Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
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Agradecemos a Pierre Gönczy Bioimagen y plataforma óptica (BIOP) en el École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausana, Suiza, donde se adquirieron las imágenes SIM de los centríolos. Nikolai Klena y Davide Gambarotto cuentan con la beca a partir de Consejo Europeo de investigación (CEI) (StG) 715289 (acento) y Maeva Le Guennec, Paul Guichard y Virginie Hamel por la PP00P3_157517 de la Fundación de ciencia nacional suizo (FNS). Susanne Borgers es apoyado por la Universidad de Ginebra.

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Los autores no tienen nada que revelar.

Uno de los retos en biología es descifrar la localización precisa de las proteínas en un contexto arquitectónico. El centriolo es una estructura ideal para aplicar estos métodos, ya que su arquitectura ha sido estudiada usando la tomografía del cryo-electrón, revelando características ultraestructurales interesantes a lo largo de su longitud. Sin embargo, debido a sus dimensiones cerca del límite de resolución en microscopía óptica, es difícil localizar precisamente una proteína por inmunofluorescencia en una región estructural del centriolo usando microscopios convencionales30.
La resolución en microscopía óptica está limitada por la difracción de la luz que da, aproximadamente, una resolución lateral máxima de 200 nm en microscopía óptica24. Sin embargo, este límite ha sido desviado por uno de los principales avances de los últimos 20 años en microscopía óptica: la invención de los métodos de súper resolución. Estos enfoques pueden obtener imágenes más allá de los límites de la difracción en diferentes resoluciones: 120 nm para SIM, alrededor de 50 nm para agotamiento estimulante de la emisión (STED) y 20 – 40 nm para la localización de una sola molécula de microscopía (SMLM)24. Con estos nuevos desarrollos de la microscopía de superresolución, las subregiones estructurales del centriolo son alcanzables. Sin embargo, en la práctica, es todavía difícil determinar con precisión la localización de una proteína a un elemento estructural para la razón principal que los centríolos madurados existen sólo 2 copias por célula y orientaciones al azar, que hace que la interpretación de localización difícil. Por esta razón, un protocolo se estableció que permite a los investigadores a la imagen de súper-resolución un gran número de centriolos, aumentando la posibilidad de observar orientaciones no ambigua. Lo importante es que, como este método se basa en el uso de aislada centríolos, nos proporciona un método para purificar intacto C. reinhardtii centriolos que contienen centriolos madurados y procentrioles.
Finalmente, debido a la gama de orientaciones centriolo que puede ser reflejada con este protocolo, análisis de la solo-partícula pueden ser aplicado usando microscopia electrónica software. Esto resulta en la generación de clases promedio de centriolos en una orientación particular. Lo importante, entonces pueden utilizarse estas imágenes 2-D para evaluar la localización de una proteína específica en el centriolo. De hecho, este método puede aplicarse a imágenes de resolución súper doble color y un color puede usarse para revelar el esqueleto de centriolo (p. ej., tubulina), mientras que el otro color puede ser atribuido a una proteína específica de centriolar. Restando los promedios obtenidos con un color o dos colores, es más fácil registrar una proteína en el centriolo (proximal, central y distal). Tenga en cuenta que los dos canales deben estar alineados con precisión para evitar cualquier interpretación equívoca. Por otra parte, promedios de vistas superior ayudará a descifrar si una proteína se localiza dentro del lumen centriolar, a lo largo de la pared del microtúbulo, o fuera del centriolo.
Este método tiene la ventaja de determinar la localización de proteínas específicas que puede ser difícil de localizar lo contrario debido a la heterogénea de etiquetado. Tenga en cuenta que otros métodos para asignar las proteínas dentro de los centriolos se han descrito en correlativo 3D SIM/SMLM con, por ejemplo, evaluar las orientaciones específicas de los centríolos determinando el perfil elíptico de un marcador formando un toro alrededor de la centriolo por proyección de imagen de SIM. Utilizando este parámetro, es posible localizar la proteína con una precisión de 4 – 5 nm30. Observe también que el método descrito aquí utiliza aisladas centríolos con procentrioles intacta, una señal de que la arquitectura del centriolo es probablemente en gran parte conservado. Sin embargo, no podemos excluir que algunas de las características arquitectónicas son alterados durante la purificación, como el diámetro del centriolo que varían con la concentración de cationes divalentes como amplificado con el aislamiento del centrosoma humano5.
Uno de los pasos críticos del protocolo presentado aquí es obtener lo suficientemente concentrados aisladas centríolos en diferentes orientaciones susceptibles de Fluo-SPA. Para ello, primero asegurar la pureza y la eficacia del procedimiento de aislamiento de centriolo. Una baja concentración de aislada centríolos evitará la proyección de imagen adecuada y más procesamiento de imágenes. Para ello, nos proporciona un método para enriquecer el número de centriolos por campo de visión. Dependiendo del número de centríolos en la fracción que se usa, debe ajustarse el volumen cargado en el concentrador de oxígeno, con un volumen máximo de 250 μl.
Lo importante, este método ha sido desarrollado para una pared de célula menos células cw15 C. reinhardtii . En esta variedad, la fragilidad de la pared celular permite una adecuada lisis de las células y, por tanto, la liberación de su contenido. Este protocolo no es eficaz para el tipo salvaje C. reinhardtii de las células, como la pared celular previene una lisis adecuada. Estrategias alternativas como sonicación o preincubación de las células con AUTOLISINA, una enzima que puede degradar la pared celular31, tendría que poner en marcha para alterar la pared celular antes de aplicar el protocolo de aislamiento presentado aquí.
Esta configuración puede utilizarse con diferentes tipos de microscopios, desde microscopios confocales convencionales para microscopios de súper resolución de alto rendimiento dedicado. Tenga en cuenta que al hacer el SMLM, un buffer especial se requiere para la adecuada proyección de imagen y, por lo tanto, debe utilizarse una cámara adaptada a un cubreobjetos de 12 mm con el tampón sobre el cubreobjetos. La proyección de imagen posterior se realizará con microscopios invertidos. Si la configuración del microscopio no permite un cubreobjetos de 12 mm, el protocolo presentado aquí puede aplicarse a 18 mm cubreobjetos usando un tubo de fondo redondo de 30 mL y un adaptador modificado y concentrador. También es importante a la nota que la calidad de la reconstrucción final en SMLM dependerá de la calidad de la tinción y el anticuerpo primario utilizado, así como el método de fijación.
En Resumen, estamos proporcionando un método que puede aplicarse a la imagen numerosos centriolos seguidos por Fluo-SPA que generará promedios de centriolos en diversas orientaciones, lo que ayuda a localizar la proteína centriolar con precisión. Lo importante, este método puede aplicarse más generalmente aisladas centríolos de otras especies, a otros orgánulos o grandes asambleas macromoleculares. Por último, el enfoque de preparación de la muestra presentó aquí, combinado con el reciente desarrollo de algoritmo para el análisis de la solo-partícula fluorescente SMLM datos32, podría abrir aún más mejoría en la cartografía molecular de grandes macromoléculas Asambleas.

El centriolo es un orgánulo evolutivamente conservado que se encuentra en el centro del centrosoma en células animales y puede actuar como un cuerpo basal (denominado centriolos en adelante) cilios de plantilla o flagelos en muchos eucariotas1,2. Como tal, centríolos son críticos para los procesos biológicos que van desde el montaje del huso a la célula de señalización célula fundamental. Por lo tanto, defectos en la Asamblea de centriolo o función han sido asociados con varias patologías humanas, incluyendo cáncer y ciliopathies3.
Centriolos son nueve veces, simétrico, estructuras cilíndricas que basado en tripletes de microtúbulos son, típicamente, ~ 450 nm de largo y 250 nm ancho4,5,6,7. La microscopia electrónica convencional y tomografía del cryo-electrón de centriolos de diferentes especies han revelado que los centriolos están polarizados a lo largo de su eje largo con tres regiones distintas: una región proximal, un núcleo central y una región distal5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. lo importante es que, cada una de estas regiones muestra características estructurales específicas. En primer lugar, la luz de la región proximal de 100 nm de largo contiene la estructura de cartwheel conectada a la tripleta de microtúbulos a través de la cabeza de alfiler elemento12. En segundo lugar, la región central de 300-400 nm de largo contiene densidades fibrosas en el lumen y características estructurales a lo largo de la cara interior de los microtúbulos: el vinculador en forma de Y, la cola de C túbulo y el túbulo A tropiezan9. Por último, la región distal de 50 – 100 nm exhibe el distales y distales apéndices que rodean la parte distal del centriolo5,13.
Las dos últimas décadas se han caracterizado por el descubrimiento de un número creciente de proteínas centriolar, conduce a una estimación actual de cerca de 100 proteínas distintas, siendo parte del centriolo14,15,16, 17. a pesar de estos avances, la localización precisa de estas proteínas en el centriolo sigue siendo evasiva, particularmente dentro de las subregiones estructurales. Lo importante, asignar una localización precisa a regiones estructurales del centriolo es crucial para una mejor comprensión de su función. En este sentido, C. reinhardtii centriolos han sido instrumentales en ambos aspectos por primera permitiendo delimitar las características estructurales diferentes a lo largo del cilindro9,18,19, que permitió investigadores establecer una correlación entre la localización de un subconjunto de proteínas usando microscopia fluorescente a una región sub-estructurales. Esto incluye, por ejemplo, las proteínas Bld12p y Bld10p, que se localiza en la región proximal y en la estructura del cartwheel en particular20,21,22,23. La lista de las proteínas estructura localizada también incluye POB15 y POC16, dos nuevas proteínas identificadas por espectrometría de masas que adornan la región núcleo central interno de C. reinhardtii centriolos17.
Este documento proporciona una descripción completa del método desarrollado para aislar y la imagen de C. reinhardtii centríolos para la posterior super-resolución microscopía y con un promedio de la solo-partícula. Para lograr este objetivo, es importante delimitar las limitaciones técnicas que deben ser superados. En primer lugar, purificación del centriolo puede afectar la estructura general, con la estructura de la voltereta a menudo se pierden durante las diferentes etapas de aislamiento9. En segundo lugar, las dimensiones de lo centriolo son muy cerca del límite de difracción en microscopía óptica. De hecho, la resolución lateral que se puede obtener en la microscopía confocal es alrededor de 200 nm24, similar al diámetro del centriolo y la resolución en el z-eje es acerca de 2 – 3 x menor, llevando a un volumen anisotrópico. En tercer lugar, la heterogeneidad del anticuerpo etiquetado y centriolo orientación podría limitar la interpretación necesaria para localizar una proteína en una específica región centriolar. Finalmente, en sólo dos copias por célula, lo que hace difícil adquirir un gran número de imágenes y encontrar una orientación inequívoca centriolo existen centríolos. Para evitar estos problemas técnicos, hemos desarrollado un método que se basa en la aplicación de la microscopia de la estupendo-resolución en gran número de aislada centríolos que adoptar varias orientaciones. Primero vamos a describir un protocolo para purificar C. reinhardtii centriolos que permite la purificación de centriolos estructuralmente intactos y procentrioles que contiene el cartwheel. A continuación, describimos un protocolo paso a paso para concentrarse los centriolos de cubreobjetos para la proyección de imagen por convencional o microscopia fluorescente súper resolución. Este paso importante permite aumentar el número de imágenes en múltiples orientaciones de centriolos. Por último, describiremos un procedimiento para realizar la solo-partícula promedio en los datos adquiridos en microscopios fluorescentes que facilita la detección de centriolos en diferentes orientaciones. En conjunto, este método puede aplicarse a centriolos imagen de varias especies u otros grandes ensamblajes macromoleculares.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centriolos son grandes ensamblajes macromoleculares importantes para la correcta ejecución de los procesos biológicos fundamentales de la célula como división celular, la motilidad celular señalización celular. El alga verde Chlamydomonas reinhardtii ha demostrado para ser un modelo profundo en el estudio de arquitectura del centriolo, función y composición proteica. A pesar de grandes avances hacia la arquitectura centriolar comprensión, uno de los retos actuales es determinar la localización exacta de componentes centriolar dentro de las regiones estructurales del centriolo con el fin de entender mejor su papel en la Biogénesis del centriolo. Una limitación importante se encuentra en la resolución de la microscopía de fluorescencia, lo que complica la interpretación de la localización de la proteína en este organelo con dimensiones cerca del límite de difracción. Para abordar esta cuestión, estamos proporcionando un método para purificar e imagen de un gran número de C. reinhardtii centriolos con orientaciones diferentes usando microscopia de la estupendo-resolución. Esta técnica permite el posterior procesamiento de datos a través de fluorescentes solo-partícula promedio (Fluo-SPA) debido a la gran cantidad de centriolos adquirido. Fluo-SPA genera promedios de manchado C. reinhardtii centriolos en diferentes orientaciones, facilitando así la localización de distintas proteínas en subregiones centriolar. Lo importante, este método puede aplicarse a centriolos imagen de otras especies o de otros grandes ensamblajes macromoleculares.

C. reinhardtii centriolo aislamiento: Para aislar centriolos, cw15- C. reinhardtii células fueron cultivadas en cultivo líquido durante varios días bajo luz y peleteadas posteriormente por centrifugación a 600 x g por 10 min pellet las células fueron lavadas 1 x con PBS y resuspendidos en un deflagellation antes de búfer deflagellation realizando un shock de pH con ácido acético de 0,5 M a un pH final de 4.5 – 4.7 por 2 min(figura 1). Una adición de 1 KOH de N se utilizó para restaurar el pH a 7.0. Para separar flagelos separadas de cuerpos de la célula, las células deflagellated primero se centrifugaron para eliminar la mayor parte de los flagelos. El pellet fue lavado x 2 con PBS y resuspendió en 30 mL de PBS antes de cargar lentamente sobre un colchón de sacarosa al 25% (figura 1B). El tubo fue hecho girar a 600 x g durante 15 min a 4 ° C para eliminar la mayor parte de los flagelos separadas. Después de la centrifugación, los cuerpos celulares en el cojín de sacarosa (figura 1C) y recuperados por quitando los aproximadamente 30 mL de sobrenadante (hasta la flecha roja en la figura 1C). La resultante 20 mL de células lavadas luego se resuspendió en 20 mL de PBS frío y centrifugar a 600 x g por 10 min. A continuación, se descartó el sobrenadante y las células completamente se resuspendió en 10 mL de PBS. Las células se transfirieron a un frasco de 250 mL y el tampón de lisis se añadió a las células resuspendidas a la vez. DNasa fue agregado a la lisis y se incubó por 1 h a 4 ° C. Después de un paso de centrifugación para eliminar restos celulares (véase la pelotilla blanca en figura 1D), el sobrenadante fue recogido y cargado con cuidado sobre un colchón de sacarosa al 60% de 2 mL antes de centrifugar a 10.000 x g por 30 min a 4 ° C. Tenga en cuenta que para 100 mL de lisis, 8 tubos de 15 mL se usa para realizar este paso, correspondiente a 12,5 mL de tampón de lisis en 2 mL de sacarosa por el tubo. Después de la centrifugación, se eliminó la mayor parte del sobrenadante a 1 mL por encima del cojín. 1 mL de sobrenadante restante fue recogido con el cojín de 2 mL y luego mezclado y agrupada para obtener un volumen final de 24 mL. La piscina entonces fue cargada en un 40%, 50%, 70%-sacarosa degradado y centrifugada a 68.320 x g durante 1 h y 15 min a 4 ° C. Finalmente, se recolectaron los aislada centríolos haciendo un agujero en la parte inferior del tubo de centrifugación con una aguja y las gotas fueron recolectadas en fracciones de 12 x 500 μl. Debido a la alta densidad de la sacarosa diferentes, la gota formada muy lentamente al principio (70% de sacarosa) y luego más rápidamente (40% de sacarosa).
Inmunofluorescencia de aislada centríolos Para evaluar la calidad del procedimiento de aislamiento, 10 μl de cada fracción recogida de gradiente se centrifugó entonces en un cubreobjetos usando un cubreobjetos soporte adaptador (figura 2A-2D). Importante, para quitar con seguridad el cubreobjetos, diseñó un dispositivo gancho personalizado (figura 2B). A continuación, los cubreobjetos se analizaron por inmunofluorescencia. En este estudio se utilizaron anticuerpos contra CrSAS-6(Bld12p) para indicar la presencia de la estructura de cartwheel y α-tubulina (DMA1) para destacar la pared centriolar. Contando el número de centriolos que eran positivas para CrSAS-6 y α-tubulina por campo de visión y luego calculando el número total de centriolos por fracciones, fue posible determinar qué fracciones se enriquecieron para aislada centríolos ( Figura 2F-2 H). Curiosamente, 6 fracciones se enriquecieron de centriolos (figura 2F y 2 G, fracciones #1 – 6), con un pico de fracción #3, mientras que las últimas fracciones no eran, lo que indica que la purificación trabajado. Tenga en cuenta que en este experimento particular, 95% de los centríolos total eran positivo para CrSAS-6 y α-tubulina en fracción #3. Esto indica que más aisladas centríolos conservan sus volteretas. Si no hay enriquecimiento de centriolos se observa en la primera fracción, el procedimiento de aislamiento no funciona y debe repetirse. Tenga en cuenta que algunas piezas flagelares pueden observarse principalmente en las fracciones carece de centriolos.
A continuación, para calcular el número total de centriolos por μl, el número de centriolo por campo de visión debe ser multiplicado por la relación que se presenta en la figura 2H. Entonces, el número resultante se debe dividir por el volumen de la fracción se usa para la inmunofluorescencia para obtener el número de centriolos por μl. En este procedimiento de aislamiento especial, la fracción más enriquecida contiene centriolos cerca de 37 para un área de 0,00846 mm2 (con un campo de visión de 92 x 92 μm2). La superficie de la sección del tubo era 7,5 mm de radio con una superficie total de 176 mm2. La proporción correspondiente fue entonces 176/0.00846 = 20,803.8, hasta un total de 769.740 centriolos (37 x 20, 803.8) en 10 μl. Por lo tanto, el número de centriolos en 1 μl fue 76.974.
Concentración de aislada centríolos en cubreobjetos: Aumentar el número de centriolos por campo aumenta la posibilidad de detectar orientación inequívoca centriolo, así como aumentando la posibilidad de detectar orientaciones similares que pueden ser utilizados para otros procedimientos promedio de partícula. Centriolos de las fracciones concentradas son aún escasos en el cubreobjetos, desarrollamos un accesorio de centrifugación para concentrar centríolos en el cubreobjetos (figura 3A) nombrada de un concentrador. Tenga en cuenta que un archivo .stl con las medidas precisas para la impresión 3D está provisto de este manuscrito.
En primer lugar, un cubreobjetos de 12 mm se montó en el concentrador (figura 3B). El adaptador se coloca encima el cubreobjetos y el tubo de fondo redondo fue invertido y coloca sobre el adaptador montado y concentrador. El tubo de fondo redondo fue entonces ligeramente invertido, permitiendo la carga de la muestra (Protocolo paso 4.2). Los centriolos luego se centrifugaron a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C. Después de eso, los centríolos fueron sometidos a inmunofluorescencia y manchados de CrSAS-6/Bld12p y α-tubulina (figura 3-3E). Lo importante, sin concentrador, centriolos cerca de 30 fueron considerados por el campo visual (figura 3C), mientras que 183 centríolos fueron vistos por campo de visión cuando el concentrador fue utilizado (figura 3D-3F). Tenga en cuenta que los centríolos cubrieron sólo un disco de 4 mm de diámetro en el centro del cubreobjetos. Este resultado demuestra que el paso de la concentración funciona y permite un 6-fold enriquecimiento de centriolos en una región definida de cubreobjetos, así facilitando su detección y proyección de imagen.
Solo-partícula fluorescente promedio de aislados C. reinhardtii centriolos: Aquí, usando microscopía SIM que puede llegar a una resolución de cerca de 120 nm, centríolos manchados para la tubulina de monoglutamylated (GT335, figura 4), una modificación de la tubulina en microtúbulos centriolar, fueron imagen24. C. reinhardtii centriolos son alrededor de 500 nm largo, siempre en pares y a menudo encontrado con asociados, recientemente duplicar órganos probasal (denominados procentrioles en adelante) y estriado de las fibras de microtúbulos asociados19. Por lo tanto, esta Asamblea final era grande cerca de 1 μm. Por esta razón y para los centriolos en su totalidad la imagen, recomendamos adquirir un Z-stack en los aislada centríolos.
Aquí, después de la adquisición, se genera una imagen final mediante la realización de una proyección de intensidad máxima con ImageJ28 (proyección de la intensidad del proyecto imagen/pilas/Z/max, figura 4B). De este tipo de imágenes, se realizó un análisis de la solo-partícula utilizando el software de la microscopia del cryo-electrón para hacer clases de centriolos con orientaciones similares, y luego un promedio fue realizado. Para ello, el color de la imagen primero fue invertido con el fin de visualizar mejor los objetos (figura 4C). Centríolos fueron seleccionadas manualmente en una caja centrada sobre cada partícula usando el libremente disponible de software Scipion29 que integra varios programas microscopia electrónica tales como Xmipp3 (figura 4D). Tenga en cuenta que el tamaño de la caja tiene que ser definido por el usuario. Aquí, en cajas de 50 x 50 píxeles para un tamaño de píxel de 31.84 nm fueron utilizados. A continuación, todas las partículas fueron extraídos (figura 4E) y alineado con Xmipp3 (figura 4F). A continuación, se aplicó una máscara circular de 12 píxeles de radio para aislar cada centriolo del par centriolar (figura 4G). Las partículas entonces se clasificaron, usando Xmipp3, para generar varios promedios. Sólo se mantuvieron promedios de clase homogénea, lo que significa que las partículas que difieren de los promedios de la clase fueron excluidas manualmente. Este paso se repitió con el fin de generar un promedio casi perfecto para cada orientación solicitada. Después de cinco iteraciones, se generaron dos tipos de medias: una vista superior de 63 objetos (figura 4H) y una cara visión desde 98 partículas (figura 4) de monoglutamylated centriolos. Se determinaron las dimensiones del objeto por medir la distancia entre picos del perfil del terreno de intensidad a lo largo de la señal de monoglutamylation.
Importante, la longitud de la media de la clase de vista lateral es de 260 nm con un diámetro de 250 nm, comparable a la señal de la tubulina de monoglutamylated medida que fue demostrada para localizar a una región de 286 ± 33 nm de longitud dentro de la base del centriolo17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> Figura 1 : Purificación de la C. reinhardtii centriolos. (A) es una representación esquemática de cada paso que conduce al aislamiento de C. reinhardtii centriolos. Incluye pasos representativos del Protocolo (B) antes y (C) después de la centrifugación en gradiente de sacarosa al 25%. La flecha roja en el panel C indica el volumen mínimo para mantener después de la centrifugación. (D) este panel muestra la pelotilla blanca de las células sometidas a lisis después de la centrifugación. La flecha negra indica la pelotilla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> Figura 2 : Instalación de centrifugación para realizar inmunofluorescencia en aislada centríolos. (A) 10 μl de cada fracción recogida se diluye primero en 100 μl de K-tubos de 10 mM (pH 7.2). (B) es una representación esquemática de los dispositivos de centrifugación, que comprende un tubo de 15 mL fondo redondo, un cubreobjetos de 12 mm, un adaptador para el cubreobjetos y un dispositivo enganchado a la medida para recuperar el cubreobjetos después de la centrifugación. Los paneles C y D muestran dibujos explicando cómo recuperar el cubreobjetos después de la centrifugación. (C) Coloque la herramienta de forma de gancho en el agujero presente en el borde ranurado del adaptador y (D) Tire suavemente. (E) estas son fotos de la cámara húmeda necesitado para realizar la proyección de imagen de la inmunofluorescencia. La flecha indica el cubreobjetos de 12 mm. (F) Estos son representativas imágenes confocales 63 X (zoom 2) fracciones degradados #1-8, recogidos durante el proceso de purificación y mancharon para CrSAS-6 (rojo) y la α-tubulina (verde). Los márgenes corresponden a la región indicada por un cuadro blanco en las vistas de ampliación más bajos. Barra de escala = 10 μm. (G) este es un gráfico que representa el número de positivos de centriolos CrSAS-6 y α-tubulina por campo de visión en cada fracción. Tenga en cuenta el enriquecimiento en fracciones #1-6. El número promedio de centriolos por campo en cada fracción: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37.0 ± 17.0, #4 = 23,3 ± 11.4, #5 = 14.3 ± 2.1, #6 = ± 13.7 9.3, #7 = 2.7 ± 1.2, #8 = 1,0 ± 0.0, #9 = 1,0 ± 0.0, #10 = ± 0.0 0.0, #11 = 0,3 ± 0,6, #12 = ± 0.0 0.0. Para cada fracción, 3 campos al azar fueron reflejados. Tenga en cuenta que, cuando cuenta la fracción más enriquecida #3, encontramos que el 95% de los centriolos son positivo para CrSAS-6 y α-tubulina (n = 205 centriolos). (H) A proporción del número de centríolos presentes en el área de medición de las micrografías se utiliza para calcular el número total de centríolos presentes en la zona del tubo. El número de centriolo por μl puede calcularse de las fracciones μl originalmente se centrifugó 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> Figura 3 : Aisladas centríolos son centrifugadas utilizando concentradores de. (A) este panel muestra los dispositivos de centrifugación necesarios concentrar centriolos en cubreobjetos antes de inmunofluorescencia, incluyendo un tubo de 15 mL fondo redondo, un concentrador, un cubreobjetos de 12 mm y un aparato adaptador de soporte. (B) este panel muestra los pasos para montar el aparato de centrifugación. C-E los paneles muestran imágenes confocales de teñido para CrSAS-6 (rojo) o α-tubulina (verde) (C) sin (D-E) con el concentrador de centriolos. Los márgenes corresponden a la región indicada por un cuadro blanco en las vistas de ampliación más bajos. La barra de escala es 10 μm. Nota que centriolos están enriquecidos en el centro del cubreobjetos (la línea punteada representa la frontera de la zona concentrada). (F) esta gráfica representa el número de centriolos por campo de visión sin y con el concentrador. Se analizaron al azar cinco campos de vista. Es el número promedio de centriolos, sin concentrador, 29,8 ± 2.9 y con el concentrador, 182.6 ± 11.5, P < 0.0001. La significación estadística fue determinada por un impar t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> Figura 4 : Promedio de la solo-partícula en aislados C. reinhardtii centriolos. (A) este panel muestra Z pila imágenes de centriolos teñidas con GT335 y adquirido utilizando un microscopio SIM. (B) estos paneles muestran una proyección de intensidad máxima Z de las imágenes apiladas. Barra de escala = 1 μm. (C) estos paneles muestran una imagen representativa con un contraste invertido. El recuadro representa un zoom-in para visualizar los centriolos mejor. (D) estas partículas de Mostrar paneles de recolección. El recuadro indica cómo fueron seleccionadas las partículas. (E) son ejemplos de 5 extraídas las partículas. (F) este panel muestra las partículas después de la alineación. (G) este panel muestra las partículas después de aplicar una mascarilla. Paneles de H y muestran dos medias de la clase: (H) una tapa vista (partículas de 63) y () una vista lateral (98 partículas). Las dobles flechas indican las dimensiones de la señal GT335. Barra de escala = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 
Archivo complementario 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo complementario 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Aislamiento y la proyección de imagen de fluorescencia para la reconstrucción de la solo-partícula de Chlamydomonas centriolos

Hemos desarrollado una estrategia para purificar y un gran número de centriolos en susceptibles para la microscopía de superresolución y solo-partícula promedio de diferentes orientaciones de la imagen.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo centriole, como la localización de proteínas en una región específica del centriole. La principal ventaja de estas técnicas que proporcionamos los medios para concentrar centriole para conseguirlas en múltiples orientaciones. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología centriole de Chlamydomonas, también se puede aplicar a otro sistema, como los centrioles humanos aislados y del paramecium.Demostrando el procedimiento estarán Nikolai Klena, estudiante de doctorado Maeva Le Guennec, y el postdoc en el laboratorio Davide Gambarotto. Para comenzar este procedimiento, primero prepare todos los medios y la cultura de las células C.Reinhardtii como se describe en el protocolo de texto. Transfiera las células preparadas a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugarlas a 600 g durante 10 minutos.Lavar el pellet una vez con 50 mililitros de 1x PBS y girar las células de nuevo a 600 g durante 10 minutos. Utilice una pipeta para resuspender el pellet en 100 mililitros de tampón de deflaglación a temperatura ambiente. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y agregue lentamente 0,5 molar ácido acético a un pH final de 4,5 a 4,7.Dejar incubar esta mezcla a temperatura ambiente durante dos minutos. Después de esto añadir lentamente gotas de un hidróxido de potasio normal para restaurar el pH a 7.0, transferir las células a tubos de 50 mililitros, y centrifugarlas a 600 veces g durante 10 minutos, para eliminar cualquier flagelo separado. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet sobre hielo hasta que esté listo para lavar.Cuando esté listo, lave el pellet dos veces con 50 mililitros de 1x PBS a cuatro grados centígrados por lavado. Gire el pellet lavado a 600 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Resuspender el pellet en 30 mililitros de 1x PBS.A continuación, cargue lentamente la suspensión en un cojín de 20 mililitros de 25% de sacarosa, sin mezclar. Gire a 600 veces g y cuatro grados celsius durante 15 minutos para eliminar cualquier flagelo restante y extender las células en la sacarosa. Usando un aspirador, aspira cuidadosamente el sobrenadante manteniendo sólo los 20 mililitros más abajo.Lave la sacarosa restante añadiendo 20 mililitros de PBS frío 1x. Centrifugar a 600 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Resuspender el pellet en 10 mililitros de 1x PBS a cuatro grados Celsius, asegurándose de que no haya grumos en la solución.Transfiera el pellet resuspendido a una nueva botella de 250 mililitros, agregue el tampón de lysis, complementado con 5.000 unidades de DNase, al frasco que contiene las células. Incubar a cuatro grados centígrados durante una hora, mientras se mezcla cada 15 minutos invirtiendo cuidadosamente la botella. Transfiera las células de lesed a un tubo cónico de 50 mililitros y centrífuga a 600 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.Con una pipeta, recoja el sobrenadante y cárguelo en un tubo de fondo redondo de 30 mililitros sobre hielo que contenga dos mililitros de 60% de cojín de sacarosa. Centrifuga esto a 10.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de esto, aspirar el sobrenadante hasta un mililitro por encima del cojín de sacarosa.Observe la interfaz amarilla entre el mililitro de sobrenadante restante, y los dos mililitros de cojín de sacarosa. Con una punta P1000 cortada, mezcle suavemente el sobrenadante restante con la sacarosa. Agrupa todos los cojines de sacarosa y guárdalos en hielo.A continuación, prepara un gradiente de 40% a 70% de sacarosa en un tubo de polipropileno de 38,5 mililitros de paredes delgadas como se describe en el protocolo de texto. Cargue lentamente las interfaces agrupadas en el degradado. Equilibre los tubos con el tampón K-PIPES de 10 mililitros y centrifugar a 68, 320 veces g y cuatro grados Celsius durante 75 minutos.Después de esto, utilice una aguja de 0,8 milímetros para hacer un agujero en la parte inferior del tubo, asegurándose de no molestar a las diferentes capas de sacarosa. Utilice este agujero para recoger 12 fracciones de microlitro a cuatro grados centígrados. Con una punta P200 cortada, prepare una alícuota adicional de 10 microlitios de cada fracción que se utilizará durante la inmunofluorescencia.A continuación, congele las fracciones en nitrógeno líquido. Para comenzar, coloque un cubreobjetos estéril de 12 milímetros en el extremo inferior empotrable del concentrador, asegurándose de mantener el lado recubierto de PDL hacia abajo. Coloque el adaptador directamente en la parte superior, para tapar el cubreobjetos.A continuación, invierta el tubo de fondo redondo y colóquelo sobre el concentrador, el cubreobjetos y el adaptador. Usando pinzas, empuje suavemente el conjunto hasta que llegue a la parte inferior del tubo, y luego invierta el tubo. Agregue 10 milímetros de tampón K-PIPES hasta que llegue a la parte superior del concentrador.Asegúrese de que no haya burbujas en el cilindro central del concentrador. Agregue suavemente 100 microlitros de 10 tampones K-PIPES mililares a una de las alícuotas de la fracción centriolar enriquecida y mezcle a fondo con una pipeta P200. A continuación, retire 100 microlitros de tampón K-PIPES del centro hueco del concentrador y agregue 100 microlitros de la mezcla de fracción de búfer, asegurándose de que el contenido permanezca en el centro hueco del concentrador.Gire a 10.000 veces g durante 10 minutos en una centrífuga que se enfríe previamente a cuatro grados centígrados. Después de esto, utilice pinzas para quitar el concentrador. Inserte un dispositivo enganchado a mano en el orificio presente en el borde ranurado del adaptador y levante suavemente para recuperar el cubreobjetos.Una vez que llegue a la parte superior del tubo, utilice un dedo enguantado para atrapar el borde del adaptador y utilice pinzas para quitar el cubreobjetos, teniendo en cuenta qué lado del cubreobjetos contiene centrioles. A continuación, realice la fijación y la tinción de inmunofluorescencia de los centrioles concentrados. Para empezar, incubar los cubreobjetos con los centrioles en la caja de laboratorio de transmisión de poliestireno de cristal preparada llena de 100% metanol a menos 20 grados centígrados durante 5 minutos.Con pinzas, transfiera los cubreobjetos a una caja de laboratorio transparente llena de 50 mililitros de 1x PBS. Deje que los portaobjetos se laven en el PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, pipetear 60 microlitros de anticuerpo primario se mezclan en una pieza de envoltura de sellado de laboratorio en una cámara humidificada.Coloque cuidadosamente los cubreobjetos en la parte superior de la mezcla de anticuerpos con los centrioles directamente frente a la gota. Deje que los cubreobjetos se incuban durante 45 minutos. Después de esto, retire los cubreobjetos y lávelos en una caja que contenga PBS durante cinco minutos.Incubar los cubreobjetos lavados durante 45 minutos, con anticuerpos secundarios en PBS 1%BSA y 0.05%Tween-20. Retire los cubreobjetos y lávelos durante cinco minutos en una caja que contenga PBS. Con un medio de montaje antidescolorante normal, monte el cubreobjetos en una diapositiva.A continuación, imagine los centrioles aislados en un microscopio confocal con un objetivo de aceite 63X con un N.A. de 1,4, mientras se aplica la desconvolución. Configure la posición superior e inferior de la pila Z por encima y por debajo de la señal centriole, respectivamente, y adquiera una gran pila de imágenes que comprenden la señal centriole total. Proyecte la pila y realice un promedio de una sola partícula como se describe en el protocolo de texto.La inmunofluorescencia representativa revela que seis fracciones están enriquecidas para centrioles aislados, con un pico para la fracción número tres, mientras que las dos últimas fracciones no lo son, lo que indica que la purificación es exitosa. Sólo se ven alrededor de 30 céntimos por campo de visión sin el concentrador, mientras que 183 se ven con el concentrador. Esto demuestra que el paso del concentrador es exitoso y permite un enriquecimiento de seis veces de centrioles en una región definida, lo que facilita su detección e imagen.La microscopía de super resolución se utiliza entonces para la imagen de centrioles manchados para la tubulina monoglutamilada, y el software se utiliza para generar un promedio casi perfecto para cada orientación elegida. Después de cinco iteraciones, se generaron dos clases de promedios de centrioles monoglutamilados: una vista superior de 63 objetos y una vista lateral de 98 partículas. La longitud del promedio de la clase de visión lateral es de 260 nanómetros con un diámetro de 250 nanómetros, comparable a la señal de tubulina monoglutamilada medida que se ve para localizar dentro del núcleo del centriole.Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener el centriolo aislado sobre hielo y congelarlos rápidamente después del aislamiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía crioelectrófica y la espectrometría de masas para responder a preguntas adicionales, como la arquitectura nativa del centriole o la composición de la proteína centriole.

Research

JoVE Journal

Biology

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