Name: targeted and selective treatment of pluripotent stem cell-derived teratomas using external beam radiation in a small-animal model
Uploaded: 2019-02-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke de nationale institutter for sundhed R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) og 5F32HL134221 (JWR); Howard Hughes Medical Institute (ASL); og den Stanford kardiovaskulære Institute (ASL) for deres støtte.

Dette dyr eksperiment blev godkendt og udført under den institutionelle Review Board og det Administrative Panel for Laboratory Animal Care på Stanford University.
1. celle kultur af iPSCs
<ol><li>Dyrke menneskelige iPSCs afledt af lentiviral omprogrammering på 6-godt plader overtrukket med basalmembranen matrix (f.eks. matrigel, omtales som matrix hereon).</li>
	<li>Dagligt ændre medier af iPSCs med beriget næringssubstratet (Se Tabel af materialer) inkubation ved 37 ?...

<ol>
	<li>Sallam, K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+biology:+insights+from+molecular+imaging.">Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).</li><li>Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies.">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).</li><li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient.">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLOS Medicine. 6 (2), e1000029 (2009).</li><li>Kuriyan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vision+Loss+after+Intravitreal+Injection+of+Autologous+&amp;#34;Stem+Cells&amp;#34;+for+AMD.">Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous &amp;#34;Stem Cells&amp;#34; for AMD.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).</li><li>Berkowitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioproliferative+Lesion+of+the+Spinal+Cord+as+a+Complication+of+&amp;#34;Stem-Cell+Tourism&amp;#34.">Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of &amp;#34;Stem-Cell Tourism&amp;#34.</a> The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).</li><li>Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratoma+formation:+A+tool+for+monitoring+pluripotency+in+stem+cell+research.">Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research.</a> StemBook. , (2012).</li><li>Scott, C. T., Magnus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wrongful+termination:+lessons+from+the+Geron+clinical+trial.">Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).</li><li>Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geron+trial+resumes,+but+standards+for+stem+cell+trials+remain+elusive.">Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive.</a> Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).</li><li>Coghlan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+mutations+put+stem+cell+trial+on+hold.">Unexpected mutations put stem cell trial on hold.</a> New Scientist. 227 (3033), 9 (2015).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+against+SSEA-5+glycan+on+human+pluripotent+stem+cells+enables+removal+of+teratoma-forming+cells.">An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).</li><li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cell+number+on+teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells.">Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells.</a> Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).</li><li>Tano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+method+for+detecting+undifferentiated+human+pluripotent+stem+cells+as+impurities+in+cell+therapy+products+using+a+highly+efficient+culture+system.">A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system.</a> PLoS One. 9 (10), e110496 (2014).</li><li>Kuroda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vitro+methods+for+detection+of+residual+undifferentiated+cells+in+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+iPS+cells.">Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37342 (2012).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival,+proliferation,+and+migration+after+cardiac+delivery.">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+embryonic+stem+cell+misbehavior+and+suicide+gene+ablation.">Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation.</a> Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).</li><li>Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+Mutations,+Ganciclovir+Resistance,+and+Teratoma+Formation+in+Human+iPSCs+Expressing+an+HSVtk+Suicide+Gene.">Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e284 (2016).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+susceptibility+to+DNA+damage+of+pluripotent+stem+cells+facilitates+pharmacologic+purging+of+teratoma+risk.">Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).</li><li>Choo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+against+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+by+a+cytotoxic+antibody+recognizing+podocalyxin-like+protein-1.">Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1.</a> Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).</li><li>Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+safety+in+external+beam+radiation+therapy.">Patient safety in external beam radiation therapy.</a> American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+micro-computed+tomography-based+image-guided+conformal+radiotherapy+system+for+small+animals.">Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals.</a> International Journal of Radiation Oncology &#8226; Biology &#8226; Physics. 78 (1), 297-305 (2010).</li><li>Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subacute+neuropathological+effects+of+microplanar+beams+of+x-rays+from+a+synchrotron+wiggler.">Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).</li><li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Report:+External+Beam+Radiation+Therapy+for+the+Treatment+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Teratomas.">Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas.</a> Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).</li><li>Berkowitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioproliferative+Lesion+of+the+Spinal+Cord+as+a+Complication+of+&amp;#34;Stem-Cell+Tourism&amp;#34.">Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of &amp;#34;Stem-Cell Tourism&amp;#34.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).</li><li>Swijnenburg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+stem+cells+reveals+patterns+of+survival+and+immune+rejection+following+transplantation.">In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+de+novo+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratoma+formation.">Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation.</a> Cancer Research. 69 (7), 2709-2713 (2009).</li><li>Priddle, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+human+embryonic+stem+cells+transplanted+in+vivo+in+murine+and+chick+models.">Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models.</a> Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).</li><li>Dale, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-rate+effects+in+targeted+radiotherapy.">Dose-rate effects in targeted radiotherapy.</a> Physics in Medicine &amp; Biology. 41 (10), 1871-1884 (1996).</li></ol>

Prækliniske data og anekdotiske tilfælde fra ofre for "stem cell turisme" bekræfte, at risikoen for at udvikle Teratomer er en alvorlig ulempe forbundet med PSC behandlinger23. Udvikling af omhyggelige metoder til at forebygge og behandle de neoplastiske risiko forbundet med stamcelleterapier er derfor et vigtigt skridt til at lette den kliniske oversættelse af regenerativ stamcelleterapier. I denne artikel, vi beskrevet en metode af terapeutiske målretning af PSC-associerede Teratomer ved hj...

Udviklingen af stamceller behandlingsformer for vævsregeneration har fundet en række barrierer i de sidste mange årtier, hæmmer bestræbelserne for effektiv klinisk implementering. Disse forhindringer omfatter dårlig celle fastholdelse på lokaliteter af levering, stamcelle immunogenicitet og neoplastiske potentiale til form Teratomer1. Tumorigenisitetsforsøg er af klinisk bekymring, som det kan potentielt skade stamcelle transplantation modtagere2. Konti af tumordannelse på grund af ureguleret stamcelle injektioner er allerede blevet rapporteret i flere klinisk indstillinger3,4,5. Potentialet for teratom dannelse er mest hyppigt citeret klinisk bekymring i pluripotente stamceller (PSC) udvikling har resulteret i forsinkelser og aflysninger af flere højt profilerede embryonale stamceller (ESC) og induceret pluripotente stamceller (iPSC) forsøg6,7,8,9. Således er der et presserende behov for en translationel undersøgelse dedikeret mod at yde passende behandling, bør disse iatrogen tumorer opstår.
Til dato, har de fleste strategier til at styre stamcelle dårlig opførsel fokuseret på at nedbringe antallet af PSC'er med tumorfremkaldende potentielle2,10. Desværre, kun et lille antal resterende celler (e.g., 1 x 104 til 1 x 105 celler11) er påkrævet for teratom dannelse, som er langt under detektionsgrænsen citeret af foreliggende assays12, 13. andre begrænsninger ved brug af disse preseparation metoder omfatter lav effektivitet og høje omkostninger, afhængighed af encellede suspensioner, der ikke muligvis er relevant for nyere vævsmanipulering tilgange, og den potentielle værdiforringelse af celle overlevelse og engraftment.
Få studier har behandlet behandlingsmuligheder efter teratom dannelse. Måske er den mest velundersøgte strategi integrationen af "selvmord" gener i stamceller14,15. Denne metode involverer genetisk manipulere stamceller for at indarbejde en inducerbar aktivering af apoptose gen, der kan aktiveres ved farmakologiske stimulation postinjection, hvilket giver en redning tilgang, hvis injicerede celler producerer Teratomer. Denne tilgang, men lider af betydelige ulemper, herunder off target effekter af genetiske modifikationer af PSC'er og mulighederne for en gradvis udvikling af drug resistance16. En lignende tilgang udnytter små molekyler for at fremkalde selektiv celledød af PSC'er via hæmning af anti-apoptotiske veje17. Andre grupper har målrettet celledød af kvikskrankerne ved hjælp af antistoffer mod pluripotency overflade markører, såsom podocalyxin-lignende protein-1 (PODXL)18. Timingen af små-molekyle eller antistof levering står at have en betydelig indvirkning på den terapeutiske potentiale af kvikskranker, hvis leveret for tidligt og kan mangle terapeutiske virkning, hvis leveres for sent. Desuden, de systemiske virkninger af små molekyler og antistoffer bruges på denne måde ikke er blevet undersøgt.
En alternativ metode til behandling af disse tumorer er baseret på brug af ekstern strålebehandling strålebehandling (EBRT). EBRT er en af de primære modaliteter i øjeblikket ansat i behandling af solide tumorer19. Nyskabelser i EBRT, herunder udvikling af proton stråle og stereotactic radiosurgery, har aktiveret forbedrede målretning af patologiske strukturer samtidig undgå skader på normale væv, hvilket gør conformal EBRT ideel for adressering teratom dannelse i anatomisk følsomme strukturer20. Desuden, denne metode undgår genetisk manipulation eller viral transduktion af stamceller, der begge er fyldt med yderligere kliniske sikkerhed og effekt vedrører15. Endelig, fremskridt i mikro-irradiators har aktiveret anvendelsen af EBRT i gnavere21.
I denne artikel vil vise vi hvordan du opretter et lille dyr model af teratom dannelse ved at indsprøjte menneskelige iPSCs i mus. Derefter viser vi hvordan man kan anvende EBRT at selektivt udrydde disse tumorer in vivo med minimal skade på omkringliggende væv. Denne fremgangsmåde giver en målrettet behandling til PSC-afledte Teratomer samtidig undgå off target virkningerne af den systemiske levering af biologiske molekyler og peptider og genmanipulation af kvikskranker. Henblik på testpræparater tilbyder vi et valgfrit trin for at transduce stamceller med reporter gener at spore tumor respons til strålebehandling via bioluminescens imaging (BLI).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Induced Pluripotent Stem Cell Control Line</td>
			<td>Stanford University</td>
			<td>Nguyen Lab</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning matrigel basement membrane matrix 354234</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 culture medium</td>
			<td>ATCC-The global bioresource center</td>
			<td>30-2203</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple E</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-036</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S104950MG</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentivirus</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>P170721-1001cjn</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyrbrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter</td>
			<td>Stanford University</td>
			<td>Sam Gambhir lab</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACSARIA III)</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>FACSAria</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)</td>
			<td>Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA</td>
			<td>GM2000</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS 200&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>BLI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936</td>
			<td>irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad SmART image-guided irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-ray Inc., North Branford, CT</td>
			<td>X-Rad SmART</td>
			<td>irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT_Image software package</td>
			<td>Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)</td>
			<td>RT_Image v0.2&#946;</td>
			<td>Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted and selective treatment of pluripotent stem cell-derived teratomas using external beam radiation in a small-animal model

Det stigende antal ofre for "stem cell turisme," ureguleret transplantation af stamceller på verdensplan, har udtrykt bekymring over sikkerheden for stamcelletransplantation. Selv om transplantation af differentierede i stedet for udifferentierede celler er almindelig praksis, Teratomer kan stadig opstå som følge af forekomsten af resterende udifferentierede stamceller på tidspunktet for transplantation eller fra spontane mutationer i opdelte celler. Fordi stamcelleterapier leveres ofte i anatomisk følsomme sites, kan selv små tumorer være klinisk ødelæggende, resulterer i blindhed, lammelser, kognitive abnormiteter og hjerte-kar-dysfunktion. Kirurgisk adgang til disse websteder kan også være begrænset, forlader patienter med få terapeutiske muligheder. Kontrollerende stamcelle dårlig opførsel er derfor afgørende for den kliniske oversættelse af stamcelleterapi.
Ekstern strålebehandling tilbyder et effektivt middel til levere målrettet behandling til at mindske teratom byrde og minimere skader på omkringliggende organer. Desuden, denne metode undgår genetisk manipulation eller viral transduktion af stamceller, som er forbundet med yderligere kliniske sikkerhed og effekt bekymringer. Her, beskriver vi en protokol til at oprette pluripotente stamceller-afledt Teratomer i mus og anvende ekstern strålebehandling strålebehandling for at selektivt ablate disse tumorer in vivo.

Injiceres mus vil typisk godtgøre teratom vækst dannelsen efter 4-8 uger som bekræftet af BLI imaging (figur 2). Tumorer vil skrumpe drastisk, når bestrålet med en kumuleret dosis paa 18 Gy givet én måned efter celle levering, hvilket resulterer i en betydelig nedgang i luciferase signal (figur 2). Vigtigere, synes normale væv taget 5 mm fra webstedet bestrålede ikke at have nogen betydelige skader (...

Watch this Scientific Journal Video about Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model at JoVE.com

Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Forskning på behandling strategier for pluripotente stamceller-afledt Teratomer er vigtig for den kliniske oversættelse af stamcelleterapi. Her, beskriver vi en protokol til, først, generere stamcelle-afledt Teratomer i mus og derefter til selektivt målrette og behandle disse tumorer in vivo, ved hjælp af en små-dyrs irradiator.

Målrettet og selektiv behandling af pluripotente stamceller-afledt Teratomer ved hjælp af ekstern strålebehandling i et lille dyr Model

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

Det overordnede mål med denne procedure er selektivt at målrette stamceller-afledte teratomer i mus til vurdering af in vivo effektiviteten af små dyr ekstern strålebehandling. Den største fordel ved ekstern strålebehandling er, at det er en målrettet behandling for stamceller associerede teramtomas, der undgår off-mål negative virkninger af systemisk leveret behandlinger. Fremskridt inden for ekstern strålebehandling af strålebehandling har gjort det muligt at målrette små teratomer og samtidig undgå skader på normale væv, hvilket gør denne behandling ideel til behandling af strålingsfølsomme teratomer.Denne metode kan ikke kun give indsigt i optimering af strategier for cellebehandlinger, det har også potentiale til at blive klinisk anvendelig i menneskelige behandlinger. Begynd med at tage en seks-brønd plade, der indeholder iPSCs. For at fremkalde tetratomadannelse hos immundefekte dyr tilsættes en milliliter rekombinant celleeksposisationsenzymblanding pr. brønd af den 6-brønds plade, der indeholder inducerede pluripotente stamceller, der er transuceret med et dobbelt fusionsreportergen i fem minutters inkubation ved stuetemperatur.I slutningen af inkubationen sprede cellerne ved pipettering og stoppe enzymatisk reaktion ved at tilføje en lige volumen af cellekultur medium til hver brønd. Træk enkeltcellesuspensionerne i et konisk rør til tælling af 15 milliliter. Efter centrifugering er færdig, aspirere supernatant og resuspend pellet i 30 mikroliter af Matrigel matrix løsning og placere røret på is.Hvis der anvendes dobbeltfusion reportagen transficerede celler, bør disse dobbelt positive påvirke celler også suspenderes i 30 mikroliter af matrix. Dernæst indlæse hver cellepopulation i en en milliliter sprøjte udstyret med 28,5 gauge nål og bekræfte en manglende reaktion på tå knivspids i hver bedøvet otte til 10 uger gamle athymic nøgen modtager mus. Derefter subkutanet injicere en celle matrix blanding i dorsale flanke af hver modtager dyr.På det relevante forsøgstidspunkt efter inokulering injiceres 375 mg/kg deluciferon intraperitoneally i hver modtager. Efter 10 minutter billede bioluminescens signal i hver bedøvet reporter sonde injiceres dyr i 30 minutter ved hjælp af et minut erhvervelse vinduer på fem minutters intervaller, i henhold til standard bioluminescens imaging protokoller. Til bestråling af teratom på det relevante forsøgstidspunkt første gang placerer et bedøvet recipientdyr på sengen af en billedstyret præklinisk irradiator og erhverver et sæt på 400 projektion af mikrocomputertomografibilleder over 360 grader ved hjælp af en 40-top kilovoltage, 2 milliamp x-ray-stråle, og rekonstruerer billedet til volumetriske billeder med en isotropisk pixelstørrelse på 0,2 millimeter.Det er afgørende at rekonstruere volumetriske billeder af teratomer. Disse billeder vil bidrage til at planlægge strålebehandlinger for den specifikke levering af behandlingen til teratomer kun, samtidig med at minimere enhver off-target stråling af det omgivende væv. Brug derefter mikro-CT-aftryk og RT-billedsoftwarepakken til at planlægge en strålebehandlingsprotokol.Administrere behandlingen i tre på hinanden følgende dage til at levere i alt 18 grå til målet tumor. De injicerede mus typisk demonstrere teratoma vækst dannelse fire til eigth uger efter tumorcelle injektion som bekræftet af bioluminescens imaging. Når bestrålet med en kumulativ gør af 18 grå en måned efter celle levering tumorer vil skrumpe dramatisk resulterer i en betydelig sammenfaldende fald i luciferase signal.Det er vigtigt, som disse billeder illustrerer, at normale vævsbiopsier, der er høstet fem milliliter fra det bestrålede sted, ikke synes at forårsage nogen væsentlig skade. Efter at have set denne video, bør du have en klar forståelse af, hvordan du opretter stamceller afledte teratomer in vivo og til effektivt og sikkert behandle dem med ekstern strålestråling. Denne enkle tilgang kræver erhvervelse af høj opløsning CT-billeder af et emne, hvorefter en række strålebehandlinger kunne ordineres til at bestråle målet tumorer, og samtidig undgå tilstødende væv.Glem ikke, at arbejde med stråling kan være yderst farligt, og at forholdsregler, såsom at bruge de relevante skjolde, bør altid tages, mens du udfører denne procedure.

Research

JoVE Journal

Medicine

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protokol for Long Duration Whole Body Hypertermi i mus

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Vurdering af hjertefunktion og Myocardial morfologi Brug Small Animal Look-skab Inversion Recovery (SALLI) MRI i rotter

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

Scleral Cross-linking Brug riboflavin og Ultraviolet-A stråling til forebyggelse af Axial Nærsynethed i en kanin Model

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluering af fraktur Callus udvikling under knogleheling i mus ved hjælp af en Mr-kompatible osteosyntese enhed for musen lårben

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Radiation Planning Assistant - A Streamlined, Fully Automated Radiotherapy Treatment Planning System

Stråling planlægning assistent - en strømlinet, fuldautomatisk strålebehandling behandling planlægning System

The Radiation Planning Assistant (RPA) is a system developed for the fully automated creation of radiotherapy treatment plans, including volume-modulated ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

En lille dyremodel af Ex Vivo Normothermic lever Perfusion

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet måling af musen mesenterica arterie ved hjælp af Wire blodkar

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

Etablering af en svin model af post-myokardieinfark hjertesvigt for stamcellebehandling

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Sarcomere Afkortning af pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter ved hjælp af fluorescerende-tagged Sarcomere proteiner.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...