Name: isolation and identification of extravascular immune cells of the heart
Uploaded: 2018-08-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Detta arbete fick stöd av kanadensiska institut för hälsa forskning (148808 och 148792), SE stöddes av en hjärta och Stroke Foundation, personal award från Ontario Provincial Office, March of Dimes, Ted Rogers Centre för hjärtat forskning och den Peter Munk Hjärt centrum. XCC innehar en CIHR Banting Fellowship. LA äger ett hjärta & Stroke/Richard Lewar STUDENTTILLVARO Award.

Etik uttalande: detta protokoll har granskats och godkänts av Animal Care kommitté vid the University Health Network (Toronto, Kanada) och uppfyller kraven i kanadensiska rådet om djur vård.
1. buffert förberedelse
<ol><li>Förbereda HBB buffert (Hank's Balanced Salt lösning (HBSS), 2% värme inaktiverat bovint serum, 0,2% bovint serumalbumin). Tillsätt 10 mL av värme inaktiverat bovint serum och 1 g av bovint serum albumin till 500 mL HBSS. Filter sterilisera genom ett 0,2 µm filte...

<ol>
	<li>Marboe, C. C., Fenoglio, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+natural+history+of+human+myocarditis.">Pathology and natural history of human myocarditis.</a> Pathology and Immunopathology Research. 7 (4), 226-239 (1988).</li><li>Epelman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+and+adult-derived+resident+cardiac+macrophages+are+maintained+through+distinct+mechanisms+at+steady+state+and+during+inflammation.">Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation.</a> Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).</li><li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+abundant+tissue+macrophage+population+in+the+adult+murine+heart+with+a+distinct+alternatively-activated+macrophage+profile.">An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile.</a> PLoS One. 7 (5), 36814 (2012).</li><li>Lavine, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+macrophage+lineages+contribute+to+disparate+patterns+of+cardiac+recovery+and+remodeling+in+the+neonatal+and+adult+heart.">Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).</li><li>Fujiu, K., Wang, J., Nagai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardioprotective+function+of+cardiac+macrophages.">Cardioprotective function of cardiac macrophages.</a> Cardiovascular Research. 102 (2), 232-239 (2014).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Nahrendorf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+healing+myocardium+sequentially+mobilizes+two+monocyte+subsets+with+divergent+and+complementary+functions.">The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions.</a> Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).</li><li>Clemente-Casares, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD103(+)+Conventional+Dendritic+Cell+Surveillance+System+Prevents+Development+of+Overt+Heart+Failure+during+Subclinical+Viral+Myocarditis.">A CD103(+) Conventional Dendritic Cell Surveillance System Prevents Development of Overt Heart Failure during Subclinical Viral Myocarditis.</a> Immunity. 47 (5), 974-989 (2017).</li><li>Van der Borght, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Infarction+Primes+Autoreactive+T+Cells+through+Activation+of+Dendritic+Cells.">Myocardial Infarction Primes Autoreactive T Cells through Activation of Dendritic Cells.</a> Cell Reports. 18 (12), 3005-3017 (2017).</li><li>Galkina, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preferential+migration+of+effector+CD8++T+cells+into+the+interstitium+of+the+normal+lung.">Preferential migration of effector CD8+ T cells into the interstitium of the normal lung.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3473-3483 (2005).</li><li>Edelson, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+CD103++dendritic+cells+form+a+unified+subset+developmentally+related+to+CD8alpha++conventional+dendritic+cells.">Peripheral CD103+ dendritic cells form a unified subset developmentally related to CD8alpha+ conventional dendritic cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 823-836 (2010).</li></ol>

Hjärtinfarkt, inflammation eller myokardit, är en funktion av den kardiovaskulära sjukdomar. Hjärtmuskeln är dock inte saknar egen immuna komponenter i icke-sjukdomstillstånd. Under steady-state många immunceller bosatta i hjärtmuskeln och spela viktiga roller underhåll och skydd. Karakterisering av dessa olika populationer av celler skulle inte ha varit möjligt utan metoder såsom den presenteras i detta protokoll.
En kombination av mekaniska och enzymatisk nedbrytning av myokardiet...

Olika former av hjärtinfarkt stress eller skada, inklusive ischemisk (ischemi reperfusion eller hjärtinfarkt) och icke-ischemisk (hypertoni eller myokardit), främja rekrytering av inflammatoriska celler med reparerande och skyddande, men också patogena egenskaper. Så tidigt som 1891, beskrev Romberg först förekomsten av cellulära infiltrat i myokardiet patienter smittade med tyfus och scharlakansfeber1. Den detaljerade studien av hjärt immunceller krävs dock utvecklingen av mer avancerade immunophenotyping tekniker. Följaktligen, har nyligen vi börjat förstå att en mångskiftande befolkningen av immunceller med nödvändigt underhållsarbete roller under steady-state är bosatt inom myokardiet.
Histologi har varit, och fortfarande är den vanligaste metoden att karakterisera hjärt immunceller vid inflammation. Men medan histologi representerar ett värdefullt diagnostiskt verktyg, har dess användning i studien av hjärt immunceller viktiga begränsningar. Immuncellerna bosatta i myokardiet utgör en mycket liten andel av de totala cellerna och är mer eller mindre jämnt fördelade i ett proportionellt enorma utrymme. Likaså visar flera former av hjärt inflammation, till exempel viral myokardit, focal mönster av inflammation. Detta innebär att korrekt analys av immunsystemet hos hjärtat ofta kräver högre grader av histologisk provtagning, ökar kostnaden för att minska bias. Dessutom ger histologi en mycket begränsad mängd användbara informationen i cell identifiering (t.ex. antal parametrar). Med ett ständigt ökande antal cell delmängder som kräver användning av flera uttryck markörer (inklusive yta markörer, transkriptionsfaktorer eller utsöndras molekyler), har flödescytometri etablerat sig som det mest kraftfulla verktyget för immunophenotyping, på grund av låga kostnader och hög genomströmning.
Användningen av immunophenotyping metoder är nära beroende av utvecklingen av effektiv matsmältning protokoll som tillåts för singel-celler analys av stort antal celler. Utvecklingen av uttömmande protokoll av cell utvinning öppnas ett nytt fönster av möjligheter i studien av hjärt immunologi. Genom kombinationen av matsmältningen, flödescytometri och transkriptomik varit de stora populationerna av makrofager och dendritiska celler som bor i hjärtat kännetecknas2,3. Den vanligast förekommande befolkningen av hjärt immunceller under steady-state är CD64+MerTK+ makrofager, som kan delas upp ytterligare baserat på deras uttryck för CCR2 eller CD11c2. CCR2+ makrofager kommer från vuxen benmärg blodbildning, medan majoriteten av CCR2– makrofager, som kan uttrycka höga eller låga nivåer av MHC-II, är främst av prenatal ursprung. Makrofager utför viktiga funktioner såsom reparation4 och avlägsnande av skräp5 under skada eller stödja elektrisk anslutning6 i steady state. Under olika former av inflammation en viktig tillströmning av Ly6CHej MHC-IIlo CD64int monocyter uppstå, som senare differentieras till Ly6CHej CCR2+ makrofager2,7 . En betydligt mindre, men viktiga, population av celler som är bosatta i hjärtmuskeln hos friska individer består av dendritiska celler8,9. Två stora delmängder av hjärt konventionella DCs (CDC) har karaktäriserats nyligen: cDC1 (CD103+ DCs) och cDC2 (CD11b+ DCs). DCs spelar viktiga roller i försvar mot infektion8 men kan också främja självskadebeteende vid inflammation, särskilt under hjärtinfarkt9.
Här, beskriver vi en enkel metod för isolering av livskraftiga hjärt immunceller från mus myokardiet. Metoden kombinerar enzymatisk och mekanisk matsmältningen med en cell-SIL filtrering för att erhålla en enda cellsuspension som kan analyseras eller ytterligare renas, av flöde flödescytometri sortering eller magnetiska pärla anrikning. Noggranna mätningar av extravaskulära hjärtmuskelceller kräver hjärt perfusion för att ta bort eventuella föroreningar från blodet av den kardiella mikrocirkulation. Dessutom presenterar vi ett valfritt steg av intravaskulär märkning av immunceller som kan användas för att ytterligare differentiera hjärtmuskelceller från intravaskulär föroreningar, baserat på Galkina et al. protokoll10. Slutligen presenterar vi en grundläggande flöde flödescytometri analys för att identifiera stora makrofag och cDC subpopulationsna.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:815px;" width="814">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:340px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:123px;">Wisent</td>
			<td style="width:185px;">311-010-CL</td>
			<td style="width:167px;">1x PBS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">21Gx 1 1/2 (0.8mmx40mm) PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>311-511-CL</td>
			<td>1x HBSS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4503-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9433</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.5M Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vacuum filter , 0.2 &#181;m Filtropur V50</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1823.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">28G 1/2 1 cc insulin syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>329424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">60 mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td>1x DMEM with 4.5 g/L glucose and L-Glutamine and Sodium Pyruvate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Collagenase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C0130</td>
			<td>from Clostridium histolyticum</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Hyaluronidase type I-S</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DNase-I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4513</td>
			<td>from bovine pancreas</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell strainer, 40 &#181;m Nylon</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ammonium-Chloride- Potassium (ACK) lysis buffer</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>10-546E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101222</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC/Cy7 anti-mouse Ly-6c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>128025</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">APC anti-mouse CD103</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>121414</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117334</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PE anti-mouse Ly-6G</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>127607</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pacific Blue anti-mouse I-Ab</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>116422</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FITC anti-mouse CD64 (FcgRI)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>139315</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PE/Cy7 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103113</td>
			<td>1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PerCP/Cy5.5 anti-mouse CD45</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103132</td>
			<td>1:40 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TruStain fcX (anti-mouse CD16/32)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">True-Stain Monocyte Blocker</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>426101</td>
			<td>1:20 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FlowJo V10</td>
			<td>TreeStar Inc</td>
			<td></td>
			<td>https://www.flowjo.com/solutions/flowjo</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mouse: Batf3-/-</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX: 013755</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and identification of extravascular immune cells of the heart

Immunförsvaret är en viktig komponent i ett friskt hjärta. Hjärtmuskeln är hem för en rik population av olika immunceller undergrupper med funktionell uppdelning under steady-state och olika former av inflammation. Tills nyligen, studiet av immunceller i hjärtat krävs användning av mikroskopi eller dåligt utvecklad matsmältning-protokollen, som tillhandahålls tillräckligt känslighet under svår inflammation men kunde inte tryggt identifiera små — men nyckel — populationer av celler under steady-state. Här diskuterar vi en enkel metod kombinerar enzymatisk (kollagenas, hyaluronidas och DNAse) och mekanisk nedbrytning av murina hjärtan föregås av Intravaskulär administrering av fluorescently-märkta antikroppar att skilja liten men oundvikliga intravaskulära cell föroreningar. Metoden genererar en suspension av isolerade viabla celler som kan analyseras med flödescytometri för identifiering, fenotypning och kvantifiering, eller ytterligare renas med fluorescens-aktiverad cell sortering eller magnetiska pärla separation för transkriptionell analys eller in vitro- studier. Vi har ett exempel på en stegvisa flöde flödescytometrisk analys att skilja de viktiga makrofager och dendritiska cellpopulationer av hjärtat. För en medellång medelstora experiment (10 hjärtan) kräver avslutningen av förfarandet 2 – 3 h.

Hittills har har ingen bra metod utformats för att isolera immunceller från andra kardiella cell komponenter, såsom hjärtmuskelcellerna. Analysen av hjärt enda cellsuspension av flödescytometri kräver därför en pre gating med CD45 att identifiera immunceller befolkningarna, följt av enskild cell och liten storlek utslagning Usenets (figur 1A). En livskraft färgning kan alternativt utföras för att utesluta döda celler. Liten stor...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart at JoVE.com

Isolation and Identification of Extravascular Immune Cells of the Heart

Isolering och identifiering av extravaskulära immunceller i hjärtat

Detta protokoll presenterar en enkel och effektiv metod för att isolera, identifiera och kvantifiera immunceller som är bosatta i myokardiet möss under steady-state eller inflammation. Protokollet kombinerar enzymatisk och mekanisk matsmältningen för generering av en enda cellsuspension som ytterligare kan analyseras med flödescytometri.

The immune system is an essential component of a healthy heart. The myocardium is home to a rich population of different immune cell subsets with ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Calpain Activity in Fixed and Living Cells by Flow Cytometry

Mätning Calpain aktivitet inom fast och levande celler med flödescytometri

Calpains are ubiquitous intracellular, calcium-sensitive, neutral cysteine proteases 1. Calpains play crucial roles in many physiological processes, ...

Seven Steps to Stellate Cells

Sju steg till stellate celler

Hepatic stellate cells are liver-resident  cells of star-like morphology and are located in the space of Disse between  liver sinusoidal endothelial cells ...

Isolation of Functional Cardiac Immune Cells

Isolering av Funktionell Cardiac immunceller

Cardiac immune cells are gaining interest for the roles they play in the pathological remodeling in many cardiac diseases.1-5  These immune cells, which ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

En introduktion till parasitsteklar av<em&gt; Drosophila</em&gt; Och Antiparasite immunsvar

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Intravital Imaging of the Mouse Thymus using 2-Photon Microscopy

Intravital Imaging av Mouse Thymus med 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) provides image acquisition in deep areas inside tissues and organs. In combination with the development of new stereotactic ...

Differentiating Functional Roles of Gene Expression from Immune and Non-immune Cells in Mouse Colitis by Bone Marrow Transplantation

Skilja funktionella roller av genuttryck från immuna och icke-immuna celler i mus Kolit av benmärgstransplantation

To understand the role of a gene in the development of colitis, we compared the responses of wild-type mice and gene-of-interest deficient knockout mice ...

Flow Cytometric Isolation of Primary Murine Type II Alveolar Epithelial Cells for Functional and Molecular Studies

Flödescytometrisk Isolering av primära murin typ II alveolära epitelceller för Funktionella och molekylära studier

Throughout  the last years, the contribution of alveolar type II epithelial cells (AECII)  to various aspects of immune regulation in the lung has been ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

Isolering av immun fettvävnad celler

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

Isolering, identifiering och rening av murina Thymic epitelceller

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain

Isolering och flödescytometrisk analys av immunceller från ischemisk Mouse Brain

Ischemic stroke initiates a robust inflammatory response that starts in the intravascular compartment and involves rapid activation of brain resident ...