Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Vi tackar Pierre Gönczy och BioImaging & Optik plattform (Vävnadsprover) vid École Polytechnique Fédérale de Lausanne (EPFL), Lausanne, Schweiz, där SIM-bilderna av centrioles förvärvades. Nikolai Klena och Davide Gambarotto stöds av Europeiska forskningsrådet (ERC) Starting Grant (StG) 715289 (ACCENT) och Maeva Le Guennec, Paul Guichard och Virginie Hamel av den schweiziska National Science Foundation (SNSF) PP00P3_157517. Susanne Borgers stöds av universitetet i Genève.

<ol>
	<li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+in+cells+and+organisms.">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li><li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+and+only+once:+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease.">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrioles,+centrosomes,+and+cilia+in+health+and+disease.">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li><li>G&#246;nczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly.">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li><li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+organization+and+centriole+architecture:+their+sensitivity+to+divalent+cations.">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li><li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+structure.">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+basal+bodies+in+paramecium.">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).</li><li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis.">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li><li>Li, S., Fernandez, J. -. J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography.">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li><li>Guichard, P., Chr&#233;tien, D., Marco, S., Tassin, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography.">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry.">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li><li>Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartwheel+assembly.">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes.">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li><li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure.">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li><li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging.">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis.">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li><li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii.">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).</li><li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus:+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body.">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, 2663-2674 (2004).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy.">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms.">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813 (2017).</li><li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology.">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li><li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Approaches+to+the+Study+of+the+Role+of+Metals+in+the+Metabolism+of+Microorganisms.">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li><li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles.">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li><li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyVolution-the+smart+path+to+confocal+super-resolution.">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+3D-SIM/SMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+&#8764;4-5+nm.">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of &#8764;4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li><li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+lytic+enzymes+(autolysins)+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+(hydroxy)proline-specific+proteases.">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li><li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images.">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

En av utmaningarna i biologi är att dechiffrera den exakt lokaliseringen av proteiner i arkitektoniska sammanhang. Centriol är en idealisk struktur att tillämpa dessa metoder, eftersom dess arkitektur har studerats med hjälp av cryo-elektron tomografi, avslöjar intressanta ultrastrukturella funktioner längs dess längd. På grund av dess dimensioner nära gränsen på upplösning i optisk mikroskopi är det dock svårt att exakt lokalisera ett protein genom immunofluorescens till en strukturell delregion av den centriol som använder konventionella Mikroskop30.
Upplösningen i optisk mikroskopi begränsas av diffraktion av ljus som ger, ungefär, en lateral maximal upplösning på 200 nm i optisk mikroskopi24. Denna gräns har dock varit förbi en av de stora genombrotten under de senaste 20 åren i optisk mikroskopi: uppfinningen av super-upplösning metoder. Dessa metoder kan bilden utanför diffraktion gränserna vid olika upplösningar: 120 nm för SIM-kort, ca 50 nm för stimulerad emission utarmning (STED) och 20 – 40 nm för singel-molekyl lokalisering mikroskopi (SMLM)24. Med dessa nya utvecklingar av super-resolution mikroskopi är strukturella underregionerna av centriol uppnåeliga. I praktiken är det dock fortfarande svårt att exakt bestämma localizationen av ett protein till ett strukturelement för den främsta anledningen att de mogna centrioles existerar i endast 2 exemplar per cell och har slumpmässiga riktlinjer, vilket gör tolkningen av lokalisering svårt. Av denna anledning inrättades ett protokoll som tillåter forskare att bilden av super-upplösning ett stort antal centrioles, ökar chansen att iaktta icke-tvetydigt riktlinjer. Ännu viktigare, eftersom denna metod förlitar sig på användningen av isolerade centrioles, vi tillhandahåller en metod för att rena intakt C. reinhardtii centrioles som innehåller mogen centrioles och procentrioles.
Slutligen, på grund av spänna av centriol riktlinjer som kan avbildas med detta protokoll, singel-partikel analys kan tillämpas med hjälp av elektronmikroskopi programvara. Detta resulterar i framtagningen av genomsnittliga klasser av centrioles i en viss läggning. Ännu viktigare, kan dessa resulterande 2D-bilder sedan användas till bedöma lokaliseringen av ett specifikt protein längs centriol. Ja, denna metod kan tillämpas på tvåfärgad super-upplösning bilder, och en färg kan användas för att avslöja centriol skelettet (t.ex., tubulin), medan den andra färgen kan hänföras till ett visst centriolar protein. Genom att subtrahera de medelvärden som erhålls med en färg eller två färger, blir det lättare att registrera ett protein längs centriol (proximala, centrala eller distala). Observera att de två kanalerna bör anpassas exakt för att förhindra någon vilseledande tolkningar. Dessutom hjälper medelvärden av top vyer dechiffrera om ett protein lokaliserar inuti centriolar lumen, längs mikrotubuli väggen, eller utanför centriol.
Denna metod har fördelen att fastställa lokaliseringen av specifika proteiner som kan vara svåra att lokalisera annars på grund av heterogena märkning. Observera att andra metoder för att kartlägga proteiner inom centrioles har beskrivits i korrelat 3D-SIM/SMLM med, exempelvis att bedöma de särskilda riktlinjerna av centrioles genom att bestämma de elliptiska profilen av en markör som bildar en torus runt den centriol av SIM-imaging. Med denna parameter, är det möjligt att lokalisera protein med en precision av 4 – 5 nm30. Observera också att den metod som beskrivs här används isolerade centrioles med intakt procentrioles, ett tecken på att centriol arkitekturen är mest sannolikt till stor del bevarad. Dock kan vi inte utesluta att vissa arkitektoniska funktioner störs under reningen, såsom centriol diameter varierar med koncentrationen av divalenta katjoner som förstärks med isolering av den mänskliga centrosome5.
En av de kritiska steg i de protokoll som presenteras här är att erhålla tillräckligt koncentrerad isolerade centrioles i olika inriktningar mottagliga för Fluo-SPA. Gör först säkerställa renheten och effektiviteten i förfarandet centriol isolering. En låg koncentration av isolerade centrioles förhindrar korrekt imaging och ytterligare bildbehandling. För detta ändamål tillhandahåller vi en metod för att berika antalet centrioles per synfält. Beroende på antalet centrioles i det bråk som används, bör den volym som laddats i anrikningsverket justeras, med en maximal volym på 250 µL.
Viktigast av allt, har denna metod utvecklats för en cellvägg minus cw15-C. reinhardtii celler. I denna stam möjliggör bräckligheten i cellväggen en ordentlig Lysering av cellerna och därmed befrielsen av dess innehåll. Detta protokoll är inte effektivt för vildtyp C. reinhardtii celler, som cellväggen hindrar en korrekt lysis. Alternativa strategier såsom ultraljudsbehandling eller en före inkubering av cellerna med autolysin, ett enzym som kan försämra de cellvägg31, skulle behöva vidtas för att förändra cellväggen innan protokollet isolering som presenteras här.
Detta upplägg kan användas med olika typer av Mikroskop, allt från konventionella confocal Mikroskop till hög genomströmning dedikerade super-upplösning Mikroskop. Observera att när du gör SMLM, en särskild buffert krävs för korrekt avbildning och, således, en kammare som anpassats för ett 12 mm täckglas med bufferten ovanpå täckglaset bör användas. Efterföljande imaging utförs med inverterade Mikroskop. Om Mikroskop set-up inte tillåter ett 12 mm täckglas, kan det protokoll som presenteras här tillämpas på 18 mm coverslips använder en 30 mL runda-botten tub och en modifierad adapter och koncentrator. Det är också viktigt att Observera att kvaliteten på den slutliga återuppbyggnaden i SMLM kommer att bero på kvaliteten på färgningen och av primär antikropp används, liksom metoden för fixering.
Sammanfattningsvis tillhandahåller vi en metod som kan tillämpas på bilden talrika centrioles följt av Fluo-SPA som kommer att generera medelvärden av centrioles i olika riktningar, vilket bidrar till att lokalisera centriolar protein med precision. Viktigast av allt, kan denna metod tillämpas mer allmänt till isolerade centrioles från andra arter, till andra organeller, eller till stora makromolekylära sammanställningar. Slutligen den prov förberedelse metoden presenteras här, kombinerat med senaste algoritmutveckling för singel-partikel analys av fluorescerande SMLM data32, kunde öppna ytterligare förbättring i den molekylära cartography av stora makromolekylära församlingar.

Centriol är en evolutionärt bevarade organell som utgör kärnan av centrosome i djurceller och kan fungera som en basal kropp (kallad centrioles nedan) till mallen cilier eller flageller i många Eukaryoter1,2. Som sådan, är centrioles kritiska för grundläggande cell biologiska processer alltifrån spindelenhet till cell signalering. Därför har defekter i centriol montering eller funktion har associerats med flera mänskliga sjukdomar inklusive ciliopathies och cancer3.
Centrioles är niofaldig, symmetrisk, mikrotubuli triplet-baserade cylindriska strukturer som är, normalt ~ 450 nm lång och ~ 250 nm brett4,5,6,7. Konventionella elektronmikroskopi och cryo-elektron tomografi av centrioles från olika arter har visat att centrioles är polariserat längs deras långa axeln med tre distinkta regioner: en proximal region, en central kärna och en distala region5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. viktigast av allt, var och en av dessa regioner visar strukturella särdrag. Först innehåller lumen i regionen som 100 nm lång proximala cartwheel struktur ansluten till mikrotubuli triplett genom de pinhead element12. Andra regionen 300 – 400 nm lång centrala innehåller fibrösa tätheter i lumen och strukturella funktioner längs mitotiska inre ansikte: den Y-formade länkaren, C-tubuli svansen och den A-tubuli stub-9. Slutligen, 50 – 100 nm distala regionen uppvisar sub distala och distala bihang som omger den distala delen av centriol5,13.
De senaste två decennierna har präglats av upptäckten av ett ökande antal centriolar proteiner, vilket leder till en aktuell uppskattning av ca 100 olika proteiner som en del av de centriol14,15,16, 17. Trots dessa framsteg, exakt lokalisering av dessa proteiner inom centriol förblir svårfångade, särskilt inom strukturella underregioner. Viktigt, är tilldela en exakt lokalisering till strukturella regioner i centriol avgörande för en bättre förståelse för deras funktion. I detta avseende har C. reinhardtii centrioles varit avgörande för båda aspekterna av första delimitating olika strukturella drag längs den cylinder9,18,19, som sedan får forskare att korrelera lokaliseringen av en delmängd av proteiner med hjälp av fluorescerande mikroskopi till en sub strukturella region. Detta omfattar till exempel proteiner Bld12p och Bld10p, som lokaliserar i regionen proximala och i strukturen cartwheel särskilt20,21,22,23. Listan av underkonstruktionen lokaliserade proteiner innehåller också POB15 och POC16, två nya proteiner identifierats av masspektrometri som pryder regionen inre central kärna av C. reinhardtii centrioles17.
Detta dokument innehåller en fullständig beskrivning av den metod som utvecklats för att isolera och bild C. reinhardtii centrioles för efterföljande super-resolution mikroskopi och singel-partikel genomsnitt. För att uppnå detta mål är det viktigt att avgränsa de tekniska begränsningar som måste övervinnas. Först kan centriol rening påverka den övergripande arkitekturen, med cartwheel struktur ofta försvinner under de olika stegen i isolering9. För det andra är centriol dimensioner mycket nära diffraktionsgränsen i optisk mikroskopi. Den laterala resolution som kan erhållas i konfokalmikroskopi faktiskt omkring 200 nm24, liknande till diametern på centriol och resolutionen som i z-axeln handlar om 2 – 3 x lägre, vilket leder till en Anisotrop volym. För det tredje, heterogenitet antikropp märkning och centriol läggning kunde begränsa tolkningen behövs för att lokalisera ett protein i en specifik centriolar delregion. Slutligen existerar centrioles i endast två exemplar per cell, vilket gör det svårt att förvärva ett stort antal bilder och hitta en otvetydig centriol orientering. För att kringgå dessa tekniska frågor, utvecklat vi en metod som bygger på att tillämpa super-resolution mikroskopi på stort antal isolerade centrioles att antar olika inriktningar. Först kommer vi att beskriva ett protokoll för att rena C. reinhardtii centrioles som möjliggör rening av strukturellt intakt centrioles och procentrioles som innehåller cartwheel. Sedan kommer vi att beskriva ett stegvisa protokoll för att koncentrera sig på centrioles på coverslips för avbildning av konventionella eller super-resolution fluorescerande mikroskopi. Detta viktiga steg tillåter för att öka antalet centrioles som avbildas i flera riktningar. Slutligen kommer vi att beskriva ett förfarande för att utföra enkel-partikel genomsnitt på data förvärvade den fluorescerande Mikroskop som underlättar upptäckt av centrioles i olika inriktningar. Sammantaget kan denna metod tillämpas på bilden centrioles från olika arter eller andra stora makromolekylära sammanställningar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioles finns stora makromolekylära församlingar som är viktigt för ett korrekt genomförande av grundläggande cell biologiska processer såsom celldelning, cell motilitet eller cellsignalering. Gröna alger Chlamydomonas reinhardtii har visat sig vara en insiktsfull modell i studien av centriol arkitektur, funktion och protein sammansättning. Trots stora framsteg mot förståelse centriolar arkitektur är en av de nuvarande utmaningarna att avgöra exakt lokalisering av centriolar komponenter inom strukturella regioner av centriol för att bättre förstå deras roll i centriol biogenes. En stor begränsning ligger i resolutionen av fluorescensmikroskopi, vilket komplicerar tolkningen av protein lokalisering i denna organell med dimensioner nära diffraktionsgränsen. För att ta itu med denna fråga, tillhandahåller vi en metod för att rena och bild ett stort antal C. reinhardtii centrioles med olika inriktningar använder super-resolution mikroskopi. Denna teknik tillåter vidarebearbetning av data genom fluorescerande singel-partikel genomsnitt (Fluo-SPA) på grund av det stora antalet centrioles som förvärvats. Fluo-SPA genererar medelvärden av målat C. reinhardtii centrioles i olika riktningar, vilket underlättar lokaliseringen av olika proteiner i centriolar underregioner. Ännu viktigare, kan denna metod tillämpas på bilden centrioles från andra arter eller andra stora makromolekylära sammanställningar.

C. reinhardtii centriol isolering: För att isolera centrioles, cw15- C. reinhardtii celler odlas i flytande kultur i flera dagar under ljus och därefter pelleterat genom centrifugering vid 600 x g för 10 min. Pelleted celler spolades 1 x med PBS och återsuspenderade i en deflagellation buffert före deflagellation genom att utföra en pH chock med 0,5 M ättiksyra till ett slutligt pH på 4,5 – 4,7 för 2 min (figur 1A). Ett tillägg av 1 N KOH användes för att återställa pH till 7,0. För att separera fristående flageller från cellen organ, var deflagellated celler först centrifugeras för att ta bort huvuddelen av flageller. Pelleten sedan tvättades 2 x med PBS och resuspended i 30 mL PBS före lastningen det långsamt på en 25%-sackaros kudde (figur 1B). Röret var snurrade vid 600 x g i 15 minuter vid 4 ° C att ta bort de flesta av de fristående flageller. Efter centrifugering, cell organ var spridda i sackaros dynan (figur 1C) och återvinns genom att ta bort de cirka 30 mL av supernatanten (tills den röda pilen i figur 1C). De resulterande 20 mL av tvättade cellerna var sedan resuspended i 20 mL kall PBS och centrifugeras vid 600 x g i 10 min. Därefter supernatanten förkastades, och cellerna helt var resuspended i 10 mL PBS. Cellerna har överförts till en 250 mL-flaska och lyseringsbuffert lades till de återsuspenderade cellerna på en gång. DNAS lades till Lys och inkuberas i 1 h vid 4 ° C. Efter en centrifugeringssteget ta bort cellfragment (se den vita pelleten i figur 1D), supernatanten samlades in och noggrant lastas en 2 mL 60%-sackaros kudde före centrifugering vid 10 000 x g under 30 minuter vid 4 ° C. Observera att för 100 mL lysis, 8 rör 15 ml användes för att utföra det här steget, motsvarande 12,5 mL lyseringsbuffert lastas på 2 mL av sackaros per rör. Efter centrifugering, de flesta av supernatanten togs bort till 1 mL ovan dynan. 1 mL av återstående supernatanten var sedan samlas in med 2 mL dynan och sedan blandas och poolade för att erhålla en slutlig volym av 24 mL. Poolen var sedan lastas på en 40% - 50%, 70%-sackaros lutning och snurrade vid 68,320 x g i 1 h och 15 min vid 4 ° C. Slutligen, de isolerade centrioles samlades in genom ett hål i nedre delen av centrifugering röret med hjälp av en nål och dropparna samlades 12 x 500 µL fraktioner. På grund av den höga tätheten av olika sackaros, drop bildas mycket långsamt i början (70% sackaros) och sedan mer snabbt (40% sackaros).
Immunofluorescens av isolerade Centrioles För att bedöma kvaliteten på förfarandet för isolering, var 10 µL av varje insamlat gradienten bråkdel sedan centrifugeras på ett täckglas som använder ett täckglas stöd adapter (figur 2A-2D). Ännu viktigare, för att ta bort säkert täckglaset, en anpassad hooked enhet utformades (figur 2B). Därefter analyserades coverslips av immunofluorescens. Antikroppar mot CrSAS-6(Bld12p) användes i denna studie för att indikera närvaron av cartwheel struktur och α-tubulin (DMA1) för att markera centriolar väggen. Genom att räkna antalet centrioles som var positiva för både CrSAS-6 och α-tubulin per synfält och sedan beräkna det totala antalet centrioles per fraktioner, var det möjligt att fastställa vilka fraktioner berikades för isolerade centrioles ( Figur 2F-2 H). Intressant, berikades 6 fraktioner för centrioles (figur 2F och 2 G, fraktioner #1 – 6), med en topp för bråkdel #3, medan de senaste bråk var inte, som anger att rening arbetat. Observera att i detta särskilda experiment, 95% av de totala centrioles var positiva för CrSAS-6 och α-tubulin i bråkdel #3. Detta indikerar att mest isolerade centrioles behållit sin cartwheels. Om ingen berikning av centrioles observeras i de första fraktionerna, förfarandet för isolering fungerade inte och bör upprepas. Observera att vissa flagellar bitar kan observeras oftast i fraktionerna saknar centrioles.
Nästa, för att beräkna det totala antalet centrioles per µL, antalet centriol per synfältet ska multipliceras kvoten som presenteras i figur 2H. Resultatet ska sedan delas med volymen av det bråk som används för immunofluorescens för att erhålla antalet centrioles per µL. I detta särskilda isolering förfarande innehöll den mest berikat fraktionen ca 37 centrioles för ett område av 0.00846 mm2 (med ett synfält 92 x 92 µm2). Ytan av avsnittet tube var 7,5 mm radie med en total yta av 176 mm2. Motsvarade förhållande var sedan 176/0.00846 = 20,803.8, så sammanlagt 769,740 centrioles (37 x 20, 803.8) i 10 µL. Antalet centrioles i 1 µL var därför 76,974.
Koncentrationen av isolerade Centrioles på Coverslips: Öka antalet centrioles per fält ökar chansen att upptäcka entydiga centriol orientering, samt öka chansen att upptäcka liknande riktlinjer som kan användas för ytterligare partikel genomsnitt förfaranden. Centrioles från koncentrerad fraktioner är fortfarande gles på täckglaset, utvecklat vi ett centrifugering tillbehör för att koncentrera centrioles mitt i den täckglas (figur 3A) heter en koncentrator. Observera att en .stl fil med de precisa åtgärderna för 3D-utskrift är försedd med detta manuskript.
Först, ett täckglas av 12 mm var monterad på koncentratorn (figur 3B). Adaptern placerades ovanpå täckglaset och runda-botten röret var inverterad och placeras över monterade adaptern och koncentrator. Runda-botten röret var sedan försiktigt inverterad, vilket möjliggör lastning av provet (protokoll steg 4.2). Centrioles var sedan centrifugeras vid 10 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Efter det, centrioles utsattes för immunofluorescens och färgas för CrSAS-6/Bld12p och α-tubulin (figur 3 c-3E). Viktigast av allt, utan koncentrator sågs ca 30 centrioles per synfält (figur 3C), medan 183 centrioles sågs per synfält när anrikningsverket var används (figur 3D-3F). Observera att centrioles täcks endast en disk 4 mm i diameter i mitten på täckglas. Detta resultat visar att steget koncentration fungerar och gör en 6-fold anrikning av centrioles i en definierad region i den coverslips, således lättnader deras upptäckt och imaging.
Fluorescerande-singel-partikel som genomsnitt av isolerade C. reinhardtii Centrioles: Här, med SIM-mikroskopi som kan nå en upplösning på omkring 120 nm, centrioles färgas för monoglutamylated tubulin (GT335, figur 4), en tubulin ändring i centriolar mikrotubuli, var avbildad24. C. reinhardtii centrioles är omkring 500 nm lång, alltid i par, och ofta finns med associerade, nyligen dupliceras probasal organ (kallade procentrioles nedan) och tvärstrimmig mikrotubulära-associerade fibrer19. Detta slutmontering var därför ca 1 µm stora. Av denna anledning och för bild av centrioles i sin helhet, rekommenderar vi att förvärva en Z-stack på de isolerade centrioles.
Här, efter förvärvet genererades en slutbild genom att utföra en maximal intensitet projektion med ImageJ28 (bild/travar/Z project/max intensitet projektion, figur 4B). En enda-partikel analys med kryo-elektron mikroskopi programvara utfördes för att göra klasser av centrioles med liknande riktlinjer från sådana bilder, och sedan genomsnitt utfördes. Gör var bilden färgen först inverterad så att bättre visualisera objekten (figur 4C). Centrioles plockades manuellt i en låda centrerad över varje partikel med hjälp av fritt tillgängliga Scipion programvara29 som integrerar flera elektronmikroskopi programvaror såsom Xmipp3 (figur 4D). Observera att storleken på rutan som definieras av användaren. Här, lådor med 50 x 50 pixlar för en pixelstorlek på 31.84 nm användes. Nästa, alla partiklar var extraheras (figur 4E) och justeras med hjälp av Xmipp3 (figur 4F). Därefter tillämpades en cirkelformad mask av 12 pixlar i radie för att isolera varje centriol från den centriolar-par (figur 4G). Partiklarna klassificerades sedan, med Xmipp3, för att generera flera medelvärden. Endast hölls homogen klass medelvärden, vilket innebär att partiklar som avviker från klass genomsnitten exkluderades manuellt. Detta steg upprepades för att generera ett nästan perfekt medelvärde för varje valt orientering. Efter fem iterationerna, två klasser av medelvärden genererades: en ovanifrån från 63 objekt (figur 4H) och en sida Visa från 98 partiklar (figur 4jag) av monoglutamylated centrioles. Måtten på objektet bestämdes genom att mäta avståndet mellan topparna av intensitet tomt profilen längs monoglutamylation signalen.
Ännu viktigare, sida Visa klass genomsnittliga längd är 260 nm med en diameter på 250 nm, jämförbar med den uppmätta monoglutamylated tubulin signal som visades att lokalisera till en region av 286 ± 33 nm i längd i kärnan av centriol17.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> Figur 1 : Rening av C. reinhardtii centrioles. (A) Detta är en schematisk representation av varje steg som leder till isolering av C. reinhardtii centrioles. Det omfattar representativa steg protocol (B) innan och (C) efter centrifugering på 25%-sackaros övertoningen. Den röda pilen i panel C visar den minsta volymen att hålla efter centrifugering. (D), denna panel visar vita pelleten lyserat celler efter centrifugering. Den svarta pilen anger pelleten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> Figur 2 : Centrifugering set-up att utföra immunofluorescens på isolerade centrioles. (A) 10 µL av varje insamlade bråkdel späds först i 100 µL 10 mM K-PIPES (pH 7,2). (B) Detta är en schematisk representation av centrifugering enheter, som omfattar ett 15 mL runda-botten rör, ett 12 mm täckglas, en adapter för täckglaset, och en specialanpassad hooked produkt att återvinna täckglaset efter centrifugering. Paneler C och D Visa ritningar som förklarar hur till återvinna täckglaset efter centrifugering. (C) plats hooked verktyget i hålet i den slitsade kanten av adaptern och (D) försiktigt. (E) dessa är bilder av den fuktig kammare som behövs för att utföra immunofluorescens imaging. Pilen anger det 12 mm täckglaset. (F) dessa är representativa confocal bilder på 63 X (zooma 2) av gradient fraktioner #1-8, insamlade under förfarandet för rening och färgas för CrSAS-6 (röd) och α-tubulin (grön). Inläggningar motsvarar regionen indikeras av en vit ruta i vyerna lägre förstoring. Skalstapeln = 10 µm. (G) Detta är en graf som representerar antalet centrioles positivt för både CrSAS-6 och α-tubulin per synfält i respektive fraktion. Observera berikning i fraktioner #1-6. Det genomsnittliga antalet centrioles per fält i respektive fraktion: #1 = 16,3 ± 4,7, #2 = 24,0 ± 4,6, #3 = 37,0 ± 17,0, #4 = 23,3 ± 11,4, #5 = 14.3 ± 2,1, #6 = 13,7 ± 9,3, #7 = 2,7 ± 1,2, #8 = 1,0 ± 0,0, #9 = 1,0 ± 0,0, #10 = 0,0 ± 0,0, #11 = 0.3 ± 0,6, #12 = 0,0 ± 0,0. För varje fraktion, var 3 slumpmässiga fält avbildade. Observera att vid inventering den mest berikat fraktionen #3, Vi hittade att 95% av centrioles är positivt för CrSAS-6 och α-tubulin (n = 205 centrioles). (H) A förhållandet mellan antalet centrioles närvarande i det uppmätta området av micrographs används för att beräkna det totala antalet centrioles i området av röret. Centriol antalet per µL kan beräknas från 10 µL ursprungligen centrifugeras fraktioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> Figur 3 : Isolerade centrioles centrifugeras använda koncentratorer. (A) denna panel visar centrifugering apparater som behövs att koncentrera centrioles till coverslips före immunofluorescens, inklusive en 15 mL runda-botten tub, en koncentrator, ett 12 mm täckglas och en support adapter apparatur. (B) denna panel visar stegen för att montera centrifugering enheten. Paneler C-E visar confocal bilder av centrioles målat för CrSAS-6 (röd) och α-tubulin (grön) (C) utan eller (D-E) med koncentratorn. Inläggningar motsvarar regionen indikeras av en vit ruta i vyerna lägre förstoring. Skalstapeln är 10 µm. Notera att centrioles är berikade mitt i den täckglas (den streckade linjen representerar gränsen till området koncentrerad). (F), denna graf representerar antalet centrioles per synfält utan och med koncentratorn. Fem slumpmässiga synfält analyserades. Det genomsnittliga antalet centrioles är, utan koncentrator, 29,8 ± 2,9, och med koncentrator, 182,6 ± 11.5, P < 0,0001. Den statistiska signifikansen bedömdes genom ett oparat t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> Figur 4 : Singel-partikel genomsnitt på isolerade C. reinhardtii centrioles. (A) denna panel visar Z stack bilder av centrioles färgas med GT335 och förvärvade med SIM-Mikroskop. (B) dessa paneler visar en maximal intensitet Z projektion av staplade bilder. Skalstapeln = 1 µm. (C) dessa paneler visar en representativ bild med en inverterad kontrast. Infällt representerar en zooma in att visualisera de bättre centrioles. (D) dessa paneler Visa partikel plockning. Infällt anger hur partiklarna plockades. (E) är exempel på 5 extraherade partiklarna. (F) panelen visar partiklar efter justering. (G), denna panel visar partiklar efter applicering en mask. Paneler H och jag Visa två klass medelvärden: (H), en top view (63 partiklar) och (jag) sidoutsikt (98 partiklar). De dubbla pilarna anger måtten på GT335 signalen. Skalstapeln = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> 
Kompletterande fil 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>
Kompletterande fil 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Vänligen klicka här för att hämta den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Isolering och fluorescens Imaging för singel-partikel rekonstruktion av Chlamydomonas Centrioles

Vi har utvecklat en strategi för att rena och bild ett stort antal centrioles i olika inriktningar mottaglig för super-resolution mikroskopi och singel-partikel genomsnitt.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Denna metod kan bidra till att besvara viktiga frågan i centriole fältet, såsom lokalisering protein till en viss region i centriole. Den största fördelen med denna teknik som vi ger medel för att koncentrera centriole att få dem i flera inriktningar. Även om denna metod kan ge insikter i Chlamydomonas centriole biologi, kan det också tillämpas på andra system, såsom isolerade mänskliga och paramecium centrioles.Demonstrerar proceduren blir doktoranden Nikolai Klena, en annan doktorand Maeva Le Guennec, och postdoktorn i laboratoriet Davide Gambarotto. För att påbörja detta förfarande, först förbereda alla medier och kultur C.Reinhardtii cellerna som beskrivs i textprotokollet. Överför de preparerade cellerna till 50 milliliter koniska rör och centrifuger dem på 600 gånger g i 10 minuter.Tvätta pelleten en gång med 50 milliliter 1x PBS och snurra cellerna igen på 600 gånger g i 10 minuter. Använd en pipett för att återanvänd pelleten i 100 milliliter av rumstemperatur deflagellationsbuffert. Placera bägaren på en magnetisk omrörare, och tillsätt långsamt 0,5 molar ättiksyra till ett slutligt pH-värde på 4,5 till 4,7.Låt denna blandning inkubera i rumstemperatur i två minuter. Efter detta långsamt lägga droppar av en normal kaliumhydroxid för att återställa pH till 7,0, överföra cellerna till 50 milliliter rör, och centrifug dem på 600 gånger g i 10 minuter, för att ta bort eventuella fristående flageller. Kasta supernatanten och förvara pelleten på is tills den är klar att tvätta.När du är klar, tvätta pelleten två gånger med 50 milliliter 1x PBS vid fyra grader Celsius per tvätt. Snurra den tvättade pelleten i 600 gånger g och fyra grader Celsius i 10 minuter. Resuspend pelleten i 30 milliliter av 1x PBS.Sedan, ladda långsamt suspensionen på en 20 milliliter kudde av 25%sackaros, utan att blanda. Snurra på 600 gånger g och fyra grader Celsius i 15 minuter för att ta bort eventuella kvarvarande flagella och sprida cellerna i sackaros. Med hjälp av en aspirator, försiktigt aspirera supernatant hålla endast botten-mest 20 milliliter.Tvätta resterande sackaros genom att tillsätta 20 milliliter av kall 1x PBS. Centrifug vid 600 gånger g och fyra grader Celsius i 10 minuter. Resuspend pelleten i 10 milliliter av 1x PBS vid fyra grader Celsius, se till att det inte finns några klumpar i lösningen.Överför den återanvända pelleten till en ny 250 milliliterflaska, tillsätt lysbufferten, kompletterad med 5, 000 enheter DNase, till flaskan som innehåller cellerna. Inkubera vid fyra grader Celsius i en timme, medan du blandar var 15:e minut genom att försiktigt vända flaskan. Överför de lystade cellerna till ett koniskt rör på 50 milliliter och centrifug vid 600 g och fyra grader Celsius i 10 minuter.Med hjälp av en pipett, samla supernatanten och ladda den i ett 30 milliliter rundbottnub på is som innehåller två milliliter 60%sackaroskudde. Centrifugera detta vid 10, 000 gånger g i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Efter detta aspirera supernatanten upp till en milliliter ovanför sackaroskudden.Observera det gula gränssnittet mellan den en milliliter av återstående supernatant, och de två milliliter av sackaros kudde. Använd en skuren P1000-spets, blanda försiktigt den återstående supernatanten med sackarosen. Pool alla sackaros kuddar och förvara dem på is.Därefter förbereda en 40%till 70%sackaros gradient i en tunnväggig 38,5 milliliter polypropylen röret som beskrivs i textprotokollet. Läs långsamt in de poolade gränssnitten i övertoningen. Balansera rören med 10 millimolar K-RÖR buffert, och centrifug på 68, 320 gånger g och fyra grader Celsius i 75 minuter.Efter detta, använd en 0,8 millimeters nål för att göra ett hål i botten av röret, se till att inte störa de olika sackaroslagren. Använd detta hål för att samla 12 500 microliter fraktioner vid fyra grader Celsius. Med hjälp av en skurna P200-spets, bered ytterligare 10 mikroliter alikvot från varje fraktion som ska användas under immunofluorescens.Sedan, snap-frysa fraktionerna i flytande kväve. Till att börja med placera en steril 12 millimeter coverslip på den infällda nedre änden av koncentratorn, se till att hålla PDL-belagda sidan nedåt. Placera adaptern direkt på toppen, för att locket täckskydd.Sedan, invertera rund-botten röret och placera den över koncentratorn, coverslip, och adapter. Använd pincett, tryck försiktigt ensemblen tills den når botten av röret, och sedan invertera röret. Tillsätt 10 millimol av K-PIPES buffert tills den når toppen av koncentratorn.Se till att det inte finns några bubblor i koncentratorns centralcylinder. Tillsätt försiktigt 100 mikroliter på 10 millimolar K-PIPES buffert till en av alikvoterna i den anrikade centriolarfraktionen och blanda noggrant med hjälp av en P200-pipett. Därefter tar du bort 100 mikroliter av K-PIPES buffert från den ihåliga mitten av koncentratorn, och tillsätt 100 mikroliter av buffertfraktionsblandningen, se till att innehållet finns kvar i koncentratorns ihåliga mittpunkt.Snurra på 10, 000 gånger g i 10 minuter i en centrifug som är förkyld till fyra grader Celsius. Efter detta, använd pincett för att ta bort koncentratorn. Sätt in en handgjord-hooked enhet i hålet som finns i slitskanten av adaptern och lyft upp försiktigt för att återvinna täckskydd.När den når toppen av röret, använd ett handsken finger för att fånga kanten av adaptern och använda pincett för att ta bort täckplattan, vara uppmärksam på vilken sida av täcket innehåller centrioles. Utför sedan fixering och immunofluorescensfärgning av de koncentrerade centriolesna. Till att börja med inkubera täcken med centriolesna i den förberedda kristallpolystyrenöverföringslabdlådaen fylld med 100%metanol vid minus 20 grader Celsius i 5 minuter.Med hjälp av pincett överför du täcken till en genomskinlig laboratorielåda fylld med 50 milliliter 1x PBS. Låt objektglasen tvättas i PBS i fem minuter i rumstemperatur. Sedan, pipetter 60 mikroliter av primära antikroppar blanda på en bit av laboratoriet tätning wrap i en befuktad kammare.Lägg försiktigt täcken ovanpå antikroppsblandningen med centrioles direkt mot droppen. Låt täcken ruvar i 45 minuter. Efter detta, ta bort täcken och tvätta dem i en låda som innehåller PBS i fem minuter.Inkubera de tvättade täcken i 45 minuter, med sekundära antikroppar i PBS 1%BSA och 0,05%Tween-20. Ta bort täcken och tvätta dem i fem minuter i en låda som innehåller PBS. Montera täcket på ett objektglas med ett vanligt anti-blekningsmedium.Sedan, bild de isolerade centrioles på en confocal mikroskop på en 63X olja mål med en N.A.of 1.4, samtidigt som deconvolution. Ställ in den övre och nedre positionen för Z-stacken över respektive under centriolesignalen och skaffa en stor hög med bilder som omfattar den totala centriolesignalen. Projicera stacken och utför enpartikel medelvärde som beskrivs i textprotokollet.Representativ immunofluorescens avslöjar att sex fraktioner är berikade för isolerade centrioles, med en topp för fraktion nummer tre, medan de två sista fraktionerna inte, vilket indikerar att reningen är framgångsrik. Endast omkring 30 centrioles ses per sätta in av beskådar utan koncentratorn, stund 183 ses med koncentratorn. Detta visar att koncentratorn steget är framgångsrikt, och möjliggör en sexfaldig anrikning av centrioles i en definierad region, vilket gör det lättare att upptäcka och bild dem.Super-upplösning mikroskopi används sedan för att bilden centrioles färgas för monoglutamylated tubulin, och programvara används för att generera en nästan perfekt genomsnitt för varje vald orientering. Efter fem iterationer, två klasser av medelvärden genererades av monoglutamylated centrioles:a top view från 63 objekt och en sidovy från 98 partiklar. Längden på sidovyn klass genomsnitt är 260 nanometer med en diameter på 250 nanometer, jämförbar med den uppmätta monoglutamylated tubulin signal som ses för att lokalisera inom kärnan av centriole.Medan du utför detta förfarande, Det är viktigt att komma ihåg att hålla isolerade centriole på is och snap-frysa dem efter isolering. Efter detta förfarande, kan andra metod, som kryo-elektronmikroskopi och masspektrometri utföras för att besvara ytterligare fråga, såsom den inhemska arkitekturen i centriole eller centriole proteinkompositionen.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Parning och tetrad Separation av Chlamydomonas reinhardtii För genetisk analys

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Född Normalisering för fluorescens Optical Projection Tomography för hela hjärtat Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Metod för mätning av Viral Fusion Kinetics på enskild partikel nivå

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoskopisk Fluorescens Tomografi för In-vivo Imaging för att utveckla Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Time-lapse avbildning av Mitos Efter siRNA Transfektion

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Enda partikel elektronmikroskopi Rekonstruktion av Exosome Complex Använda Random Konisk Tilt metod

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis och Mikromanipulation för Intravital fluorescens avbildning av mikrocirkulationen

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Imaging och 3D rekonstruktion av Cerebrovascular Structures i embryonala Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Snabb analys och utforskningen av fluorescensmikroskopi bilder

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluorescens Imaging med One-nanometer Noggrannhet (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...