Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par les instituts de recherche en santé (148808 et 148792), S’a été pris en charge par une sentence du personnel du Bureau Provincial de l’Ontario, March of Dimes, Ted Rogers Centre for Heart Research et le Peter Munk, Fondation des maladies du cœur Centre de cardiologie. XCC est titulaire d’une bourse de recherche IRSC Banting. LA détient un Heart & Stroke/Richard Lewar bourse de stagiaire.

Déclaration d’éthique : ce protocole a été examiné et approuvé par le Comité de protection de l’Animal à l’University Health Network (Toronto, Canada) et est en conformité avec le Conseil canadien de protection des animaux.
1. préparation de la mémoire tampon
<ol><li>Préparer le tampon de l’HEXABROMOBIPHÉNYLE (de Hank Balanced Salt Solution (HBSS), sérum de chaleur 2 % inactivé, 0,2 % d’albumine sérique bovine). Ajouter 10 mL de chaleur inactivé sérum bovin et 1 ...

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

Inflammation du myocarde, ou myocardite, est une caractéristique des maladies cardiovasculaires plus. Toutefois, le myocarde n’est pas dépourvue de ses propres composantes immunitaires dans les États non-maladie. Pendant l’état d’équilibre, beaucoup de cellules immunitaires se trouvent dans le myocarde et jouent le rôle essentiel de l’entretien et la protection. La caractérisation de ces diverses populations de cellules n'aurait pas été possible sans les méthodes telles que celle présentée dans le pr?...

Différentes formes de stress myocardique ou préjudice, y compris ischémique (ischémie reperfusion ou infarctus du myocarde) et non ischémique (hypertension ou myocardite), favoriser le recrutement des cellules inflammatoires réparatrice et protectrice, mais aussi Propriétés pathogènes. Dès 1891, Romberg décrit tout d’abord la présence d’infiltrats cellulaires dans le myocarde des patients infectés par le typhus et la scarlatine1. Cependant, l’étude détaillée des cellules immunitaires cardiaques a nécessité le développement de l’immunophénotypage des techniques plus avancées. En conséquence, que récemment nous avons commencé à comprendre qu’une population diversifiée de cellules immunitaires avec des rôles de maintenance essentielle au cours de l’état d’équilibre réside dans le myocarde.
L’histologie a été et est encore, la méthode la plus courante pour caractériser les cellules immunitaires cardiaques lors d’une inflammation. Cependant, alors que l’histologie représente un précieux outil de diagnostic, son utilisation dans l’étude des cellules immunitaires cardiaques a limitations importantes. Les cellules immunitaires qui résident dans le myocarde représentent une très faible proportion des cellules totales et sont plus ou moins uniformément distribués dans un espace immense proportionnellement. De même, plusieurs formes d’inflammation cardiaque, myocardite virale, comme le montrent des phénomènes focales d’inflammation. Cela signifie qu’une analyse précise du système immunitaire du cœur exige souvent des degrés plus élevés de prélèvement histologique, une hausse des coûts pour réduire le biais. En outre, l’histologie fournit une quantité très limitée d’information utilisable dans l’identification des cellules (par exemple le nombre de paramètres). Avec un nombre toujours croissant de sous-ensembles de cellules qui nécessitent l’utilisation de marqueurs d’expression multiples (y compris les marqueurs de surface, des facteurs de transcription ou des molécules sécrétées), cytométrie de flux s’est imposé comme l’outil le plus puissant pour l’immunophénotypage, en raison de la faible coût et haut débit.
L’utilisation de techniques de l’immunophénotypage dépend étroitement de l’élaboration de protocoles de digestion efficace permettant une analyse simple des cellules d’un grand nombre de cellules. L’élaboration de protocoles exhaustifs d’extraction de cellule a ouvert une nouvelle fenêtre d’opportunités dans l’étude de l’immunologie cardiaque. Grâce à la combinaison de la digestion, cytométrie en flux et transcriptomique, les principales populations des macrophages et des cellules dendritiques qui résident au cœur ont été caractérisées2,3. La population plus abondante de cellules immunitaires cardiaques pendant l’état d’équilibre sont CD64++ de MerTK macrophages, qui peuvent être encore divisés basés sur leur expression de CCR2 ou CD11c2. CCR2+ macrophages proviennent de la moelle osseuse adulte hématopoïèse, tandis que la majorité des CCR2– macrophages, qui peuvent exprimer des niveaux élevés ou faibles de MHC-II, sont principalement d’origine prénatale. Macrophages des fonctions clés telles que la réparation4 et l’élimination des débris5 lors des blessures ou soutenir la connectivité électrique6 en état stationnaire. Au cours de différentes formes d’inflammation un afflux important de Ly6CSalut MHC-IIlo CD64int monocytes se produisent, qui plus tard se différencient en Ly6CSalut CCR2+ macrophages2,7 . Une population beaucoup plus petite, mais importante, de cellules résidant dans le myocarde des individus en bonne santé est composée de cellules dendritiques8,9. Les deux grands sous-ensembles de MDD classiques cardiaque (CDC) ont été récemment caractérisées : cDC1 (CD103+ DCs) et cDC2 (CD11b+ DCs). Contrôleurs de domaine jouent un rôle important dans la défense contre l’infection8 mais peuvent aussi favoriser automutilation lors d’une inflammation, particulièrement au cours de l’infarctus du myocarde,9.
Nous décrivons ici une méthode simple pour l’isolement de cellules immunitaires cardiaques viables du myocarde de souris. La méthode combine la digestion enzymatique et mécanique avec une filtration de cellule-crépine afin d’obtenir une suspension de cellule unique qui peut être analysée, ou encore purifiée, par écoulement cytometry tri ou enrichissement des billes magnétiques. Des mesures précises de cellules myocardiques extravasculaires exigent la perfusion cardiaque afin d’éliminer les contaminants possibles de la circulation sanguine de la microcirculation cardiaque. En outre, nous présentons une étape facultative de l’étiquetage intravasculaire des cellules immunitaires qui peuvent être utilisés pour différencier plus loin cellules myocardiques de contaminants intravasculaires, basés sur la Galkina al protocole10. Enfin, nous présentons une analyse de cytométrie de flux de base pour identifier les sous-populations majeures de macrophage et cDC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

Le système immunitaire est une composante essentielle d’un cœur en bonne santé. Le myocarde est abrite une riche population de sous-ensembles de différentes cellules immunitaires avec compartimentation fonctionnelle durant l’état d’équilibre et différentes formes d’inflammation. Jusqu'à tout récemment, l’étude des cellules immunitaires au cœur exige l’utilisation de la microscopie ou protocoles de digestion peu développé, qui a fourni suffisamment de sensibilité lors d’une inflammation sévère mais n’ont pu en toute confiance identifient petit — mais clés — les populations de cellules pendant l’état d’équilibre. Ici, nous discutons une combinaison simple méthode enzymatique (collagénase, hyaluronidase et DNAse) et digestion mécanique des cœurs murine précédée d’administration intravasculaire d’anticorps fluorescent marqué pour différencier les petits mais inévitable contaminants cellulaires intravasculaire. Cette méthode génère une suspension de cellules viables isolées qui peuvent être analysés par cytométrie de flux pour l’identification et la quantification, phénotypage, ou purifié avec tri de fluorescence-lancée de cellules ou de séparation de billes magnétiques pour transcriptionnels études analyse ou in vitro . Nous incluons un exemple d’une cytométrie étape par étape pour différencier les macrophages clés et les populations de cellules dendritiques du cœur. Pour une expérience de taille moyenne (10 coeurs), l’achèvement de la procédure nécessite 2 à 3 h.

A ce jour, aucune bonne méthode n’a été conçu pour isoler les cellules immunitaires des autres composantes de la cellule cardiaque, tels que les cardiomyocytes. Donc, analyse de la suspension de la cellule cardiaque par cytométrie nécessite un pré déclenchement avec CD45 afin d’identifier les populations de cellules immunitaires, suivies de la cellule unique et depetite taille exclusion gating (Figure 1A). Par ailleurs, une colora...

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Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolement et Identification des cellules immunitaires extravasculaires du coeur

Ce protocole présente une méthode simple et efficace pour isoler, identifier et quantifier les cellules immunitaires qui résident dans le myocarde de souris pendant l’état d’équilibre ou d’inflammation. Le protocole associe la digestion enzymatique et mécanique pour la génération d’une suspension de cellule unique qui peut être davantage analysée par cytométrie en flux.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

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