Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato dall'istituti canadesi di ricerca sanitaria (148808 e 148792), SE è stata sostenuta da un Heart and Stroke Foundation, premio personale dall'ufficio provinciale di Ontario, March of Dimes, Ted Rogers Centre per ricerca di cuore e Peter Munk Centro cardiaco. XCC detiene un Fellowship di Banting CIHR. LA tiene un cuore & Stroke/Richard Patricia Studentship Award.

Dichiarazione etica: questo protocollo è stato esaminato e approvato dal comitato di cura degli animali alla rete di salute dell'Università (Toronto, Canada) ed è in conformità con il Consiglio canadese su Animal Care.
1. preparazione buffer
<ol><li>Preparare il tampone di HBB (di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS), siero bovino 2% calore inattivato, 0,2% di sieroalbumina bovina). Aggiungere 10 mL di calore inattivato siero bovino e 1 g di albumina di siero bovino a 500 mL di HBSS. Fi...

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

Infiammazione del miocardio, o miocardite, è una caratteristica delle malattie cardiovascolari più. Tuttavia, il miocardio non è privo di propri componenti immuni negli Stati di non-malattia. Durante stato stazionario, molte cellule immunitarie risiedono nel miocardio e svolgono un ruolo essenziale di manutenzione e protezione. La caratterizzazione di queste diverse popolazioni di cellule non sarebbe stato possibile senza i metodi come quello presentato in questo protocollo.
Una combinazion...

Diverse forme di stress del miocardio o danno, inclusi ischemico (ischemia riperfusione o infarto del miocardio) e non-ischemica (ipertensione o miocardite), promuovere il reclutamento di cellule infiammatorie con riparatore e protettivo, ma anche Proprietà patogene. Già nel 1891, Romberg descritto in primo luogo la presenza di infiltrati cellulari nel miocardio dei pazienti infettati con il tifo e la scarlattina1. Tuttavia, lo studio dettagliato delle cellule immuni cardiache richiesto lo sviluppo di tecniche più avanzate di immunofenotipizzazione. Di conseguenza, solo recentemente abbiamo iniziato a capire che una popolazione eterogenea di cellule del sistema immunitario con ruoli di manutenzione essenziali durante stato stazionario risiede all'interno del miocardio.
L'istologia è stato ed è tuttora, il metodo più comune per caratterizzare le cellule immuni cardiache durante l'infiammazione. Tuttavia, mentre l'istologia rappresenta un prezioso strumento diagnostico, suo utilizzo nello studio delle cellule immuni cardiache ha limitazioni importanti. Le cellule immunitarie che risiedono nel miocardio rappresentano una percentuale molto piccola delle cellule totali e sono più o meno uniformemente distribuite in uno spazio immenso proporzionalmente. Allo stesso modo, diverse forme di infiammazione cardiaca, quali miocardite virale, mostrano modelli focali di infiammazione. Questo significa che l'analisi accurata del sistema immunitario del cuore richiedono spesso più alti gradi di campionamento istologico, l'aumento del costo per ridurre i pregiudizi. Inoltre, l'istologia fornisce una quantità molto limitata di informazioni utilizzabili nell'identificazione delle cellule (ad es. numero di parametri). Con un numero sempre crescente di sottoinsiemi di cellule che richiedono l'utilizzo di più indicatori di espressione (compresi gli indicatori di superficie, fattori di trascrizione o molecole secrete), citometria a flusso si è affermata come il più potente strumento per immunophenotyping, a causa di alto-rendimento e basso costo.
L'uso di tecniche di immunophenotyping dipende strettamente lo sviluppo di protocolli di digestione efficiente che ha permesso per l'analisi di singole cellule di un gran numero di cellule. Lo sviluppo di protocolli esaustivi di estrazione delle cellule ha aperto una nuova finestra di opportunità nello studio della immunologia cardiaco. Attraverso la combinazione di digestione, citometria a flusso e trascrittomica, le principali popolazioni di macrofagi e cellule dendritiche che risiedono nel cuore sono stati caratterizzati2,3. La popolazione più abbondante di cellule immuni cardiache durante allo stato stazionario sono CD64++ MerTK macrofagi, che possono essere ulteriormente suddivisi sulla base di loro espressione di CCR2 o CD11c2. CCR2+ macrofagi hanno origine dal midollo osseo adulto ematopoiesi, considerando che la maggior parte di CCR2 macrofagi– , che possono esprimere livelli elevati o bassi di MHC-II, sono principalmente di origine prenatale. I macrofagi hanno funzioni chiave come riparazione4 e la rimozione di detriti5 durante la ferita o sostenere connettività elettrica6 in regime stazionario. Durante diverse forme di infiammazione si verificano un importante afflusso di Ly6CCiao MHC-IIlo CD64int monociti, che più successivamente differenziarsi in Ly6CCiao CCR2+ macrofagi2,7 . Una popolazione significativamente più piccola, ma importante, di cellule che risiedono nel miocardio di individui in buona salute è composto di cellule dendritiche8,9. I due sottoinsiemi principali di cardiaca convenzionale DCs (cDCs) sono stati recentemente caratterizzati: cDC1 (CD103+ DCs) e cDC2 (CD11b+ DCs). DCs svolgono un ruolo importante nella difesa contro l'infezione8 , ma può anche promuovere la auto-ferita durante l'infiammazione, in particolare durante l'infarto miocardico9.
Qui, descriviamo un metodo semplice per l'isolamento di cellule immuni cardiache vitali dal miocardio del mouse. Il metodo combina digestione enzimatica e meccanica con una filtrazione di cella-setaccio per ottenere una sospensione di singola cellula che può essere analizzata, o ulteriormente purificata, tramite flusso cytometry ordinamento o arricchimento di biglie magnetiche. Misurazioni accurate delle cellule del miocardio extravascular richiedono aspersione cardiaca al fine di rimuovere eventuali contaminanti dal flusso sanguigno del microvasculature cardiaco. Inoltre, vi presentiamo un passaggio facoltativo di etichettatura intravascolare delle cellule immuni che possono essere utilizzate per differenziare ulteriormente le cellule del miocardio da contaminanti intravascolare, basati sul Galkina et al protocollo10. Infine, presentiamo un'analisi di citometria a flusso di base per identificare le principali sottopopolazioni macrofago e cDC.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

Il sistema immunitario è una componente essenziale di un cuore sano. Il miocardio è sede di una popolazione ricca dei sottoinsiemi delle cellule immuni differenti con compartimentazione funzionale sia durante stato stazionario diverse forme di infiammazione. Fino a poco tempo, lo studio delle cellule immunitarie nel cuore ha richiesto l'uso di microscopia o protocolli di digestione poco sviluppati, che fornito di sensibilità sufficiente durante l'infiammazione severa, ma erano tranquillamente in grado di identificano piccoli — ma chiave — popolazioni di cellule durante lo stato stazionario. Discutiamo qui, un metodo semplice combinazione enzimatica (collagenasi, ialuronidasi e DNasi) e digestione meccanica del cuore murino preceduta da somministrazione intravascolare di anticorpi fluorescente etichettati per differenziare piccolo ma inevitabile contaminanti intravascolare delle cellule. Questo metodo genera una sospensione di cellule vitali isolate che può essere analizzato tramite flusso cytometry per fenotipizzazione di identificazione e quantificazione, o ulteriormente purificate con fluorescenza-attivato delle cellule l'ordinamento o la separazione di biglie magnetiche per studi di analisi o in vitro trascrizionali. Includiamo un esempio di una dettagliata analisi citofluorimetrica per differenziare la chiave del macrofago e popolazioni di cellule dendritiche del cuore. Per un esperimento di dimensione medio (10 cuori) il completamento della procedura richiede 2 – 3 h.

Fin qui, nessun buon metodo è stato progettato per isolare le cellule immuni da altri componenti di cellula cardiaca, come cardiomiociti. Quindi, analisi della sospensione singola cellula cardiaca tramite flusso cytometry richiedono un pre-gating con CD45 per identificare le popolazioni delle cellule immuni, seguite dalla singola cella e piccola dimensione esclusione gating (Figura 1A). In alternativa, una vitalità colorazione possono esser...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolamento e identificazione di cellule immunitarie extravascolare del cuore

Questo protocollo presenta un metodo semplice ed efficace per isolare, identificare e quantificare le cellule immuni che risiedono nel miocardio dei topi durante stato stazionario o l'infiammazione. Il protocollo combina digestione enzimatica e meccanica per la generazione di una sospensione di singola cellula che può essere ulteriormente analizzata tramite flusso cytometry.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Misurazione dell&#39;attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Seven Steps to Stellate Cells

Sette passi per Stellate Cellule

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolamento di cellule cardiache funzionali immunitario

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to vespe parassite di<em&gt; Drosophila</em&gt; E la risposta immunitaria antiparassitari

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Imaging intravitale del Timo mouse utilizzando 2-Photon Microscopy

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Differenziare i ruoli funzionali di espressione genica di cellule immunitarie e non immunitarie in Colite mouse da trapianto di midollo osseo

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flusso Isolamento citometrica di primari murini di tipo II cellule alveolari epiteliali per gli studi funzionali e molecolari

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolamento, identificazione e purificazione di cellule murine timica epiteliali

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolamento e analisi citofluorimetrica delle cellule immunitarie dal cervello ischemica mouse

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...