Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

이 작품은 캐나다 연구소의 건강 연구 (148808 148792)에 의해 지원 되었다, SE는 심 혼 및 치기 기초, 온타리오 주정부 사무실, 십 센트의 3 월, 피터 Munk 심장 연구에 대 한 테드 로저스 센터에서 직원 수상에 의해 지원 되었다 심장 센터입니다. XCC는 CIHR 밴팅 화목을 보유 하고있다. 라 심 혼 & 치기/리처드 Lewar 재학 수상 보유 하고있다.

윤리 성명:이 프로토콜을 검토 하 고 대학 건강 네트워크 (토론토, 캐나다)에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 동물 관리에 캐나다 위원회 준수 하 고.
1. 버퍼 준비
<ol><li>HBB 버퍼 (행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS), 2% 열 비활성화 소 혈 청, 0.2% 소 혈 청 알 부 민)을 준비 합니다. 열 10 mL 비활성화 둔감 한 혈 청 및 HBSS의 500 ml 소 혈 청 알 부 민 1 g 추가 합니다. 필터는 0.2 µ m 필터?...

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

심근 염증, 또는 심근 염, 가장 심혈 관 질환의 기능입니다. 그러나, 심근 질병이 아닌 상태에서 자체 면역 구성 요소 없는 아니다. 정상 상태 동안 많은 면역 세포에는 심근 있으며 유지 보수 및 보호의 필수적인 역할. 셀의 이러한 다양 한 인구 특성 것 없었을이 프로토콜에서 제시 하는 것과 같은 방법 없이 불가능 하다.
심근의 기계 및 효소 소화의 조합 분석, 흐름 cytometry 또...

심근 긴장 또는 부상, 허 혈 성 등 (국 소 빈 혈 reperfusion 또는 심근 경색)의 다른 형태와 비-허 혈 성 고혈압 (심근 염), 아니라 회복 및 보호, 염증 세포의 모집 홍보 병원 성 속성입니다. 1891, 빠르면 Romberg 처음 발진 티 푸 스, 성 홍 열1감염 환자의 심근에 세포 침투의 존재를 설명. 그러나, 심장 면역 세포의 상세한 연구 고급 immunophenotyping 기술 개발이 필요합니다. 그 결과, 최근에 우리가 안정 상태 동안 필수적인 유지 관리 역할을 가진 면역 세포의 다양 한 인구는 심근 내에 있는 이해 하기 시작 했습니다.
조직학, 되었으며 여전히 염증 동안 심장 면역 세포의 특성을 가장 일반적인 방법입니다. 그러나, 조직학 나타내는 유용한 진단 도구, 심장 면역 세포의 연구에 사용 중요 한 제한이 있다. 심근에 있는 면역 세포 총 세포의 아주 작은 비율을 대표 하 고 비례적으로 엄청난 공간에 더 많거나 적은 고르게 배포 됩니다. 마찬가지로, 여러 형태의 심장 염증, 바이러스 성 심근 염 등 염증의 초점 패턴을 표시합니다. 이 의미는 심장의 면역 시스템의 정확한 분석 종종 조직학 샘플링, 바이어스를 줄이기 위해 비용을 증가 시키기의 더 높은 학위를 필요로 합니다. 또한, 조직학 매우 제한 된 양의 셀 식별 (예: 매개 변수 개수)에 유용한 정보를 제공합니다. 여러 식 마커 (를 포함 하 여 표면 마커, 녹음 방송 요인 또는 분 비 분자)의 사용을 필요로 하는 셀의 하위 집합의 증가 수, cytometry immunophenotyping를 위한 가장 강력한 도구 자체를 설립 했다 저가 및 높은 처리량
Immunophenotyping 기술의 사용은 세포의 많은 수의 단일 세포 분석에 대 한 허용 하는 효율적인 소화 프로토콜의 개발에 밀접 하 게 의존. 세포 추출의 철저 한 프로토콜의 개발 심장 면역학의 연구 기회의 새로운 창을 열었습니다. 소화, cytometry 및 transcriptomics의 조합을 통해 대 식 세포와 수지상 세포에에서의 주요 인구 특징된2,3되었습니다. 정상 상태 동안 심장 면역 세포의 가장 풍부한 인구는 CD64+MerTK+ 세포, 더 분할 될 수 있다는 CCR2 또는 CD11c2의 그들의 표정에 따라. CCR2+ 세포 성인 골 수 조에서 발생 한 반면 대부분 CCR2의 MHC-II에 대 한 높은 또는 낮은 수준의 표현할 수,- 대 식 세포는 태아 근원의 주로 이다. 대 식 세포 수리4 부상 또는 안정 상태에서 전기 연결6 을 지 원하는 동안 파편5 의 제거 등의 주요 기능을 수행 합니다. 다른 형태의 염증 동안 Ly6C안녕하세요 MHC-IIlo CD64int monocytes의 중요 한 유입 발생는 나중에 Ly6C안녕하세요 CCR2 차별화+ 세포2,7 . 현저 하 게 더 작고, 그러나 중요 한, 인구에서 건강 한 개인의 심근 세포의 수지상 세포8,9로 구성 된다. 심장 기존의 DCs (cDCs)의 두 가지 주요 하위 집합을 최근 특징 되었습니다: cDC1 (CD103+ Dc)와 cDC2 (CD11b+ Dc). DCs 감염8 에 대 한 방어에 중요 한 역할을 재생 하지만 또한 심근 경색9중 특히 염증, 동안 자기 부상을 홍보할 수 있습니다.
여기, 우리가 마우스 심근에서 가능한 심장 면역 세포의 분리에 대 한 간단한 방법을 설명합니다. 메서드를 사용 하면 단일 셀 서 스 분석, 또는 추가 정화, 교류 cytometry 정렬 또는 자석 구슬 농축 수를 얻기 위하여 셀 스 트레이너 여과와 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다. Extravascular 심근 세포의 정확한 측정 심장 microvasculature의 혈 류에서 가능한 오염 물질을 제거 하기 위해 심장 관류를 필요 합니다. 또한, 우리는 더 심근 세포 Galkina 외. 프로토콜10에 따라 혈관 내 오염 물질에서 차별화 하는 데 사용할 수 있는 면역 세포의 혈관 내 라벨의 단계는 선택 사항 제시. 마지막으로, 우리는 주요 대 식 세포 및 cDC 모집단을 식별 하는 기본적인 흐름 cytometry 분석을 제시.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

면역 체계가 건강 한 심장의 필수적인 구성 요소입니다. 심근은 정상 상태와 다른 형태의 염증 동안 기능 구획과 다른 면역 세포 하위 집합의 풍부한 인구에 게 가정. 최근까지 연구에서에서 면역 세포의 현미경의 사용을 요구 하거나 심한 염증 동안 충분 한 감도 제공 하지만 하지 못했습니다 자신 있게 제대로 개발된 소화 프로토콜 식별 작은-하지만 키-인구 정상 상태 동안 셀입니다. 여기, 우리는 간단한 방법 결합 효소 (콜라, hyaluronidase DNAse)와 기계적 소화 murine 마음 앞에 작은 차별화에 놓여있는지 분류 항 체의 혈관 내 관리의 논의 하지만 피할 수 없는 혈관 내 세포 오염 물질입니다. 이 방법은 생성 식별 형질, 정량화, cytometry에 의해 분석 하거나 더 형광 활성화 된 세포 분류와 마그네틱 비드 분리 정화 수 있는 분리 가능한 세포의 현 탁 액 transcriptional 분석 또는 생체 외에서 연구. 우리는 주요 대 식 세포와 수지상 세포 인구 중심의 차별화 하는 단계별 흐름 cytometric 분석의 예를 포함 합니다. 중간 크기의 실험 (10 마음)에 대 한 절차의 완료는 2-3 h를 요구 한다.

날짜 하려면, 좋은 방법 cardiomyocytes 같은 다른 심장 세포 구성 요소에서 면역 세포를 분리 설계 되었습니다. 따라서, cytometry에 의해 심장 단일 세포 현 탁 액의 분석 단일 세포 및 작은 크기 제외 제어그림 1(A) 면역 세포 인구를 식별 하는 CD45와 미리 게이팅 필요 합니다. 또는, 생존 얼룩이 죽은 세포를 제외 하려면 수행할 수 있습니다. 소?...

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Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

절연 및 심장의 Extravascular 면역 세포의 식별

이 프로토콜 격리, 식별 하 고 안정 된 상태 또는 염증 동안 쥐의 심근에 있는 면역 세포를 계량 하는 간단 하 고 효율적인 방법을 제공 합니다. 프로토콜은 cytometry에 의해 더 분석 될 수 있는 단일 세포 현 탁 액의 세대에 대 한 효소 및 기계적 소화를 결합 합니다.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

유동세포계측법로 고정하고 살아있는 세포에서 Calpain 활동을 측정

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

연구

면역학 및 감염병학

Seven Steps to Stellate Cells

셀을 별 모양으로 일곱 단계

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

심장 기능 면역 세포의 분리

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

의 기생충 말벌에 대한 소개<em&gt; Drosophila</em&gt; 그리고 Antiparasite 면역 반응

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

골수 이식으로 마우스 대장염에서 면역 및 비 면역 세포에서 유전자 발현의 기능 역할을 차별화

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

기능 및 분자 연구 기본 손쥐 유형 II 폐포 상피 세포의 흐름 Cytometric 절연

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

지방 조직 면역 세포의 분리

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

격리, 식별 및 쥐과 흉선 상피 세포의 정화

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

허혈성 마우스 뇌에서 면역 세포의 분리 및 유세포 분석

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...