 Нм при дистальной части региона экспонатов югу дистальных и дистальной придатки, которые окружают дистальной частью Центриоль5,13.
За последние два десятилетия были отмечены открытия все большего числа centriolar белков, ведущих к текущей оценке около 100 различных белков, будучи частью Центриоль14,,1516, 17. Несмотря на эти достижения, точной локализации этих белков в пределах Центриоль остается недостижимым, особенно в рамках структурных субрегионов. Важно отметить, что назначение точной локализации структурных областей Центриоль имеет решающее значение для лучшего понимания их функции. В этой связи C. показало centrioles сыграли важную роль в обоих аспектах, первый делимитации различные структурные особенности вдоль цилиндра9,18,19, который затем позволяет Исследователи соотнести локализации подмножество белков с помощью флуоресцентной микроскопии к югу структурные области. Это включает в себя, например, белки, Bld12p и Bld10p, которые в частности локализовать в регионе проксимального отдела и в структуре колесом20,21,,22-23. Список каркаса локализованные белков также включает в себя POB15 и POC16, два Роман белков, выявленных по масс-спектрометрии, которые украшают внутреннее ядро центрального региона C. reinhardtii centrioles17.
Этот документ содержит полное описание метода, разработанного для изоляции и изображения C. показало centrioles для последующих суперразрешением микроскопии и сингл частиц в среднем. Для достижения этой цели, важно разграничить технические ограничения, которые необходимо преодолеть. Во-первых Центриоль очистки может повлиять на общую архитектуру, с колесом структуры, часто теряются на различных этапах изоляции9. Во-вторых размеры Центриоль очень близки дифракционный предел в оптической микроскопии. Действительно, латеральное разрешение, которое может быть получено в конфокальной микроскопии — около 200 nm24, похож на диаметр Центриоль и резолюции в z-оси идет о 2-3 x ниже, ведет к анизотропной тома. В-третьих неоднородность антитела маркировки и Центриоль ориентации может ограничить толкование необходимо локализовать белка в конкретных centriolar субрегионе. Наконец centrioles существует только две копии в клетку, что делает его трудно приобрести большое количество изображений и найти однозначный Центриоль ориентацию. Чтобы обойти эти технические вопросы, мы разработали метод, который основывается на применении суперразрешением микроскопия на большое число изолированных centrioles, которые принимают различные ориентации. Сначала мы опишем протокол для очистки C. показало centrioles, который позволяет очистки структурно нетронутыми centrioles и procentrioles, содержащие колесом. Затем мы опишем пошаговое протокол сосредоточиться centrioles на coverslips для образов обычными или суперразрешением флуоресцентной микроскопии. Этот важный шаг позволяет для увеличения числа centrioles, отображаемого в нескольких направлениях. Наконец мы будем описывать процедуры для выполнения одно частиц в среднем на данных, полученных на люминесцентные Микроскопы, что облегчает обнаружение centrioles в разных направлениях. Вообще этот метод может применяться для centrioles изображений из различных видов или других крупных макромолекулярных сборок.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioles являются большие макромолекулярных сборки, важное значение для надлежащего выполнения основных клеток биологических процессов, таких как деление клеток, клеток подвижности или сигнализации ячейки. Зеленые водоросли Хламидомонада показало оказался глубокий модели в исследовании Центриоль архитектуры, функции и состав белков. Несмотря на большие успехи в направлении понимания centriolar архитектуры один из текущих задач является для определения точной локализации centriolar компонентов в рамках структурных регионах Центриоль для того, чтобы лучше понять их роль в Центриоль биогенеза. Одним из основных ограничений заключается в резолюции микроскопии флуоресцирования, которая усложняет толкование локализации протеина в этой органелле с размерами недалеко от дифракционного предела. Чтобы решить этот вопрос, мы предоставляем способ очищения и изображения большое количество C. показало centrioles с различными ориентациями и использованием микроскопии суперразрешением. Эта техника позволяет дальнейшую обработку данных через флуоресцентные сингл частица усреднения (Fluo-спа) ввиду большого числа centrioles приобрел. FLUO-спа генерирует средние окрашенных centrioles C. показало в различных ориентациях, способствуя тем самым локализация различных белков в centriolar регионах. Важно отметить, что этот метод может применяться для centrioles изображения от других видов или других крупных макромолекулярных сборок.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Изоляция и флуоресценции изображений для одной частицы реконструкция Хламидомонада Centrioles

Мы разработали стратегию для очищения и большое количество centrioles в различных ориентациях поддаются суперразрешением микроскопии и одного частица усреднения изображений.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области центриола, такие как локализация белка в определенной области центриола. Основным преимуществом этой техники является то, что мы предоставляем средства для концентрации центриола, чтобы получить их в нескольких ориентациях. Хотя этот метод может дать представление о хламидомонах центриола биологии, он также может быть применен к другой системе, такие как изолированные человека и парамеций центриолах.Демонстрацией процедуры будет аспирант Николай Клена, еще одна аспирантка Maeva Le Guennec и постдок в лаборатории Давиде Гамбаротто. Чтобы начать эту процедуру, сначала подготовьте все средства массовой информации и культуры клеток C.Reinhardtii, как указано в текстовом протоколе. Перенесите подготовленные клетки на 50 миллилитровых конических трубок и центрифуга их в 600 раз г в течение 10 минут.Вымойте гранулы один раз с 50 миллилитров 1x PBS и спина клетки снова в 600 раз г в течение 10 минут. Используйте пипетку для повторного перерасхода гранул в 100 миллилитров буфера дефлагелляции комнатной температуры. Поместите стакан на магнитный мешалку и медленно добавьте 0,5 молярной уксусной кислоты к окончательному рН от 4,5 до 4,7.Пусть эта смесь инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут. После этого медленно добавить капли одного нормального гидроксида калия, чтобы восстановить рН до 7,0, передать клетки 50 миллилитров труб, и центрифуга их в 600 раз г в течение 10 минут, чтобы удалить любой отдельный флагелла. Откажитесь от супернатанта и храните гранулы на льду до готовности к мытью.Когда вы будете готовы, мыть гранулы в два раза с помощью 50 миллилитров 1x PBS при четырех градусах по Цельсию за стирку. Спин промывают гранулы на 600 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Повторное распределение гранул в 30 миллилитров 1x PBS.Затем медленно загрузите подвеску на 20 миллилитровую подушку 25%-ную сахарозу, не смешивая. Спин при 600 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут, чтобы удалить оставшиеся flagella и распространения клеток сахарозы. Используя аспиратор, тщательно аспирировать супернатант, сохраняя только самые нижние 20 миллилитров.Вымойте оставшуюся сахарозу, добавив 20 миллилитров холодного 1x PBS. Центрифуга при 600 раз g и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. Повторное распределение гранул в 10 миллилитров 1x PBS при четырех градусах по Цельсию, убедившись, что Есть нет сгустков в растворе.Перенесите перерасходную гранулу в новую бутылку с 250 миллилитров, добавьте буфер лиза, дополненный 5 000 единицами DNase, в бутылку, содержащую клетки. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа, в то время как смешивание каждые 15 минут, тщательно инвертирования бутылки. Передача лисированных клеток в 50 миллилитров конической трубки и центрифуги в 600 раз g и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут.Используя пипетку, соберите супернатант и загрузите его в 30 миллилитровую круглую нижнюю трубку на льду, содержащую два миллилитра 60%-ной подушки сахарозы. Центрифуга это при 10 000 раз г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После этого, аспирировать супернатант до одного миллилитра над подушкой сахарозы.Обратите внимание на желтый интерфейс между одним миллилитром оставшегося супернатанта и двумя миллилитров подушки сахарозы. Используя наконечник P1000, аккуратно смешайте оставшийся супернатант с сахарозой. Бассейн все подушки сахарозы и хранить их на льду.Затем приготовьте градиент сахарозы на 40%-70% в тонкостенной полипропилетовой трубке с 38,5 миллилитров, как указано в текстовом протоколе. Медленно загрузите объединяют интерфейсы в градиент. Сбалансировать трубки с буфером 10 миллимолярных K-PIPES и центрифугой в 68, 320 раз g и 4 градуса по Цельсию в течение 75 минут.После этого используйте 0,8-миллиметровую иглу, чтобы сделать отверстие в нижней части трубки, убедившись, что не беспокоить различных слоев сахарозы. Используйте это отверстие, чтобы собрать 12 500 фракций микролитров при четырех градусах цельсия. Используя наконечник P200, подготовьте дополнительные 10 микролитров алицитов из каждой фракции, которые будут использоваться во время иммунофторесценции.Затем, оснастки заморозить фракции в жидком азоте. Для начала поместите стерильный 12-миллиметровый крышку на утопленный нижний конец концентратора, убедившись, что держите сторону с покрытием PDL вниз. Поместите адаптер непосредственно на вершине, чтобы крышка крышки.Затем переверните круглую нижнюю трубку и поместите ее на концентратор, крышку и адаптер. Используя пинцет, осторожно нажмите ансамбль, пока он не достигнет нижней части трубки, а затем инвертировать трубку. Добавьте 10 миллимоляра буфера K-PIPES, пока он не достигнет верхней части концентратора.Убедитесь, что в центральном цилиндре концентратора нет пузырьков. Аккуратно добавьте 100 микролитров буфера 10 миллимолейных K-PIPES в одну из алицитов обогащенной центриолярной фракции и тщательно перемешайте с помощью пипетки P200. Затем удалите 100 микролитров буфера K-PIPES из полого центра концентратора и добавьте 100 микролитров смеси буферной фракции, убедившись, что содержимое остается в полом центре концентратора.Спин при 10 000 раз г в течение 10 минут в центрифуге, которая предварительно охлаждается до четырех градусов по Цельсию. После этого используйте пинцет для удаления концентратора. Вставьте устройство ручной работы в отверстие, присутствуюющее в прорези края адаптера и поднимите осторожно, чтобы восстановить крышку.Как только он достигает верхней части трубки, используйте перчаточный палец, чтобы поймать край адаптера и использовать пинцет, чтобы удалить крышку, памятуя о том, какая сторона крышки содержит центриолы. Затем выполняют фиксацию и иммунофлуоресценцию окрашивания концентрированных центриоля. Для начала инкубировать крышки с центриолами в подготовленной кристаллической полистирол передачи лабораторной коробке заполнены 100% метанола при минус 20 градусов по Цельсию в течение 5 минут.Используя пинцет, перенесите крышки в прозрачную лабораторную коробку, заполненную 50 миллилитров 1x PBS. Пусть слайды мыть в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем пипетки 60 микролитров первичного антитела смешиваются на кусок лабораторной герметизации обертывания в увлажненной камере.Аккуратно положите крышки поверх смеси антител с центриолесами, непосредственно обращенных к капле. Пусть крышки инкубируют в течение 45 минут. После этого снимите крышки и вымойте их в коробке, содержащей PBS в течение пяти минут.Инкубировать промывают крышки в течение 45 минут, со вторичными антителами в PBS 1%BSA и 0.05%Tween-20. Снимите крышки и мыть их в течение пяти минут в коробке, содержащей PBS. Используя обычную антиувядную среду монтажа, смонтировать крышку на слайде.Затем, изображение изолированных центриолях на конфокальных микроскопах на 63X нефтяной цели с N.A.of 1.4, при применении деконволюции. Навейте верхнюю и нижнюю позицию q-stack выше и ниже сигнала центриола, соответственно, и приобретете большой стек изображений, включающий общий центриоальный сигнал. Проецируйте стек и выполняйте усреднение одночастиц, как указано в текстовом протоколе.Представитель иммунофторесценции показывает, что шесть фракций обогащаются для изолированных центриолей, с пиком для фракции номер три, в то время как последние две фракции не являются, что свидетельствует о том, что очистка является успешной. Только около 30 centrioles увидены в поле зрения без концентратора, пока 183 увидены с концентратором. Это свидетельствует о том, что шаг концентратора является успешным и позволяет в шесть раз обогащать центриоля в определенном регионе, что облегчает их обнаружение и изображение.Микроскопия супер-разрешения затем используется для изображения центриолов, окрашенных для monoglutamylated тубулина, и программное обеспечение используется для создания почти идеального среднего для каждой выбранной ориентации. После пяти итераций были созданы два класса средних моноглутамилированных центриолов: вид сверху с 63 объектов и вид сбоку от 98 частиц. Длина среднего класса бокового вида составляет 260 нанометров диаметром 250 нанометров, что сопоставимо с измеренным моноглутамилированным тубулином сигналом, который, как видно, локализуется в ядре центриола.При выполнении этой процедуры, важно помнить, чтобы сохранить изолированный центриоле на льду и оснастки заморозить их после изоляции. После этой процедуры, другой метод, как криоэлектронная микроскопия и масс-спектрометрия может быть выполнена для того, чтобы ответить на дополнительный вопрос, такие как родная архитектура центриола или состав белка центриола.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Спаривание и Тетрада Разделение Chlamydomonas reinhardtii Для генетического анализа

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Родился Нормализация для флуоресцентной оптической томографии для проекции изображений Всего Сердца

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Метод измерения Вирусный Кинетика Fusion на одном уровне частиц

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Мезоскопические флуоресцентная томография для В естественных условиях Изображений развивающихся Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Покадровый Визуализация Митоз После трансфекции миРНК

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Одной частицы электронной микроскопии Реконструкция комплекса Exosome Использование случайных Коническая Метод Tilt

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis и Микроманипуляция для Прижизненное флуоресценции микроциркуляции

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Работа с изображениями и 3D Реконструкция Цереброваскулярные структур в эмбриональных данио рерио

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Экспресс-анализ и разведка флуоресцентной микроскопии Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Флуоресценции изображений с Один-нм Точность (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...