Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av den kanadiske institutter for helseforskning (148808 og 148792), SE ble støttet av en Heart og Stroke Foundation, personell award fra Ontario Provincial Office, mars Dimes, Ted Rogers senter for hjertet forskning og Peter Munk Hjerte sentrum. XCC har en CIHR Banting Fellowship. LA har et hjerte og slag/Richard Lewar Studentship Award.

Etikk uttalelse: denne protokollen er vurdert og godkjent av dyr omsorg komiteen på universitetet helse Network (Toronto, Canada) og er i overensstemmelse med kanadiske Rådet for Animal Care.
1. buffer forberedelse
<ol><li>Forberede HBB buffer (Hanks balansert Salt løsning (HBSS), 2% varme inaktivert bovin serum, 0,2% bovin serum albumin). Legge 10 mL av varme inaktivert bovin serum og 1 g bovin serum albumin til 500 mL av HBSS. Filteret sterilisere gjennom en 0,2 µm og lagre på 4 ° C....

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

Hjerteinfarkt betennelse eller Myokarditt, er en funksjon av mest hjerte-og karsykdommer. Myocardium er imidlertid ikke uten sin egen immun komponenter i ikke-sykdom stater. I steady state, mange immunceller ligge i myokard og spille viktige roller av vedlikehold og beskyttelse. Karakterisering av disse forskjellige befolkningsgrupper celleområde ville ikke vært mulig uten metoder som den som presenteres i denne protokollen.
En kombinasjon av mekanisk og enzymatiske fordøyelsen av myokard t...

Ulike former for hjerteinfarkt stress eller skader, inkludert iskemiske (ischemia reperfusion eller hjerteinfarkt) og ikke-iskemiske (hypertensjon eller Myokarditt), fremme rekruttering av inflammatoriske celler med reparative og beskyttende, men også patogene egenskaper. Så tidlig som i 1891, beskrevet Romberg først tilstedeværelsen av mobilnettet infiltrerer i myokard pasienter infisert av tyfus og skarlagensfeber1. Den detaljerte studien av cardiac immunceller kreves imidlertid utviklingen av mer avanserte immunophenotyping teknikker. Som en konsekvens, har nylig vi begynt å forstå at et mangfoldig befolkning av immunceller med grunnleggende vedlikehold roller i løpet stabil state ligger innenfor myokard.
Histology har vært og fortsatt er, den vanligste metoden å karakterisere kardial immunceller ved betennelser. Men mens histology representerer en verdifull diagnoseverktøyet, har dens bruk i studiet av cardiac immunceller viktige begrensninger. Immunceller i myokard representerer en svært liten andel av de totale cellene og er mer eller mindre jevnt fordelt i løpet proporsjonalt enorme. Tilsvarende vise flere former for hjerte inflammasjon, som viral Myokarditt, fokal mønstre av betennelse. Dette betyr at nøyaktig analyse av immunsystemet til hjertet ofte krever høyere grader av histologiske sampling, øke kostnadene for å redusere bias. Videre gir histology et svært begrenset antall brukbare informasjon i cellen identifikasjon (f.eks antall parametere). Med en stadig økende antall celle undergrupper som krever bruk av flere uttrykk markører (inkludert overflate markører, transkripsjonsfaktorer eller utskilles molekyler), har flowcytometri etablert seg som det mest effektive verktøyet for immunophenotyping, på grunn av lav pris og høy gjennomstrømming.
Bruk av immunophenotyping teknikker er tett avhengige av utviklingen av effektiv fordøyelse protokoller som tillates for single-celler analyse av stort antall celler. Utviklingen av uttømmende protokoller celle utvinning åpnet et nytt vindu av muligheter i studiet av cardiac immunologi. Gjennom en kombinasjon av fordøyelsen, flowcytometri og transcriptomics, har store bestander av makrofager og dendrittiske celler i hjertet vært preget2,3. Den rikeste befolkningen i cardiac immunceller i løpet stabil state er CD64+MerTK+ makrofager, som kan deles basert på deres gjengivelsen av CCR2 eller CD11c2. CCR2+ makrofager kommer fra voksen benmarg hematopoiesis, mens fleste av CCR2- makrofager, som kan uttrykke høyt eller lavt nivå av MHC-II, er hovedsakelig av prenatal opprinnelse. Makrofager utføre viktige funksjoner som reparasjon4 og fjerning av rusk5 under skade eller støtte elektrisk tilkobling6 i steady state. Under ulike former for betennelse en viktig strøm av Ly6CHei MHC-IIlo CD64int monocytter oppstår, som senere skille ut Ly6CHei CCR2+ makrofager2,7 . Betydelig mindre, men viktig innbyggere bor i myokard av friske individer består av dendrittiske celler8,9. De to store delsettene av cardiac konvensjonelle DCs (cDCs) har vært nylig preget: cDC1 (CD103+ DCs) og cDC2 (CD11b+ DCs). DCs spille en viktig rolle i forsvaret mot infeksjon8 , men kan også fremme Selvskading ved betennelser, spesielt under hjerteinfarkt9.
Her beskriver vi en enkel metode for isolering av levedyktig cardiac immunceller fra musen myokard. Metoden kombinerer enzymatisk og mekanisk fordøyelsen med en celle-sil filtrering for å få en enkeltcelle suspensjon som kan analyseres, eller videre renset, ved flyt cytometri sortering eller magnetiske perle berikelse. Nøyaktige målinger av ekstravaskulær overvåking av hjerteinfarkt celler krever cardiac perfusjon for å fjerne mulige forurensninger fra blodet av cardiac microvasculature. I tillegg presenterer vi et valgfritt trinn av intravascular merking av immunceller som kan brukes til å fremme skille ut hjerteinfarkt celler fra intravascular forurensning, basert på Galkina et al. protokollen10. Til slutt presenterer vi en grunnleggende flyt cytometri analyse for å identifisere de store macrophage og cDC subpopulasjoner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

Immunsystemet er en vesentlig komponent i et sunt hjerte. Myocardium er hjem til en rik befolkning på ulike immun celle delsett med funksjonell compartmentalization både under steady state og under ulike former for betennelse. Inntil nylig studiet av immunceller i hjertet krevde bruk av mikroskopi eller dårlig utviklede fordøyelsen protokoller, som gitt nok følsomhet under alvorlig betennelse, men klarte ikke å trygt identifisere små, men viktige-av celler i løpet stabil state. Her diskuterer vi en enkel metode kombinere enzymatisk (collagenase, hyaluronidase og DNAse) og mekanisk fordøyelsen murine hjerter foran intravascular administrasjonen av fluorescently merket antistoffer å skille små men uunngåelig intravascular celle forurensninger. Denne metoden genererer en suspensjon av isolerte levedyktig celler som kan analyseres av flowcytometri for identifikasjon, phenotyping og kvantifisering eller ytterligere renset med fluorescens-aktivert celle sortering eller magnetiske perle separasjon for transcriptional analyse eller i vitro studier. Vi inkluderer et eksempel på en trinnvis flyt cytometric analyse å skille de viktige macrophage og dendrittiske celle populasjoner av hjertet. En middels størrelse eksperiment (10 hearts) krever fullført prosedyren 2-3 h.

Hittil er ingen god metode utviklet isolere immunceller fra andre cardiac celle komponenter, for eksempel cardiomyocytes. Dermed krever analyse av cardiac enkeltcelle suspensjon av flowcytometri en pre gating med CD45 identifiserer immun celle, etterfulgt av én celle og liten størrelse utelukkelse gating (figur 1A). Alternativt kan en levedyktighet flekker utføres for å utelate døde celler. Liten størrelse eksklusjon og levedyktighet fa...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolasjon og identifisering av ekstravaskulær overvåking av immunceller av hjertet

Denne protokollen gir en enkel og effektiv metode for å isolere, identifisere og kvantifisere immunceller bosatt i myokard mus i steady state eller betennelse. Protokollen kombinerer enzymatisk og mekanisk fordøyelsen for generering av en enkelt celle suspensjon som kan analyseres videre av flowcytometri.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funksjonelle Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skille funksjonelle roller av genuttrykk fra immune og ikke-immune celler i mus Kolitt av benmargstransplantasjon

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flowcytometrisk Isolering av Primary Murine Type II alveolære epitelceller for Funksjonell og molekylær studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av fettvev immunceller

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolasjon, Identifikasjon, og rensing av Muse thymisk Epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolasjon og flowcytometrisk analyse av immunceller fra iskemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...