Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den canadiske institutter for sundhedsforskning (148808 og 148792), SE blev støttet af et hjerte og slagtilfælde Foundation, personale award fra Ontario Provincial Office, March of Dimes, Ted Rogers Centre for hjertet forskning og Peter Munk Hjertets centrum. XCC besidder en CIHR Banting Fellowship. LA holder en Heart & streg/Richard Mariannes Studentship Award.

Etik erklæring: denne protokol har gennemgået og godkendt af Animal Care Udvalget på University Health Network (Toronto, Canada) og er i overensstemmelse med den canadiske Rådet på Animal Care.
1. buffer forberedelse
<ol><li>Forberede Ulla buffer (Hank's Balanced Salt løsning (HBSS), 2% varme inaktiveret bovint serum, 0,2% bovint serumalbumin). Tilsæt 10 mL af varme inaktiveret bovint serum og 1 g af bovint serumalbumin 500 ml HBSS. Filter sterilisere gennem en 0,2 µm filter og opbev...

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

Myokardial betændelse eller myocarditis, er en funktion af mest hjerte-kar-sygdomme. Myokardiet er imidlertid ikke sin egen immunkomponenter i ikke-sygdomstilstande. I steady state, mange immunceller bor i myokardiet og spille de afgørende roller i vedligeholdelse og beskyttelse. Karakterisering af disse forskelligartede befolkningsgrupper af celler ville ikke have været muligt uden metoder som præsenteres i denne protokol.
En kombination af mekanisk og Enzymatisk nedbrydning af myokardiet...

Forskellige former for Myokardie stress eller skade, herunder iskæmisk (iskæmi reperfusion eller myokardieinfarkt) og ikke-iskæmisk (hypertension eller Myokarditis), fremme af ansættelse af inflammatoriske celler med reparative og beskyttende, men også sygdomsfremkaldende egenskaber. Allerede i 1891, beskrevet Romberg først tilstedeværelsen af cellulære infiltrater i myokardiet hos patienter smittet med tyfus og skarlagensfeber1. Men den detaljerede undersøgelse af hjertets immunceller kræves udvikling af mere avancerede Immunofænotypning-teknikker. Som en konsekvens, har først for nylig vi begyndte at forstå, at en forskelligartet befolkning på immunceller med vigtig vedligeholdelse roller under steady state er bosat inden for myokardiet.
Histologi har været og stadig er den mest almindelige metode til at karakterisere hjerte immunceller under betændelse. Men mens histologi repræsenterer et værdifuldt diagnostisk redskab, dets anvendelse i studiet af cardiac immunceller har vigtige begrænsninger. Immunceller bosat i myokardiet repræsenterer en meget lille andel af de samlede celler og er mere eller mindre jævnt fordelt i et forholdsmæssigt enorme rum. Tilsvarende vis flere former for hjerte betændelse, såsom viral myocarditis, fokale mønstre af betændelse. Det betyder, at præcis analyse af immunsystemet af hjertet ofte kræver højere grader af histologiske prøveudtagning, øger omkostningen ved at reducere bias. Derudover giver histologi en meget begrænset mængde brugbar information i celle identifikation (f.eks. antallet af parametre). Med et stadigt stigende antal celle subsets, der kræver brug af flere udtryk markører (herunder celleoverflademarkører, transkriptionsfaktorer eller udskilles molekyler), har flowcytometri etableret sig som den mest kraftfulde værktøj til Immunofænotypning, på grund af lave omkostninger og høj overførselshastighed.
Brugen af Immunofænotypning teknikker er stærkt afhængige af udviklingen af effektiv fordøjelse protokoller, der er tilladt for single-celler analyse af et stort antal celler. Udviklingen af udtømmende protokoller af celle udvinding åbnes et nyt vindue af muligheder i studiet af cardiac immunologi. Gennem kombinationen af fordøjelsen, flowcytometri og transcriptomics, har de store populationer af makrofager og dendritiske celler bosat i hjertet blevet karakteriseret2,3. Den mest rigelige befolkning af cardiac immunceller under steady state er CD64+MerTK+ makrofager, der yderligere kan inddeles baseret på deres udtryk for CCR2 eller CD11c2. CCR2+ makrofager stammer fra voksne knoglemarv bloddannelsen, mens fleste af CCR2- makrofager, der kan udtrykke høje eller lave niveauer af MHC-II, er hovedsagelig af prænatal oprindelse. Makrofager udføre vigtige funktioner såsom reparation4 og fjernelse af vragdele5 under skade eller støtte elektrisk connectivity6 i steady state. Forskellige former for inflammation en vigtig tilstrømning af Ly6CHej MHC-IIlo CD64int monocytter forekomme, som senere differentiere i Ly6CHej CCR2+ makrofager2,7 . En betydeligt mindre, men vigtige, befolkningen i celler bosat i myokardiet af sunde individer er sammensat af dendritiske celler8,9. De to store delmængder af cardiac konventionelle DCs (cDCs) har været for nylig præget: cDC1 (CD103+ DCs) og cDC2 (CD11b+ DCs). DCs spiller en vigtig rolle i forsvaret mod infektion8 men kan også fremme self-skade under betændelse, især under myokardieinfarkt9.
Her, beskriver vi en simpel metode til dyrkning af levedygtige hjerte immunceller fra musen myokardiet. Metoden kombinerer enzymatiske og mekaniske fordøjelse med en celle-si filtrering for at opnå en enkelt cellesuspension, der kan analyseres, eller yderligere renset af flow flowcytometri sortering eller magnetisk bead berigelse. Præcise målinger af ekstravaskulære Myokardie celler kræver hjerte perfusion for at fjerne eventuelle forureninger fra blodbanen i hjertets microvasculature. Derudover præsenterer vi et valgfrit trin af intravaskulære mærkning af immunceller, der kan bruges til at differentiere yderligere Myokardie celler fra intravaskulær forureninger, baseret på Galkina et al. protokol10. Endelig præsenterer vi en grundlæggende flow flowcytometri analyse for at identificere de store makrofag og cDC delpopulationer.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

Immunsystemet er et væsentligt element i et sundt hjerte. Myokardiet er hjemsted for en rig bestand af forskellige immun celle subsets med funktionel opdeling både under steady state og under forskellige former for inflammation. Indtil for nylig, studiet af immunceller i hjertet krævede anvendelse af mikroskopi eller dårligt udviklede fordøjelsen protokoller, som forudsat nok følsomhed under alvorlig betændelse men var afskåret fra trygt identificere små — men nøgle — populationer af celler under steady state. Her diskuterer vi en simpel metode kombinerer enzymatisk (collagenase, hyaluronidase og DNAse) og mekanisk fordøjelsen af murine hjerter foranstillet intravaskulær administration af fluorescently-mærkede antistoffer til at skelne små men uundgåelige intravaskulær celle forureninger. Denne metode genererer en suspension af isolerede levedygtige celler, der kan analyseres ved flowcytometri til identifikation, fænotyper og kvantificering eller yderligere renset med fluorescens-aktiveret celle sortering eller magnetisk bead adskillelse for transkriptionel analyse eller in vitro- undersøgelser. Vi har et eksempel på en trinvis flow cytometric analyse til at differentiere de centrale makrofager og dendritiske cellepopulationer af hjertet. For en mellemlang mellemstore eksperiment (10 hjerter) kræver afslutningen af proceduren, der 2-3 h.

Til dato, er ingen god metode designet til at isolere immunceller fra andre kardiale celle komponenter, såsom cardiomyocytes. Analyse af den kardiale enkelt cellesuspension ved flowcytometri kræver derfor en pre gating med CD45 at identificere immun cellepopulationer, efterfulgt af enkelt celle og lille størrelse udstødelse gating (fig. 1A). Alternativt, en levedygtighed farvning kan udføres for at udelukke døde celler. Lille størrelse...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolering og identifikation af ekstravaskulære immunceller af hjertet

Denne protokol udgør en enkel og effektiv metode til at isolere, identificere og kvantificere immunceller bosat i myokardiet af mus under steady state eller betændelse. Protokollen kombinerer enzymatiske og mekaniske fordøjelsen for generation af en enkelt cellesuspension, der yderligere kan analyseres ved flowcytometri.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering af Funktionel Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging af Mouse Thymus med 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differentiering funktionelle roller af genekspression fra immun og ikke-immun celler i Mouse Colitis af knoglemarvstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering af primære murine type II alveolære epitelceller for Funktionelle og molekylære studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering af fedtvæv immunceller

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifikation og oprensning af murine thymusepitelmonolag Celler

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering og flowcytometrisk analyse af immunceller fra iskæmisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...