Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek (148808 en 148792), SE werd ondersteund door een hart en beroerte Foundation, personeel award van het Ontario provinciale Office, maart van dubbeltjes, Ted Rogers Centre voor onderzoek van het hart en de Peter Munk Hartcentrum. XCC houdt een CIHR Banting Fellowship. LA houdt een hart & beroerte/Richard Lewar studententijd Award.

Ethische verklaring: dit protocol is herzien en goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier op het University Health Network (Toronto, Canada) en is in overeenstemming met de Canadese Raad op Animal Care.
1. buffer voorbereiding
<ol><li>HBB buffer (Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS), 2% warmte geïnactiveerd runderserum, 0,2% bovien serumalbumine) voor te bereiden. Voeg toe 10 mL van warmte geïnactiveerd runderserum en 1 g bovien serumalbumine aan 500 mL HBSS. Filter sterili...

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

Myocardiale ontsteking of myocarditis, is een functie van meest cardiovasculaire ziekten. Het myocardium is echter niet gespeend van eigen immuunsysteem componenten in niet-ziekte staten. Tijdens steady-state, vele immune cellen bevinden zich in het myocardium en spelen de essentiële rol van onderhoud en bescherming. De karakterisering van deze verschillende populaties van cellen zou niet mogelijk zijn geweest zonder methoden zoals gepresenteerd in dit protocol.
Een combinatie van mechanische...

Verschillende vormen van myocardiale stress of schade, met inbegrip van ischemische (ischemie-reperfusie of myocardinfarct) en niet-ischemische (hypertensie of myocarditis), bevordering van de rekrutering van ontstekingscellen met herstellend en beschermend, maar ook pathogene eigenschappen. Al in 1891, beschreven Romberg eerst de aanwezigheid van cellulaire infiltreert in het myocardium van patiënten geïnfecteerd met tyfus en roodvonk1. De gedetailleerde studie van immuun hartcellen vereist echter de ontwikkeling van meer geavanceerde technieken van de immunophenotyping. Dientengevolge, zijn pas onlangs we begonnen te begrijpen dat een diverse bevolking van immune cellen met essentiële onderhoud rollen tijdens steady-state zich binnen het myocardium bevindt.
Histologie is geweest, en nog steeds is, de meest voorkomende methode te karakteriseren immuun hartcellen tijdens ontsteking. Terwijl histologie een waardevolle diagnostisch hulpmiddel vertegenwoordigt, heeft het gebruik ervan in de studie van immuun hartcellen echter belangrijke beperkingen. De immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium vertegenwoordigen een zeer klein percentage van het totaal aantal cellen en zijn min of meer gelijkmatig verdeeld in een proportioneel immense ruimte. Ook Toon verschillende vormen van cardiale ontsteking, zoals virale myocarditis, focal patronen van ontsteking. Dit betekent dat de nauwkeurige analyse van het immuunsysteem van het hart vaak hogere graden van de histologische bemonstering, verhoging van de kosten te verminderen van bias vereisen. Histologie biedt bovendien een zeer beperkte hoeveelheid bruikbare informatie in cel identificatie (bijvoorbeeld aantal parameters). Met een steeds groeiend aantal cel subsets kunt weergeven die het gebruik van meerdere expressie markers vereisen (met inbegrip van oppervlakte markeringen, transcriptiefactoren of secreted moleculen), heeft stroom cytometry zich gevestigd als de meest krachtige tool voor immunophenotyping, Als gevolg van lage kosten en hoge gegevensdoorvoer.
Het gebruik van immunophenotyping technieken is sterk afhankelijk van de ontwikkeling van efficiënte spijsvertering protocollen dat is toegestaan voor single-cellen analyse van grote aantallen cellen. De ontwikkeling van uitputtende protocollen van de extractie van de cel opende een nieuw venster van mogelijkheden in de studie van cardiale immunologie. Door de combinatie van de spijsvertering en stroom cytometry transcriptomics zijn de grote bevolking van macrofagen en dendritische cellen die woonachtig zijn in het hart gekarakteriseerd2,3. De overvloedigste bevolking van immuun hartcellen tijdens steady-state zijn CD64++ MerTK macrofagen, die kunnen verder worden onderverdeeld op basis van hun uitdrukking voor CCR2 of CD11c2. CCR2+ macrofagen zijn afkomstig uit beenmerg volwassen Haematopoiese, overwegende dat de meerderheid van CCR2- -macrofagen, dat hoge of lage niveaus van MHC-II uitdrukken kunnen, zijn hoofdzakelijk van prenatale oorsprong. Macrofagen belangrijke taken uitvoeren zoals reparatie4 en verwijdering van puin5 tijdens blessure of ondersteunende elektrische connectiviteit6 in stabiele toestand. Tijdens verschillende vormen van ontstekingen een belangrijke toevloed van Ly6Chi MHC-IIlo CD64int monocyten optreden, die later differentiëren in Ly6CHallo CCR2+ macrofagen2,7 . Een aanzienlijk kleiner, maar belangrijke bevolking van cellen die woonachtig zijn in het myocardium van gezonde individuen is samengesteld uit dendritische cellen8,9. De twee belangrijke subsets van cardiale conventionele DCs (cDCs) hebben onlangs gekenmerkt: cDC1 (CD103+ DCs) en cDC2 (CD11b+ DCs). DCs spelen een belangrijke rol in de verdediging tegen infectie8 maar kunnen ook bevorderen zelfverwonding tijdens ontsteking, met name tijdens een myocardinfarct9.
Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het isoleren van levensvatbare immuun hartcellen van muis myocard. De methode combineert enzymatische en mechanische spijsvertering met een cel-zeef filtratie met het oog op een interne celsuspensie dat kan worden geanalyseerd, of verder gezuiverd is, wat door de stroom cytometry sorteren of magnetische kraal verrijking. Nauwkeurige metingen van extravascular myocardcellen vereisen cardiale perfusie om het verwijderen van eventuele verontreinigingen uit de bloedbaan van de cardiale microvasculature. Daarnaast presenteren wij een optionele stap van intravasculaire labeling van immune cellen die kunnen worden gebruikt om te onderscheiden verder myocardcellen van intravasculaire contaminanten, gebaseerd op de Galkina et al. protocol10. Tot slot presenteren we een fundamentele stroom cytometry analyse ter identificatie van de grote macrophage en cDC subpopulaties.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

Het immuunsysteem is een essentieel onderdeel van een gezond hart. Het myocardium is herbergt een rijke bevolking van verschillende immuun cel subsets met functionele brandcompartimentering zowel tijdens steady-state en tijdens verschillende vormen van ontsteking. Tot voor kort, de studie van immuuncellen in het hart vereist het gebruik van microscopie of slecht ontwikkelde spijsvertering-protocollen, die geboden van voldoende gevoeligheid tijdens ernstige ontsteking maar konden vertrouwen identificeren kleine — maar belangrijke — populaties van cellen tijdens steady-state. Hier bespreken we een eenvoudige methode combineren enzymatische (collagenase, hyaluronidase en DNAse) en mechanische vertering van lymfkliertest harten voorafgegaan door intravasculaire administratie van fluorescently-gelabelde antilichamen tegen kleine onderscheiden maar onvermijdelijke intravasculaire cel contaminanten. Deze methode genereert een suspensie van geïsoleerde levensvatbare cellen die kunnen worden geanalyseerd door stroom cytometry voor identificatie, fenotypering en kwantificering, of verder gezuiverd met fluorescentie-geactiveerde cel sorteren of magnetische kraal scheiding voor transcriptionele analyse of in vitro studies. Wij zijn een voorbeeld van een stapsgewijze flow cytometrische analyse om te onderscheiden van de belangrijkste macrophage en dendritische cel populaties van het hart. Voor een middelgrote formaat experiment (10 harten) vereist de voltooiing van de procedure 2 – 3 h.

Tot op heden is geen goede methode ontwikkeld om te isoleren van immune cellen van andere cardiale celbestanddelen, zoals cardiomyocytes. Analyse van de cardiale eencellige schorsing door stroom cytometry heeft dus een vooraf gating met CD45 om te identificeren van de immuun cel populaties, gevolgd door eencellige en klein uitsluiting gating (Figuur 1A). Anderzijds kan een levensvatbaarheid kleuring worden uitgevoerd als u wilt uitsluiten van...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolatie en identificatie van Extravascular immuuncellen van het hart

Dit protocol biedt een eenvoudige en efficiënte methode om te isoleren, te identificeren en te kwantificeren van immune cellen die woonachtig zijn in het myocardium van muizen tijdens steady-state of ontsteking. Het protocol combineert enzymatische en mechanische spijsvertering voor het genereren van een enkel celsuspensie die verder kan worden geanalyseerd door stroom cytometry.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Het meten van calpaïne Activiteit in vaste en levende cellen door flowcytometrie

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolatie van Functionele Cardiac immuuncellen

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Een inleiding tot sluipwespen van<em&gt; Drosophila</em&gt; En de Antiparasite immuunrespons

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravitale Beeldvorming van de Muis Thymus met behulp van 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Onderscheidende functionele rol van genexpressie van immune als niet-immune cellen in de muis Colitis door beenmergtransplantatie

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolatie van Vetweefsel immuuncellen

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolatie en Flow cytometrische analyse van de immuuncellen van de ischemische hersenen van muizen

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...