Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קנדי מוסדות של בריאות המחקר (148808 ו- 148792), SE נתמכה על ידי הלב ושבץ קרן, פרס אנשי משרד מחוזי אונטריו, המשפחה, טד רוג'רס מרכז הלב ומחקר של מונק פיטר מרכז הלב. XCC מחזיקה מלגת בנטינג CIHR. LA מחזיקה של הלב & קו/ריצ'רד Lewar Studentship פרס.

אתיקה במשפט: פרוטוקול זה עבר בדיקה וזכה אושרה על ידי הוועדה אכפת לי חיה אוניברסיטת בריאות ברשת (טורונטו, קנדה), עומדת בדרישות המועצה הקנדית על טיפול בעלי חיים.
1. מאגר הכנה
<ol><li>להכין מאגר HBB (מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק), סרום שור חום 2% לא פעיל, 0.2% שור אלבומין). להוסיף 10 מ של חום ?...

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

דלקת שריר הלב, או דלקת שריר הלב, היא תכונה של מחלות לב וכלי דם ביותר. עם זאת, שריר הלב אינו נטול משלו רכיבי מערכת החיסון במצבים שאינם מחלת. במהלך מצב יציב, תאים חיסוניים רבים שוכנים בשריר, לגלם את התפקידים החיוניים של תחזוקה והגנה. אפיון אלה אוכלוסיות מגוונות של תאים לא היה אפשרי ללא שיטות כמו...

צורות שונות של מתח שריר הלב או פציעה, כולל איסכמי (פגיעה reperfusion איסכמיה או אוטם שריר הלב) ואיסכמי (יתר לחץ דם או דלקת שריר הלב), לקדם הגיוס של תאים דלקתיים עם תיקוני ומגונן, אבל גם מאפייני פתוגניים. מוקדם ככל 1891, רומברג תיאר לראשונה את הנוכחות של תסנין התאית בשריר של חולים שנדבקו עם טיפוס ועוד השנית1. עם זאת, המחקר מפורט של תאים חיסוניים לב נדרש הפיתוח של טכניקות מתקדמות יותר immunophenotyping. כתוצאה מכך, רק לאחרונה התחלנו להבין כי אוכלוסיה מגוונת של תאים חיסוניים עם תחזוקה חיוני תפקידים במהלך מצב יציב שוכן בתוך שריר הלב.
היסטולוגיה היה, והוא עדיין, השיטה הנפוצה ביותר כדי לאפיין את תאי מערכת החיסון לב בעת דלקת. עם זאת, בעוד היסטולוגיה מייצג כלי אבחוני חשוב, השימוש במחקר של תאי מערכת החיסון לב יש מגבלות חשוב. תאים חיסוניים המתגוררים שריר הלב מייצג חלק קטן מאוד של התאים הכולל ומופצים פחות או יותר באופן שווה בחלל העצום באופן פרופורציונלי. באופן דומה, כמה צורות של דלקת לב, כגון נגיפי דלקת שריר הלב, להציג דפוסים מוקד של דלקת. משמעות הדבר היא כי ניתוח מדויק של המערכת החיסונית של הלב דורשים לעיתים קרובות גבוהה יותר מעלות של דגימה היסטולוגית, הגדלת העלות לצמצם הטיה. יתר על כן, היסטולוגיה מספק כמות מוגבלת מאוד של מידע שימושי בזיהוי תא (למשל מספר פרמטרים). עם מספר גדל והולך של תת-ערכות תא מחייבות השימוש של מספר סמני ביטוי (כולל סמני פני השטח, גורמי שעתוק או על ידי מולקולות), cytometry זרימה ביססה את עצמה בתור הכלי החזק ביותר עבור immunophenotyping, בשל בעלות נמוכה, תפוקה גבוהה.
השימוש בטכניקות immunophenotyping תלויה בשיתוף פעולה הדוק לפיתוח פרוטוקולים לעיכול יעיל המותר עבור ניתוח חד-תאים של מספר גדול של תאים. הפיתוח של הפרוטוקולים ממצה של מיצוי תא נפתח חלון חדש של הזדמנויות במחקר של הלב אימונולוגיה. באמצעות השילוב של מערכת העיכול, cytometry זרימה transcriptomics, האוכלוסיות הגדולות של מקרופאגים, תאים דנדריטים ששוכן בלב היה מאופיין2,3. האוכלוסייה הנפוץ ביותר של תאים חיסוניים הלב במהלך מצב יציב הן CD64+MerTK+ מקרופאגים, אשר ניתן לחלק נוספת המבוססת על הבעת רגשותיהם CCR2 או CD11c2. CCR2+ מקרופאגים שמקורם במח העצם למבוגרים hematopoiesis, בעוד הרוב המכריע של CCR2– מקרופאגים, אשר יכולים לבטא רמות גבוה או נמוך של MHC-II, הם בעיקר ממוצא טרום לידתי. מקרופאגים לבצע פונקציות מפתח כגון תיקון4 ופינוי פסולת5 במהלך פציעה או תמיכה קישוריות חשמלי6 במצב יציב. במהלך צורות שונות של דלקת זרם חשוב של Ly6Cשלום MHC-IIהלאו CD64int ומונוציטים להתרחש, אשר מאוחר יותר להבדיל לתוך Ly6Cשלום CCR2+ מקרופאגים2,7 . אוכלוסיה קטנה יותר באופן משמעותי, אבל חשוב, של תאים המתגוררים שריר הלב של אנשים בריאים מורכב של תאים דנדריטים8,9. שני תת-קבוצות העיקריים של הלב בקרי קבוצת מחשבים קונבנציונלי (cDCs) אפיינו היה לאחרונה: cDC1 (CD103+ DCs), cDC2 (CD11b+ בקרי קבוצת מחשבים). DCs לשחק תפקידים חשובים בהגנה נגד זיהום8 , אך יכול גם לקדם פגיעה עצמית בעת דלקת, במיוחד במהלך אוטם שריר הלב9.
כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עבור בידוד של קיימא תאים חיסוניים הלב מן העכבר שריר הלב. השיטה משלבת עיכול אנזימטי ועל מכניים עם סינון תא-מסננת כדי לקבל השעיה תא בודד שניתן לנתח, או עוד יותר טהור, על ידי מיון cytometry זרימה או חרוז מגנטי העשרה. מדידות מדויקות של תאי שריר הלב extravascular דורשות זלוף הלב כדי להסרת לכלוך אפשרי מזרם הדם של microvasculature הלב. בנוסף, אנו מציגים שלב אופציונלי של קרישה תוך-כלית תיוג של תאים חיסוניים יכול לשמש כדי נוספות להבדיל תאי שריר הלב מזהמים קרישה תוך-כלית, המבוסס על פרוטוקול et al. Galkina10. לבסוף, אנו מציגים ניתוח cytometry זרימה בסיסיים כדי לזהות את subpopulations הגדולות מקרופאג ו- cDC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

המערכת החיסונית היא מרכיב חיוני של לב בריא. שריר הלב הוא ביתם של אוכלוסיה עשירה של תאים חיסוניים שונים תת-ערכות עם תפקודי מידור במהלך מצב יציב ובמהלך צורות שונות של דלקת. עד לאחרונה, המחקר של תאים חיסוניים בלב הצריכו השימוש במיקרוסקופ או פרוטוקולים עיכול לקוי מפותחת, אשר סיפקה מספיק רגישות בזמן דלקת חמורה אבל לא היו מסוגלים בביטחון לזהות קטן — אבל מפתח – אוכלוסיות של תאים במהלך מצב יציב. כאן נדון שילוב של שיטה פשוטה אנזימטי (collagenase, hyaluronidase ו- DNAse) ועיכול מכני מאתר לבבות ולפניהם קרישה תוך-כלית מינהל מתויג fluorescently נוגדנים להבדיל קטן אבל בלתי נמנע קרישה תוך-כלית תא מזהמים. שיטה זו יוצרת השעיה של מבודד התאים קיימא שניתן נותחו על ידי cytometry זרימה עבור phenotyping וכימות, או מטוהרים נוסף עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון או הפרדה מגנטית חרוז לימודי ניתוח או במבחנה תעתיק. אנו כוללים דוגמה של ניתוח cytometric זרימה צעד אחר צעד כדי להבדיל בין מקרופאג מפתח אוכלוסיות תאים דנדריטים של הלב. עבור ניסוי בגודל בינוני (10 לבבות) השלמת ההליך מחייב h 2-3.

נכון להיום, אין שיטה טובה תוכנן כדי לבודד תאים חיסוניים אחרים מרכיבי התא הלב, כגון cardiomyocytes. לפיכך, ניתוח של התליה תא בודד הלב מאת cytometry זרימה דורש מראש-gating עם CD45 כדי לזהות את אוכלוסיות תאים חיסוניים, ואחריו תא בודד, גודל קטן אי-הכללה של חסימה (איור 1א'</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

בידוד וזיהוי של תאים חיסוניים Extravascular של הלב

פרוטוקול זה מציג שיטה פשוטה ויעילה כדי לבודד, לזהות ולכמת תאים חיסוניים המתגוררים במהלך מצב יציב או דלקת שריר הלב של עכברים. הפרוטוקול משלב עיכול אנזימטי ועל מכניים לדור של השעיה תא בודד מסוגל לנתח עוד יותר על ידי cytometry זרימה.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

מדידת פעילות Calpain בתוך תאים חיים קבוע על ידי זרימת cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

שבעה צעדים Stellate תאים

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

בידוד של תאים חיסוניים פונקציונלית לב

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

הדמיה Intravital של קורנית עכבר באמצעות 2-פוטון מיקרוסקופית

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

הבחנת תפקידים פונקציונליים של ביטוי גנים מתאים חיסוניים וללא חיסון בקוליטיס המאוס על ידי השתלת מח עצם

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

בידוד Cytometric זרימה של תאים ראשוניים Murine Type II alveolar אפיתל ללימודים פונקציונליים ומולקולריים

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

בידוד של תאים חיסוני רקמת שומן

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

בידוד, זיהוי, וטיהור של תאי Murine הרתי אפיתל

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...