Name: isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles
Uploaded: 2018-09-21T13:00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

École Polytechnique Fédérale de Lausanne adlı (EPFL), Lozan, İsviçre, nerede centrioles SIM görüntüleri elde Pierre Gönczy ve BioImaging & Optik platformu (BIOP) teşekkür ederim. Nikolai Klena ve Davide Gambarotto Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) başlangıç Grant (StG) 715289 (vurgu) ve Maeva Le Guennec, Paul Guichard ve Virginie Hamel İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNSF) PP00P3_157517 tarafından desteklenir. Susanne Borgers Cenevre Üniversitesi tarafından desteklenir.

<ol>
	<li>Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+centrosome+in+cells+and+organisms.">The centrosome in cells and organisms.</a> Science. 335 (6067), 422-426 (2012).</li><li>Nigg, E. A., Holland, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once+and+only+once:+mechanisms+of+centriole+duplication+and+their+deregulation+in+disease.">Once and only once: mechanisms of centriole duplication and their deregulation in disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (5), 297-312 (2018).</li><li>Nigg, E. A., Raff, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrioles,+centrosomes,+and+cilia+in+health+and+disease.">Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease.</a> Cell. 139 (4), 663-678 (2009).</li><li>G&#246;nczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+a+molecular+architecture+of+centriole+assembly.">Towards a molecular architecture of centriole assembly.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 425-435 (2012).</li><li>Paintrand, M., Moudjou, M., Delacroix, H., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centrosome+organization+and+centriole+architecture:+their+sensitivity+to+divalent+cations.">Centrosome organization and centriole architecture: their sensitivity to divalent cations.</a> Journal of Structural Biology. 108 (2), 107-128 (1992).</li><li>Winey, M., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centriole+structure.">Centriole structure.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Dippell, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+basal+bodies+in+paramecium.">The development of basal bodies in paramecium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 61 (2), 461 (1968).</li><li>Allen, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphogenesis+of+basal+bodies+and+accessory+structures+of+the+cortex+of+the+ciliated+protozoan+Tetrahymena+pyriformis.">The morphogenesis of basal bodies and accessory structures of the cortex of the ciliated protozoan Tetrahymena pyriformis.</a> The Journal of Cell Biology. 40 (3), 716-733 (1969).</li><li>Li, S., Fernandez, J. -. J., Marshall, W. F., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+structure+of+basal+body+triplet+revealed+by+electron+cryo-tomography.">Three-dimensional structure of basal body triplet revealed by electron cryo-tomography.</a> The EMBO Journal. 31 (3), 552-562 (2012).</li><li>Guichard, P., Chr&#233;tien, D., Marco, S., Tassin, A. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procentriole+assembly+revealed+by+cryo-electron+tomography.">Procentriole assembly revealed by cryo-electron tomography.</a> The EMBO Journal. 29 (9), 1565-1572 (2010).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Native+architecture+of+the+centriole+proximal+region+reveals+features+underlying+its+9-fold+radial+symmetry.">Native architecture of the centriole proximal region reveals features underlying its 9-fold radial symmetry.</a> Current Biology. 23 (17), 1620-1628 (2013).</li><li>Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartwheel+assembly.">Cartwheel assembly.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1650), (2014).</li><li>Bornens, M., Paintrand, M., Berges, J., Marty, M. C., Karsenti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+chemical+characterization+of+isolated+centrosomes.">Structural and chemical characterization of isolated centrosomes.</a> Cell Motility and the Cytoskeleton. 8 (3), 238-249 (1987).</li><li>Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+isolated+chlamydomonas+centrioles+reveals+orthologs+of+ciliary-disease+genes.">Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes.</a> Current Biology. 15 (12), 1090-1098 (2005).</li><li>Kilburn, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Tetrahymena+basal+body+protein+components+identify+basal+body+domain+structure.">New Tetrahymena basal body protein components identify basal body domain structure.</a> The Journal of Cell Biology. 178 (6), 905-912 (2007).</li><li>Bauer, M., Cubizolles, F., Schmidt, A., Nigg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Quantitative+analysis+of+human+centrosome+architecture+by+targeted+proteomics+and+fluorescence+imaging.">A Quantitative analysis of human centrosome architecture by targeted proteomics and fluorescence imaging.</a> The EMBO Journal. 35 (19), 1-15 (2016).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chlamydomonas+Central+Core+Centriolar+Proteins+Reveals+a+Role+for+Human+WDR90+in+Ciliogenesis.">Identification of Chlamydomonas Central Core Centriolar Proteins Reveals a Role for Human WDR90 in Ciliogenesis.</a> Current Biology. 27 (16), 2486-2498 (2017).</li><li>Cavalier-Smith, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=basal+body+and+flagellar+development+during+the+vegetative+cell+cycle+and+the+sexual+cycle+of+Chlamydomonas+reinhardii.">basal body and flagellar development during the vegetative cell cycle and the sexual cycle of Chlamydomonas reinhardii.</a> Journal of Cell Science. 16 (3), 529 (1974).</li><li>Geimer, S., Melkonian, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+the+Chlamydomonas+reinhardtii+basal+apparatus:+identification+of+an+early+marker+of+radial+asymmetry+inherent+in+the+basal+body.">The ultrastructure of the Chlamydomonas reinhardtii basal apparatus: identification of an early marker of radial asymmetry inherent in the basal body.</a> Journal of Cell Science. 117, 2663-2674 (2004).</li><li>Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAS-6+is+a+cartwheel+protein+that+establishes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (24), 2169-2174 (2007).</li><li>Hamel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+multicolor+3D+SIM+and+STORM+microscopy.">Correlative multicolor 3D SIM and STORM microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 5 (10), 3326 (2014).</li><li>Guichard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+reconstitution+reveals+centriole+cartwheel+assembly+mechanisms.">Cell-free reconstitution reveals centriole cartwheel assembly mechanisms.</a> Nature Communications. 8, 14813 (2017).</li><li>Hiraki, M., Nakazawa, Y., Kamiya, R., Hirono, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bld10p+constitutes+the+cartwheel-spoke+tip+and+stabilizes+the+9-fold+symmetry+of+the+centriole.">Bld10p constitutes the cartwheel-spoke tip and stabilizes the 9-fold symmetry of the centriole.</a> Current Biology. 17 (20), 1778-1783 (2007).</li><li>Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+nanoscopy+in+cell+biology.">Fluorescence nanoscopy in cell biology.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).</li><li>Hutner, S. H., Provasoli, L., Schatz, A., Haskins, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+Approaches+to+the+Study+of+the+Role+of+Metals+in+the+Metabolism+of+Microorganisms.">Some Approaches to the Study of the Role of Metals in the Metabolism of Microorganisms.</a> Proceedings of the American Philosophical Society. 94 (2), 152-170 (1950).</li><li>Keller, L. C., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+proteomic+analysis+of+chlamydomonas+centrioles.">Isolation and proteomic analysis of chlamydomonas centrioles.</a> Methods in Molecular Biology. 432 (1), 289-300 (2008).</li><li>Borlinghaus, R. T., Kappel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HyVolution-the+smart+path+to+confocal+super-resolution.">HyVolution-the smart path to confocal super-resolution.</a> Nature Methods. 13 (3), (2016).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>de la Rosa-Trev&#237;n, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scipion:+A+software+framework+toward+integration,+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy.">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li><li>Gartenmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combined+3D-SIM/SMLM+approach+allows+centriole+proteins+to+be+localized+with+a+precision+of+&#8764;4-5+nm.">A combined 3D-SIM/SMLM approach allows centriole proteins to be localized with a precision of &#8764;4-5 nm.</a> Current Biology. 27 (19), 1054-1055 (2017).</li><li>Jaenicke, L., Kuhne, W., Spessert, R., Wahle, U., Waffenschmidt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+lytic+enzymes+(autolysins)+of+Chlamydomonas+reinhardtii+are+(hydroxy)proline-specific+proteases.">Cell-wall lytic enzymes (autolysins) of Chlamydomonas reinhardtii are (hydroxy)proline-specific proteases.</a> European Journal of Biochemistry. 170 (1-2), 485-491 (1987).</li><li>Salas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angular+reconstitution-based+3D+reconstructions+of+nanomolecular+structures+from+superresolution+light-microscopy+images.">Angular reconstitution-based 3D reconstructions of nanomolecular structures from superresolution light-microscopy images.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9273-9278 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biyolojide zorluklardan biri bir mimari bağlamda proteinlerin kesin yerelleştirme deşifre etmektir. Onun Mimarlık cryo-elektron tomografi, ilginç ultrastructural özellikleri, uzunluğu boyunca açığa kullanarak okudu gibi centriole bu yöntemleri uygulamak için ideal bir yapıdır. Ancak, çözünürlük limit optik mikroskobu içinde yakın boyutları nedeniyle, tam olarak ayirt geleneksel mikroskoplar30kullanarak centriole bir yapısal alt bölgeye göre bir protein yerelleştirmek zordur.
Optik mikroskobu çözünürlük verir, kabaca, 200 yanal maksimum çözünürlük ışığın kırınım tarafından sınırlı optik mikroskobu24nm. Ancak, bu sınır içinde optik mikroskobu son 20 yılda büyük devrimler biri tarafından olmuştur olmuştur: Süper çözünürlük yöntemleri icadı. Bu yaklaşımlardan farklı çözünürlüklerde kırınım sınırları aşan görüntü: 120 nm SIM için yaklaşık 50 nm için uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) ve 20-40 nm tek molekül yerelleştirme mikroskobu (SMLM)24. Süper çözünürlük mikroskobu ile bu yeni gelişmeler centriole yapısal alt bölgelerinde ulaşılabilir. Ancak, uygulamada, doğru bir protein yapısal bir öğeye lokalizasyonu olgun centrioles hücre başına sadece 2 kopya bulunmaktadır ve yorumlanması kılan rasgele yönleri, var temel nedeni belirlemek hala zor Yerelleştirme zor. Bu nedenle, araştırmacılar tarafından Süper çözünürlük centrioles belirsiz sigara yönelimleri gözlemlemek için şansımızın artması, çok sayıda görüntü için izin veren bir protokol kurulmuştur. Bu yöntem izole centrioles kullanımına dayanıyor gibi önemlisi, bozulmamış C. reinhardtii arındırmak için bir yöntem sağlıyoruz olgun centrioles ve procentrioles içeren centrioles.
Son olarak, bu iletişim kuralıyla görüntüsü centriole yönelimleri aralığı sayesinde, tek-parçacık analiz elektron mikroskobu yazılım kullanılarak uygulanabilir. Belirli bir yönde centrioles ortalama sınıfları nesil sonuçlanır. Önemlisi, elde edilen bu 2B görüntüleri daha sonra belirli bir protein centriole boyunca lokalizasyonu değerlendirmek için kullanılabilir. Nitekim, Çift renkli süper çözünürlük fotoğraf için bu yöntem uygulanabilir ve diğer renk iken centriole iskelet (Örneğin, tübülin), belirli bir centriolar protein bağlanabilir ortaya çıkarmak için bir renk kullanılır. Bir renk veya iki renk ile elde edilen ortalamalar çıkararak, bir protein centriole (proksimal, merkezi veya distal) boyunca kayıt daha kolay olur. Not iki kanal doğru bir şekilde herhangi bir yanıltıcı Yorumları önlemek için uyumlaştırılması gerekmektedir. Ayrıca, en iyi sayısı ortalamaları içinde centriolar lümen, Mikrotubul duvar boyunca veya centriole dışında bir protein yerelleştirir Eğer deşifre yardımcı olacaktır.
Bu yöntem Aksi takdirde türdeş olmayan etiketleme nedeniyle yerelleştirmek zor olabilir belirli proteinlerin yerelleştirme tespit etmek için bir avantajdır. Proteinler centrioles içinde eşlemek için diğer yöntemleri bağdaşık 3-b SIM/SMLM ile içinde örnek olarak, centrioles belirli yönelimleri simit çevresinde oluşturan bir işaretleyici eliptik profil belirlenerek değerlendirilmesi tarif edilmistir olduğunu unutmayın Centriole yanında SIM düşsel. Bu parametreyi kullanarak, 4 – 5 nm30bir hassasiyetle protein yerelleştirmek mümkündür. Ayrıca açıklanan yöntemi burada izole centrioles olduğu gibi procentrioles, centriole mimarisi büyük ölçüde korunmuş en yüksek olduğu bir işaret kullandığına dikkat edin. Ancak, bazı mimari özellikleri gibi insan centrosome5yalıtım ile güçlendirilmiş divalent katyonlar konsantrasyon ile değişen centriole çapı gibi arıtma sırasında rahatsız dışlayamazsınız.
Burada sunulan Protokolü'nün önemli adımlardan biri yeterince konsantre izole centrioles farklı yönelimleri Fluo-SPA için mükellef içinde elde etmektir. Bunu yapmak için önce saflık ve centriole yalıtım yordamı verimliliğini sağlamak. İzole centrioles düşük konsantrasyon uygun görüntüleme ve görüntü işleme daha fazla engeller. Bu amaçla, biz centrioles görüş alanı başına sayısı zenginleştirmek için bir yöntem sağlıyor. Centrioles kullanılan kesir sayısına bağlı olarak, Yoğunlaştırıcı yüklenen birim ayarlanmalıdır, maksimum hacmi 250 µL ile.
Önemlisi, bu yöntem bir hücre duvarı cw15-C. reinhardtii hücreleri eksi için geliştirilmiştir. Bu zorlanma, uygun lizis hücrelerin ve içeriği kurtuluş için böylece, hücre duvarı kırılganlık sağlar. Bu iletişim kuralı için vahşi-türü C. reinhardtii verimli değildir hücreleri, hücre duvarı uygun lizis engeller gibi. Alternatif stratejileri sonication veya autolysin, hücre duvarı31, düşürebilir bir enzim içeren hücrelerin ön kuluçka gibi burada sunulan yalıtım iletişim kuralı uygulamadan önce hücre duvarı alter yerde koymak zorunda kalacaktı.
Bu kurulum, mikroskoplar, geleneksel confocal mikroskoplar yüksek üretilen iş adanmış Süper çözünürlük mikroskoplar için arasında değişen farklı türleriyle kullanılabilir. SMLM yaparken, özel bir arabellek uygun görüntüleme için gerekli olduğunu unutmayın ve bu nedenle, arabellek coverslip üstüne ile 12 mm coverslip için uyarlanmış bir odası kullanılmalıdır. Sonraki görüntüleme ile ters mikroskoplar gerçekleştirilecek. Mikroskop set-up bir 12 mm coverslip izin vermiyorsa, burada sunulan protokolü kullanarak bir 30 mL yuvarlak alt tüp ve değiştirilen adaptör ve yoğunlaştırıcı 18 mm coverslips için uygulanabilir. Ayrıca Not SMLM son yeniden kalitesini boyama ve kullanılan birincil antikor kalitesine bağlı olacaktır, hem de fiksasyon yöntemi için önemlidir.
Özetle, çok sayıda centrioles ardından görüntüye Fluo-ortalamalar centrioles farklı yönleri, oluşturacak böylece hassasiyetle centriolar protein yerelleştirilmesine yardımcı SPA tarafından uygulanan bir yöntem sağlıyoruz. Önemlisi, bu yöntem diğer türlerden izole centrioles, diğer organelleri veya büyük makromoleküllerin grupları daha genel olarak uygulanabilir. Son olarak, örnek hazırlık yaklaşım burada sunulan, son algoritma geliştirme floresan SMLM veri32ile tek-parçacık analiz için kombine, daha da iyileştirme moleküler haritacılık büyük içinde makromoleküllerin açar mısınız derlemeler.

Centriole centrosome hayvan hücrelerinde çekirdek yer alır ve bir bazal vücut (centrioles bundan sonra adlandırılır) şablonu kirpikler veya kamçı birçok Ökaryotlar1,2olarak hareket edebilir bir evrimsel korunmuş organel olduğunu. Bu nedenle, centrioles sinyal hücre için iğ derlemesinden değişen temel hücre biyolojik işlemler için kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, centriole derleme ya da işlev3ciliopathies ve kanser de dahil olmak üzere birçok insan patolojileri ile ilişkili bulunmuştur.
Centrioles nine-fold, simetrik, Mikrotubul üçlüsü tabanlı silindirik yapılar vardır, genellikle, ~ 450 nm uzun ve ~ 250 nm geniş4,5,6,7. Geleneksel elektron mikroskobu ve cryo-elektron tomografi, centrioles farklı türlerden olduğunu açıkladın centrioles üç farklı bölgeleri ile onların uzun ekseni boyunca polarize: proksimal bölge, merkezde bir çekirdek ve distal bölge5 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. önemlisi, her bu bölgede belirli yapısal özelliklerini görüntüler. İlk olarak, 100 mil uzunluğundaki proksimal bölge lümen den iğne başı öğe12Mikrotubul üçlüsü bağlı çember hareketi yapısını içerir. İkincisi, 300-400 nm-uzun iç bölgesi fibröz yoğunlukları mikrotübüller iç yüzü boyunca lümen ve yapısal özellikler içerir: Y-şekilli bağlayıcı, C-tübül kuyruğu ve A-tübül9saplama. Son olarak, 50-100 nm distal bölge distal centriole5,13bölümünü surround alt distal ve distal ekleri sergiler.
Son yirmi yılda yaklaşık 100 farklı proteinler centriole14,15,16, bir parçası olmak bir geçerli tahmini için önde gelen centriolar proteinler giderek artan sayıda keşfi tarafından işaretlenmiş 17. bu gelişmeler rağmen bu proteinler centriole içinde kesin lokalizasyonu zor, özellikle yapısal alt bölge içinde kalır. Önemlisi, hassas bir yerelleştirme centriole yapısal bölgelerine atama işlevlerine daha iyi anlamak için çok önemlidir. Bu bağlamda, C. reinhardtii centrioles ilk sonra verilen silindir9,18,19, boyunca farklı yapısal özellikler delimitating tarafından her iki yönden vesile olmuştur Araştırmacılar bir alt alt yapısal bir bölgesine floresan mikroskopisi kullanılarak proteinlerin lokalizasyonu aralarındaki ilişkileri belirlemektir. Bu, örneğin, proteinler Bld12p ve Bld10p, proksimal bölge ve çember hareketi yapısı özellikle yerelleştirmek20,21,22,23içerir. Yerelleştirilmiş altyapı proteinler listesi de POB15 ve POC16, C. reinhardtii centrioles17iç Merkezi çekirdek bölgenin süslemeleri kütle spektrometresi tarafından tanımlanan iki roman protein içerir.
Bu kağıt yalıtmak ve C. reinhardtii centrioles sonraki süper çözünürlük mikroskobu ve tek-parçacık ortalama için görüntü için geliştirilen Yöntem tam bir açıklamasını sağlar. Bu hedefe ulaşmak için aşılması gereken teknik sınırlamalar betimlemek önemlidir. İlk olarak, centriole arıtma kez yalıtım9çeşitli adımlar sırasında kaybetmiş olmanın çember hareketi yapısı ile genel mimarisi etkileyebilir. İkinci olarak, centriole boyutlarının çok optik mikroskobu kırınım sınıra yakın olduğundan. Gerçekten de, confocal mikroskobu elde edilebilir yanal çözünürlük yaklaşık 200 nm24, centriole ve zçözünürlüğünde çapı benzer olduğunu-eksendir hakkında 2-3 x daha düşük, anisotropic bir birime lider. Üçüncü olarak, antikor etiketleme ve centriole yönlendirme heterojen bir protein belirli bir bölgesinde centriolar alt yerelleştirmek için gerekli yorumu sınırı olabilir. Son olarak, çok sayıda resim elde etmek ve bir benzersiz centriole yön bulmak üzere hücre başına sadece iki kopya centrioles bulunmaktadır. Bu teknik sorunları aşmak için Süper çözünürlük mikroskobu çeşitli yönleri kabul izole centrioles çok sayıda uygulama üzerinde dayanır bir yöntem geliştirdi. Önce yapısal olarak sağlam centrioles ve çember hareketi içeren procentrioles arınma sağlayan C. reinhardtii centrioles arındırmak için bir protokol anlatacağım. Sonra centrioles coverslips tarafından geleneksel görüntüleme veya Süper çözünürlük floresan mikroskopi için konsantre için adım adım bir protokol anlatacağız. Bu önemli bir adım centrioles içinde birden fazla yönelimleri yansıma sayısını artırmak için sağlar. Son olarak, tek-parçacık farklı yönelimleri centrioles algılama kolaylaştırır floresan mikroskoplar alınan veriler üzerinde ortalama gerçekleştirmek için bir prosedür anlatacağım. Özet olarak, bu yöntem görüntü centrioles için çeşitli türler veya diğer büyük makromoleküllerin grupları uygulanabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="962">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Mouse monoclonal anti-apha tubulin (clone DM1A)</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab7291&#160;</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNaseI</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10104159001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">12 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>YX03.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">18 mm coverslips</td>
			<td>Roth</td>
			<td>LH23.1</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">K2HPO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60355</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">KH2PO4</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>60230</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tris base</td>
			<td>Biosolve Chimie SARL</td>
			<td>0020092391BS</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">acetic acid</td>
			<td>Carlo Erba Reagents</td>
			<td>524520</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NH4Cl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-4514</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C-7902</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>63140-500G-F</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">steritop filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPT05RE</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7903-1KG</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A3724,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6757-500G</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">MgCl2</td>
			<td>ACROS ORGANICS</td>
			<td>197530010</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NP-40</td>
			<td>AppliChem PanReac</td>
			<td>A1694,0250</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 15 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-34</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Round-bottom (Kimble) tubes 35 mL</td>
			<td>Fisherscientific</td>
			<td>09-500-37</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">cover glass staining rack</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>8542E40</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">crystal polystyrene transmission lab box</td>
			<td>FISHERS</td>
			<td>11712944</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20864.32</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BSA</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735086001</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X100</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3051.3</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-mouse coupled to Alexa 488&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11029</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">goat anti-rabbit coupled to Alexa 568</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>A11036</td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">mounting medium</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tube, thinwall polypropylene</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>326823</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Poly-D-Lysine 1 mg/mL</td>
			<td>SIGMA&#160;</td>
			<td>A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Mouse monoclonal anti-Polyglutamylation modification mAb (GT335)</td>
			<td>Adipogen</td>
			<td>AG-20B-0020</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">glycerol mounting medium with DAPI and DABCO</td>
			<td style="width:155px;">Abcam</td>
			<td style="width:171px;">ab188804</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:155px;">Falcon</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td style="width:155px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:171px;">5811000622</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman JS-13.1 swinging bucket rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>346963</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Beckman SW 32Ti rotor</td>
			<td style="width:155px;">Beckman Coulter</td>
			<td>369694</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">parafilm</td>
			<td style="width:155px;">Bemis&#160;</td>
			<td>13-374-10</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Leica TCS SP8 with Hyvolution mode</td>
			<td style="width:155px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">OSRAM L18W/954 LUMILUX&#160;</td>
			<td style="width:155px;">Luxe Daylight/ OSRAM</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Whatman filter paper</td>
			<td style="width:155px;">Sigma&#160;</td>
			<td>WHA1001325</td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">CrSAS-6/Bld12 antibody</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;">dilution 1:300 (Hamel el al, 2014)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">Scipion</td>
			<td style="width:155px;">http://scipion.i2pc.es/</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:325px;">EM CCD camera (Andor iXON DU897)</td>
			<td style="width:155px;">Andor</td>
			<td style="width:171px;"></td>
			<td style="width:313px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and fluorescence imaging for single-particle reconstruction of chlamydomonas centrioles

Centrioles büyük makromoleküllerin grupları temel hücre hücre bölünmesi, hücre hareketliliği veya hücre sinyallemesi biyolojik işlemler düzgün yürütülmesi için önemli olan. Yeşil algler Chlamydomonas reinhardtii çalışmaya centriole mimari, işlev ve protein kompozisyon anlayışlı bir model olduğu ispatlanmıştır. Anlayış centriolar mimari doğru büyük gelişmeler rağmen mevcut zorluklardan biri içindeki rolü daha iyi anlamak için centriolar bileşenleri yapısal centriole bölgelerinde içinde kesin lokalizasyonu tespit etmektir Centriole Biyogenez. Büyük bir sınırlama bu organel kırınım sınıra yakın boyutları ile protein yerelleşme yorumlanması için sadelik floresans mikroskobu ile çözünürlükte yatıyor. Bu soruyu çözmek için biz bir yöntem arındırmak ve C. reinhardtii centrioles, çok sayıda farklı yönelimleri Süper çözünürlük mikroskobu kullanarak görüntü sağlıyor. Bu tekniği daha da floresan tek-parçacık (Fluo-SPA) satın centrioles çok sayıda nedeniyle ortalama ile veri işleme sağlar. Fluo-SPA oluşturur ortalamalar, C. reinhardtii centrioles farklı yönleri, böylece centriolar alt bölgelerinde farklı proteinler lokalizasyonu kolaylaştırmak içinde lekeli. Önemlisi, bu yöntem diğer türler veya diğer büyük makromoleküllerin grupları görüntü centrioles için uygulanabilir.

C. reinhardtii Centriole yalıtım: Centrioles, cw15- yalıtmak için C. reinhardtii hücreleri birkaç gün ışığı altında sıvı kültüründe yetiştirilen ve 10 dk. Pelleted hücreleri 1 x PBS ile yıkanmış için daha sonra Santrifüjü vasıl 600 x g tarafından pelleted ve içinde resuspended bir arabellek öncesinde son pH 4,5-4,7 değeri 0,5 M asetik asit 2 dk(Şekil 1)kullanarak bir pH şok gerçekleştirerek deflagellation deflagellation. 1 N KOH ekleme pH 7,0 için geri yüklemek için kullanıldı. Müstakil kamçı hücre vücutlarından ayırmak için deflagellated hücreleri ilk kamçı toplu kaldırmak için centrifuged. Pelet yapıldı sonra PBS ile 2 x yıkanmış ve yavaş yavaş bir % 25-sükroz yastık (Şekil 1B) önce yükleme 30 mL PBS resuspended. Tüp 600 x g 4 ° C'de müstakil kamçı çoğunu kaldırmak için 15 dk, bükülmüş. Santrifüjü sonra hücre cesetleri yayılır sukroz yastık (Şekil 1C) ve kaldırarak kurtarılan yaklaşık 30 mL süpernatant (kadar kırmızı ok Şekil 1C). Yıkanmış hücre elde edilen 20 mL sonra 20 mL soğuk PBS resuspended ve 600 x g 10 min için de centrifuged. Daha sonra süpernatant atıldı ve hücreleri tamamen 10 mL PBS resuspended. Hücreleri 250 mL şişe transfer edildi ve lizis arabellek resuspended hücrelere hemen eklendi. DNaz lizis için eklendi ve 1 h 4 ° C'de inkübe Hücre artıkları kaldırmak için bir Santrifüjü adım sonra (bkz. Şekil 1Dbeyaz Pelet) süpernatant ve dikkatle üzerine 2 mL % 60-sükroz yastık Santrifüjü 10.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de önce yüklü toplanır Lizis için 100 mL unutmayın, 15 mL 8 Tüpler 12,5 mL sukroz tüp başına 2 mL yüklendi lizis arabellek karşılık gelen bu adımı gerçekleştirmek için kullanıldı. Santrifüjü sonra süpernatant çoğunu kaldırıldı ve minder üstünde ilâ 1 mL. Kalan süpernatant 1 mL sonra 2 mL yastık ile toplanan ve daha sonra karışık ve 24 mL son hacmi elde etmek için havuza alınmış. Havuz sonra bir 40 dolu olduğunu % - %50, % 70-sükroz degrade ve bükülmüş 68,320 x g 1 saat 15 dk 4 ° C'de için de Son olarak, izole centrioles bir iğne kullanarak Santrifüjü tüp alt kısmında bir delik yaparak toplanmıştır ve damla 12 x 500 µL kesirler içinde toplanmıştır. Farklı sükroz yüksek yoğunluk nedeniyle, çok yavaş başlangıç (% 70 sükroz) ve sonra daha fazla damla kurulan hızla (% 40 sükroz).
İzole Centrioles ayirt Yalıtım yordamı kalitesini değerlendirmek için toplanan her degrade kesir 10 µL sonra bir coverslip destek adaptör (Şekil 2A-2B) kullanarak bir coverslip centrifuged. Önemlisi, coverslip güvenle kaldırmak için özel bir çengel aygıt dizayn edilmiştir (Şekil 2B). Daha sonra coverslips ayirt tarafından analiz edildi. CrSAS-6(Bld12p) karşı antikor Bu çalışmada çember hareketi yapısı ve α-tübülin (DMA1) centriolar duvar vurgulamak için varlığı belirtmek için kullanılmıştır. CrSAS-6 ve α-tübülin görüş alanı başına olumlu centrioles sayılması ve centrioles kesirler başına toplam sayısının hesaplanmasında hangi kesirler izole centrioles ( zenginleştirilmiş belirlemek mümkün Rakam 2F-2 H). Son kesirler arıtma işe yaradığını gösteren değil, iken ilginçtir, 6 kesirler (Şekil 2F ve 2 G, kesirler #1-6), centrioles için kesir #3, bir tepe ile zenginleştirilmiş. Belirli bu deneyde, toplam centrioles % 95'i CrSAS-6 ve α-tübülin kesir #3 için olumlu olduğunu unutmayın. Bu en izole centrioles onların saldırı korunur belirtir. Hiçbir zenginlik centrioles ilk kesirler gözlem yapılırsa, yalıtım yordam işe yaramadı ve yinelenmelidir. Not Bazı kamçı parçalar çoğunlukla kesirler centrioles yoksun olarak görülebilir.
Ardından, centrioles µL başına toplam sayısını hesaplamak için sayısının centriole görüş alanı başına Şekil 2' deHsunulan oranla çarpımı. Ortaya çıkan sayı sonra için ayirt centrioles µL başına sayısı elde etmek için kullanılan kesir hacmen bölünmüş olmalıdır. Bu özel yalıtım yordamda en zenginleştirilmiş kesir (ile görüş alanı 92 x 92 µm2) 0.00846 mm2 bir bölgenin yaklaşık 37 centrioles içerdiği. Yüzey tüp bölümünün 7.5 mm çapındaki 176 mm2toplam yüzey ile oldu. Karşılık gelen oranı sonra 176/0.00846 oldu 20,803.8, yani = toplam 10 µL içinde 769,740 centrioles (37 x 20, 803.8). Bu nedenle, 1 µL centrioles sayısı 76,974 oldu.
İzole Centrioles konsantrasyonu Coverslips üzerinde: Centrioles başına sayısını artırarak daha fazla parçacık ortalama yordamlar için kullanılan benzer yönler tespit şansımızın artması yanı sıra kesin centriole yönünü tespit olasılığını artırır. Centrioles konsantre kesirler üzerinden coverslip üzerinde hala seyrek olduğu için centrioles bir yoğunlaştırıcı adlı coverslip (Şekil 3A) ortasında konsantre bir Santrifüjü aksesuar geliştirdik. 3-b yazdırma için kesin önlemler ile bir .stl dosyası bu el yazması ile temin edilebilir.
İlk olarak, 12 mm bir coverslip yoğunlaştırıcı (Şekil 3B) monte edilmiş. Adaptör coverslip üzerine yerleştirildi ve yuvarlak alt tüp ters ve birleştirilmiş adaptör ve yoğunlaştırıcı yerleştirilir. Yuvarlak alt tüp sonra yavaşça, böylece örnek (iletişim kuralı adım 4.2) yüklenmesini sağlayan ters. Centrioles sonra 10.000 x g 4 ° C'de 10 dakika için de centrifuged Bundan sonra centrioles ayirt için tabi ve CrSAS-6/Bld12p ve α-tübülin (Şekil 3 c-3E) için lekeli. Önemlisi, dar kurutma başlığını kullanılan (şekil 3D-3F) yaşındayken 183 centrioles görüş alanı görüldü ise yoğunlaştırıcı, görüş alanı (Şekil 3C), yaklaşık 30 centrioles görüldü. Centrioles 4 mm çapında coverslip ortasında tek bir diski kaplı unutmayın. Bu sonuç konsantrasyon adım çalışır ve böylece algılama hareket hızı ve görüntüleme coverslips tanımlanmış bir bölgede centrioles 6-fold bir zenginlik sağlar gösterir.
Floresan tek-parçacık izole, ortalama C. reinhardtii Centrioles: Burada, yaklaşık 120 çözünürlüğe ulaşabilirsiniz SIM mikroskobu kullanarak görüntülü24nm, monoglutamylated tübülin (GT335, Şekil 4), centriolar mikrotübüller içinde mevcut bir tübülin değişiklik için lekeli centrioles vardı. C. reinhardtii centrioles olan yaklaşık 500 nm her zaman çiftler halinde uzun ve sık sık bulunan ile ilişkili olan, yeni probasal organları (procentrioles bundan sonra adlandırılır) çoğaltılamaz ve çizgili Mikrotubul ilişkili lifleri19. Bu nedenle, bu son montaj yaklaşık 1 µm büyük oldu. Bu nedenle ve tamamen centrioles görüntü için Z yığında izole centrioles satın öneririz.
Burada, satın alma sonra ImageJ28 (resim/yığınları/Z proje/en fazla yoğunluk projeksiyon, Şekil 4B) kullanarak bir maksimum yoğunluk projeksiyon yaparak son görüntü oluşturuldu. Böyle görüntüleri, bir tek-parçacık analiz cryo-elektron mikroskobu yazılımını kullanarak sınıfların centrioles benzer yönler ile yapmak gerçekleştirildi ve sonra ortalama gerçekleştirildi. Bunu yapmak için resmin rengini ilk nesneleri (Şekil 4C) daha iyi görmek için ters. Centrioles aldı el ile Xmipp3 gibi birkaç elektron mikroskobu yazılım programları entegre ve serbestçe kullanılabilir durum yazılım29 kullanarak her parçacık üzerinde ortalanmış bir kutusunda (Şekil 4D). Kutusunun boyutunu Kullanıcı tarafından tanımlanmış olması gerektiğini unutmayın. Burada, 31.84 bir piksel boyutu için 50 x 50 piksel kutularca nm kullanılmıştır. Ardından, tüm parçacıklar vardı (Şekil 4E) çıkarılan ve Xmipp3 kullanarak uyumlu (Şekil 4F). Ardından, dairesel bir maske 12 piksel yarıçapı her centriole centriolar çifti (Şekil 4G) üzerinden yalıtmak için uygulandı. Parçacıklar sonra sınıflandırılmış Xmipp3, birkaç ortalamalar üretmek için kullanıyorum. Sadece sınıf ortalamalar sapmak parçacıklar el ile dışlandı anlam homojen sınıf ortalamaları tutuldu. Bu adım, seçilen her yönü için kusursuza yakın ortalama oluşturmak için tekrarlandı. Beş yineleme sonra iki sınıf ortalama örneği oluşturulan: 63 nesneleri (Şekil 4H) en iyi bir görünüm ve bir yan görüntülemek 98 parçacıkların monoglutamylated centrioles (Şekil 4ben). Nesne boyutları yoğunluğu Arsa profil monoglutamylation sinyal boyunca doruklarına arasındaki uzaklığı ölçülerek belirlenmiştir.
Önemlisi, yan görünümü sınıf ortalama uzunluğu 260 ise nm çapında 250 nm, çekirdek içinde uzunluğu centriole17286 ± 33 nm bir bölgesine yerelleştirmek için gösterildi ölçülen monoglutamylated tübülin sinyal karşılaştırılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig1.jpg"> Resim 1 : Arıtma C. reinhardtii centrioles. (A)bu C. reinhardtii centrioles yalıtım için önde gelen her adım şematik gösterimi. Santrifüjü % 25-sükroz degrade üzerine sonra önce Protokolü (B) ve (C) temsilcisi adımları içerir. C panelinde kırmızı ok Santrifüjü sonra tutmak için en küçük birim gösterir. (D) Bu panel lysed hücre beyaz Pelet Santrifüjü sonra gösterir. Siyah oku Pelet gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig2.jpg"> Resim 2 : Ayirt gerçekleştirileceği Santrifüjü set-up izole centrioles. (A) 10 µL toplanan her kesir, 100 µL (pH 7.2) 10 mM K-borular içinde seyreltilmiş ilk. (B) bu kapsayan bir 15 mL yuvarlak alt Tüp, 12 mm coverslip, coverslip için bir adaptör Santrifüjü cihazlar ve coverslip sonra Santrifüjü kurtarmak için ısmarlama bir çengel cihaz, şematik bir gösterimidir. Panelleri C ve D coverslip aralıklarla sonra kurtarmak açıklayan çizimler göster. (D) ve (C) yer çengel araç adaptörü oluklu kenarına mevcut deliğe yavaşça çekin. (E) bu resimleri ayirt görüntüleme gerçekleştirmek için gereken nemli odası vardır. Ok 12 mm coverslip gösterir. (F) bu (2 zoom) 63 X degrade kesirler #1-8, arıtma işlemi sırasında toplanan temsilcisi confocal görüntülere ve CrSAS-6 (kırmızı) ve α-tübülin (yeşil) için lekeli. İnsets beyaz kutu daha düşük büyütme sayısı olarak belirtilen bölge karşılık gelir. Ölçek çubuğu 10 µm. (G) = CrSAS-6 ve α-tübülin her kesir görüş alanı başına centrioles olumlu sayısını gösteren bir grafiktir. Zenginleştirme kesirler #1-6 Not. Centrioles her kesir alanında başına ortalama sayısı: #1 = 16,3 ± 4.7, #2 = 24.0 ± 4.6, #3 = 37,0 ± 17,0, #4 = 23.3 ± 11,4, #5 = 14,3 ± 2.1, #6 = 13,7 ± 9.3, #7 = 2.7 ± 1.2, #8 = 1.0 ± 0.0, #9 = 1.0 ± 0.0, #10 = 0.0 ± 0.0, #11 = ± 0,3 0,6, #12 = 0.0 ± 0.0. Her bölümü için 3 rasgele alanı görüntüsü. En zenginleştirilmiş kesir #3 sayarken centrioles % 95'i CrSAS-6 ve α-tübülin için olumlu bulduğumuzu, Not (n = 205 centrioles). Centrioles filmler ölçülen alanın mevcut sayısı oranını (H) A centrioles tüp alanında mevcut toplam sayısını hesaplamak için kullanılır. Centriole numarası µL başına 10 µL aslında centrifuged kesirler hesaplanır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig3.jpg"> Şekil 3 : İzole centrioles centrifuged bağlantı, dağıtma kutuları kullanarak. (A) Bu panel gösterir centrioles coverslips ayirt 15 mL yuvarlak alt Tüp, yoğunlaştırıcı, 12 mm coverslip ve bir destek adaptör aparatı dahil olmak üzere önce üzerine konsantre için gerekli Santrifüjü cihazlar. (B) Bu panel Santrifüjü cihaz montajı için gereken adımları gösterir. Panelleri C-E CrSAS-6 (kırmızı) ve α-tübülin (yeşil) (C) olmadan veya (D-E) için dar kurutma başlığını ile lekeli centrioles confocal görüntülerini göster. İnsets beyaz kutu daha düşük büyütme sayısı olarak belirtilen bölge karşılık gelir. Ölçek çubuğu 10 µm. centrioles (konsantre alan kenarlığını noktalı çizgi gösterir) coverslip ortasında zenginleştirilmiş Not olduğunu. (F) Bu grafik centrioles görüş alanı olmadan ve dar kurutma başlığını başına sayısını temsil eder. Beş rastgele alanlar bakış analiz edildi. Centrioles ortalama sayısı, yoğunlaştırıcı, 29.8 ± 2.9, olmadan ve yoğunlaştırıcı, olduğunu 182.6 ± 11.5, P < 0,0001. İstatistiksel anlamlılık bir unpaired ttarafından değerlendirildi-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58109/58109fig4.jpg"> Şekil 4 : Tek-parçacık izole üzerinde ortalama C. reinhardtii centrioles. (A) Bu panel gösterir Z yığın görüntüleri ile GT335 lekeli ve SIM mikroskop kullanarak elde centrioles. (B) bu paneller bir maksimal yoğunluğu Z projeksiyon yığılmış görüntülerin göster. Ölçek çubuğu 1 µm. (C) bu panelleri göstermek bir temsili resim ters bir kontrast =. İlave bir zum centrioles daha iyi görselleştirmek için bileşenini temsil eder. (D) bu paneller Haritayı parçacık malzeme çekme. İlave nasıl parçacıklar tutuklandılar gösterir. (E) çıkarılan 5 örnekleri bunlar parçacıklar. (F) Bu panel parçacıklar hizalama sonra gösterir. (G) Bu panel parçacıklar bir maske uygulandıktan sonra gösterir. Panelleri H ve ı göstermek iki sınıf ortalama: (H) bir üst görünüm (63 parçacıklar) ve (ı) bir yan görünüm (98 parçacıklar). Çift Kişilik oklar GT335 sinyal boyutları gösterir. Ölçek çubuğu = 250 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/58109fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
Ek dosya 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/Adaptor_coverslip.stl" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58109/concentrator.stl" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles at JoVE.com

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Yalıtım ve floresan görüntüleme Chlamydomonas Centrioles tek-parçacık yeniden inşası için

Arındırmak ve centrioles farklı yönelimleri Süper çözünürlük mikroskobu ve tek-parçacık ortalama için mükellef içinde çok sayıda resim için bir strateji geliştirdik.

Centrioles are large macromolecular assemblies important for the proper execution of fundamental cell biological processes such as cell division, cell ...

Bu yöntem, centriole alanında anahtar soruya cevap yardımcı olabilir, centriole belirli bir bölgeye protein lokalize gibi. Bu tekniklerin en büyük avantajı, centriole'u birden fazla oryantasyona kazandırmak için konsantre olmamızdır. Bu yöntem Chlamydomonas centriole biyolojisi hakkında bilgi sağlasa da, izole edilmiş insan ve paramesyum centrioles gibi diğer sisteme de uygulanabilir.Prosedürü gösteren doktora öğrencisi Nikolai Klena, bir diğer doktora öğrencisi Maeva Le Guennec ve davide Gambarotto laboratuvarında doktora sonrası olacak. Bu yordamı başlatmak için, öncelikle tüm medya ve kültür C.Reinhardtii hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Hazırlanan hücreleri 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve 10 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüj edin.Peleti 50 mililitre 1x PBS ile yıkayın ve hücreleri 10 dakika boyunca 600 kez tekrar döndürün. Oda sıcaklığında deflagellation tampon 100 mililitre pelet resuspend için bir pipet kullanın. Bir manyetik karıştırıcı üzerine kabı yerleştirin ve yavaş yavaş 4,5 ila 4,7 son pH 0,5 molar asetik asit ekleyin.Bu karışımı iki dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bu yavaş yavaş 7.0 pH geri yüklemek için normal bir potasyum hidroksit damla eklemek sonra, hücreleri 50 mililitre tüplere aktarın ve 10 dakika boyunca 600 kez g santrifüj, herhangi bir müstakil kamçı kaldırmak için. Supernatant atın ve yıkamaya hazır olana kadar buz üzerinde pelet saklayın.Hazır olduğunuzda, peleti yıkama başına dört santigrat derecede 50 mililitre 1x PBS kullanarak iki kez yıkayın. Yıkanmış peleti 600 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika döndürün. 1x PBS 30 mililitre pelet resuspend.Daha sonra süspansiyonu karıştırmadan %25 sakarozluk tan 20 mililitrelik bir yastığa yavaşça yükleyin. Kalan kamçıları çıkarmak ve hücreleri sakaroza yaymak için 15 dakika boyunca 600 kez g ve 4 santigrat derece de döndürün. Bir aspiratör kullanarak, dikkatle supernatant sadece alt-en 20 mililitre tutarak aspire.Kalan sakaroz 20 mililitre soğuk 1x PBS ekleyerek yıkayın. Santrifüj 600 kez g ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derece. Peleti 10 mililitre 1x PBS'de dört santigrat derecede yeniden askıya alın ve çözeltide küme lenme olmadığından emin olun.Yeni bir 250 mililitrelik şişe için resuspended pelet aktarın, lysis tampon ekleyin, dNase 5, 000 birimleri ile takviye, hücreleri içeren şişeye. Şişeyi dikkatlice ters çevirerek her 15 dakikada bir karıştırArak bir saat boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın. Lysed hücreleri 50 mililitrelik konik tüp ve santrifüj e 600 kez g ve 4 santigrat derece 10 dakika aktarın.Bir pipet kullanarak, supernatant toplamak ve% 60 sakaroz yastık iki mililitre içeren buz üzerinde 30 mililitre yuvarlak alt tüp içine yükleyin. Bunu 10,000 kez g'de 4 santigrat derecede 30 dakika santrifüj edin. Bundan sonra, sakaroz yastığı üzerinde bir mililitre kadar supernatant aspire.Kalan supernatant bir mililitre arasındaki sarı arayüzü unutmayın, ve sakaroz yastık iki mililitre. Kesilmiş bir P1000 ucu kullanarak, kalan supernatant'ı sakarozla hafifçe karıştırın. Tüm sakaroz yastıklarını havuza alın ve buzüzerinde saklayın.Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi ince duvarlı 38,5 mililitrelik polipropilen tüpte %40 ila %70 sakaroz gradyanı hazırlayın. Havuzlu arabirimleri yavaşça degradeye yükleyin. Tüpleri 10 milimolar K-PIPES tamponu yla dengeleyin ve 68, 320 kez g ve 4 santigrat derece ile 75 dakika boyunca santrifüj edin.Bundan sonra, farklı sakaroz katmanları rahatsız değil emin olmak, tüp altında bir delik yapmak için 0.8 milimetrelik bir iğne kullanın. Dört santigrat derecede 12 500 mikrolitre kesirtoplamak için bu deliği kullanın. Bir kesme P200 ucu kullanarak, immünoresans sırasında kullanılmak üzere her fraksiyondan ek bir 10 mikrolitre aliquot hazırlamak.Daha sonra sıvı nitrojendeki kesirleri tutturun. Başlamak için, pdl kaplı tarafı aşağıda tutmak için emin olun, konsantratörün gömme alt ucuna steril 12 milimetrelik bir kapak kayma yerleştirin. Adaptörü doğrudan üstüne yerleştirin, kapak kapağı için.Daha sonra, yuvarlak alt tüp ters ve konsantratör, coverslip ve adaptör üzerine yerleştirin. Cımbız kullanarak, yavaşça tüpün altına ulaşana kadar topluluk itin ve sonra tüp ters. Konsantratörün tepesine ulaşana kadar 10 milimolar K-PIPES tamponekleyin.Konsantratörün merkezi silindirinde kabarcık olmadığından emin olun. 10 milimolar K-PIPES tamponunun 100 mikrolitresini zenginleştirilmiş centriolar fraksiyonun aliquotlarından birine hafifçe ekleyin ve P200 pipet kullanarak iyice karıştırın. Daha sonra, 100 mikrolitre K-PIPES tamponu konsantratörün içi boş merkezinden çıkarın ve içindekilerin konsantratörün içi boş merkezinde kalmasını sağlayarak tampon fraksiyonkarışımının 100 mikrolitresini ekleyin.Önceden soğutulmuş bir santrifüjde 10,000 kez g'de 10 dakika boyunca döndürün. Bundan sonra, konsantratörü çıkarmak için cımbız kullanın. Adaptörün oluklu kenarında bulunan deliğe el yapımı kancalı bir cihaz yerleştirin ve kapak kaymasını kurtarmak için hafifçe kaldırın.Tüpün üst tarafına ulaştığında, adaptörün kenarını tuzağa düşürmek için eldivenli bir parmak kullanın ve kapağın hangi tarafında santrikül ler olduğuna dikkat edin. Daha sonra, konsantre centrioles fiksasyon ve immünofloresan boyama gerçekleştirin. Başlamak için, 5 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede %100 metanol le dolu hazırlanmış kristal polistiren iletim laboratuarı kutusundaki centrioles ile kapakları kuluçkaya yatırın.Cımbız kullanarak, kapakları 50 mililitre 1x PBS ile dolu şeffaf bir laboratuvar kutusuna aktarın. Slaytlar oda sıcaklığında beş dakika PBS yıkama sağlar. Daha sonra, pipet 60 mikrolitre birincil antikor karışımı nın üzerine nemlendirilmiş bir odada ki laboratuvar sızdırmazlık sarması parçasının üzerine.Kapaklarını antikor karışımının üzerine dikkatlice döşeyin ve doğrudan damlaya bakan centrioles'ları ayarlayın. Kapaklar 45 dakika kuluçkaya yatsın. Bundan sonra, kapakları çıkarın ve beş dakika pbs içeren bir kutu içinde yıkayın.Yıkanmış kapakları 45 dakika kuluçkaya yatırın, PBS %1 BSA ve %0.05 Tween-20'de ikincil antikorlar. Kapakları çıkarın ve PBS içeren bir kutuda beş dakika yıkayın. Normal bir solmaya karşı montaj ortamı kullanarak, kapak kaymasını bir slaytüzerine titretin.Daha sonra, bir konfokal mikroskop üzerinde bir 63X yağ hedefi bir N.A.of 1.4 ile izole centrioles görüntü, dekonvolution uygularken. Z-yığınının üst ve alt pozisyonunu sırasıyla centriole sinyalinin üstünde ve altında ayarlayın ve toplam centriole sinyalinden oluşan büyük bir görüntü yığını edinin. Yığını projelendirin ve metin protokolünde belirtildiği gibi tek parçacık ortalamasını gerçekleştirin.Temsili immünoreskence altı fraksiyonları izole centrioles için zenginleştirilmiş olduğunu ortaya koymaktadır, kesir sayısı üç için bir tepe ile, son iki kesirler değildir, arınma başarılı olduğunu gösteren. Konsantratörü olmadan görüş alanı başına sadece 30 centrioles görülürken, 183'ü konsantratörile birlikte görülür. Bu, konsantratör adımının başarılı olduğunu gösterir ve tanımlanmış bir bölgede centrioles altı kat zenginleştirme sağlar, daha kolay tespit ve görüntü için yapım.Süper çözünürlüklü mikroskopi daha sonra monoglutamylated tubulin için boyanmış centrioles görüntü için kullanılır ve yazılım seçilen her yönelim için neredeyse mükemmel bir ortalama oluşturmak için kullanılır. Beş yinelemeden sonra, monoglutamylated centrioles:63 nesnelerden bir üst görünüm ve 98 parçacıktan bir yan görünüm olmak üzere iki ortalama sınıfı oluşturuldu. Yan görüş sınıfı ortalamasının uzunluğu 250 nanometre çapında 260 nanometredir ve santimetrenin çekirdeğinde lokalize olduğu görülen ölçülen monoglutamylated tubulin sinyaliile karşılaştırılır.Bu işlemi gerçekleştirirken, izole centriole buz üzerinde tutmak ve izolasyon sonra onları snap-freeze hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, centriole veya centriole protein bileşiminin doğal mimarisi gibi ek soruyu cevaplamak için kriyo-elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi gibi başka bir yöntem de uygulanabilmektedir.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Fluorescence Imaging for Single-particle Reconstruction of Chlamydomonas Centrioles

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Mating and Tetrad Separation of Chlamydomonas reinhardtii for Genetic Analysis

Çiftleşme ve tetrad Ayırma Chlamydomonas reinhardtii Genetik Analiz

The unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii (Chlamydomonas) has become a popular organism for research in diverse areas of cell biology and ...

Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Tüm Kalp Görüntüleme Floresan Optik Projeksiyon Tomografi tarihi Normalizasyon

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Tek Parçacık Düzeyinde Viral Fusion Kinetik Ölçüm yöntemi

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Rastgele Konik Tilt Yöntemiyle Exosome Kompleksi Tek Parçacık Elektron Mikroskobu İmar

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Mikrosirkülasyon intravital Floresans Görüntüleme Microiontophoresis ve Mikromanipülasyon

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Görüntüleme ve Embriyonik Zebra balığı Serebrovasküler Yapıların 3D İmar

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Bir nanometre Hassasiyet Floresans Görüntüleme (Fiona)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...