Name: targeted and selective treatment of pluripotent stem cell-derived teratomas using external beam radiation in a small-animal model
Uploaded: 2019-02-17T13:00:00
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Gli autori vorrei ringraziare la nazionale istituti di salute R01 HL134830 (PKN), K08 HL135343 (KS) e 5F32HL134221 (JWR); Howard Hughes Medical Institute (ASL); e l'Istituto cardiovascolare di Stanford (ASL) per il loro sostegno.

Questo esperimento sugli animali è stato approvato ed eseguito sotto l'Institutional Review Board e il pannello di amministrazione su Laboratory Animal Care presso la Stanford University.
1. cella cultura di iPSCs
<ol><li>Crescere umano iPSCs derivate riprogrammando lentivirali su piastre da 6 pozzetti rivestite con matrice della membrana basale (ad es., matrigel, indicato come matrice hereon).</li>
	<li>Cambio quotidiano di media di iPSCs con terreno di coltura arricchito (Vedi Tab...

<ol>
	<li>Sallam, K., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+biology:+insights+from+molecular+imaging.">Embryonic stem cell biology: insights from molecular imaging.</a> Methods in Molecular Biology. 660, 185-199 (2010).</li><li>Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenicity+as+a+clinical+hurdle+for+pluripotent+stem+cell+therapies.">Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies.</a> Nature Medicine. 19 (8), 998-1004 (2013).</li><li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient.">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLOS Medicine. 6 (2), e1000029 (2009).</li><li>Kuriyan, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vision+Loss+after+Intravitreal+Injection+of+Autologous+&amp;#34;Stem+Cells&amp;#34;+for+AMD.">Vision Loss after Intravitreal Injection of Autologous &amp;#34;Stem Cells&amp;#34; for AMD.</a> The New England Journal of Medicine. 376 (11), 1047-1053 (2017).</li><li>Berkowitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioproliferative+Lesion+of+the+Spinal+Cord+as+a+Complication+of+&amp;#34;Stem-Cell+Tourism&amp;#34.">Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of &amp;#34;Stem-Cell Tourism&amp;#34.</a> The New England Journal of Medicine. 375, 196-198 (2016).</li><li>Zhang, W. Y., de Almeida, P. E., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratoma+formation:+A+tool+for+monitoring+pluripotency+in+stem+cell+research.">Teratoma formation: A tool for monitoring pluripotency in stem cell research.</a> StemBook. , (2012).</li><li>Scott, C. T., Magnus, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wrongful+termination:+lessons+from+the+Geron+clinical+trial.">Wrongful termination: lessons from the Geron clinical trial.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 3 (12), 1398-1401 (2014).</li><li>Strauss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geron+trial+resumes,+but+standards+for+stem+cell+trials+remain+elusive.">Geron trial resumes, but standards for stem cell trials remain elusive.</a> Nature Biotechnology. 28 (10), 989-990 (2010).</li><li>Coghlan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unexpected+mutations+put+stem+cell+trial+on+hold.">Unexpected mutations put stem cell trial on hold.</a> New Scientist. 227 (3033), 9 (2015).</li><li>Tang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+against+SSEA-5+glycan+on+human+pluripotent+stem+cells+enables+removal+of+teratoma-forming+cells.">An antibody against SSEA-5 glycan on human pluripotent stem cells enables removal of teratoma-forming cells.</a> Nature Biotechnology. 29 (9), 829-834 (2011).</li><li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+cell+number+on+teratoma+formation+by+human+embryonic+stem+cells.">Effects of cell number on teratoma formation by human embryonic stem cells.</a> Cell Cycle. 8 (16), 2608-2612 (2009).</li><li>Tano, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+in+vitro+method+for+detecting+undifferentiated+human+pluripotent+stem+cells+as+impurities+in+cell+therapy+products+using+a+highly+efficient+culture+system.">A novel in vitro method for detecting undifferentiated human pluripotent stem cells as impurities in cell therapy products using a highly efficient culture system.</a> PLoS One. 9 (10), e110496 (2014).</li><li>Kuroda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+sensitive+in+vitro+methods+for+detection+of+residual+undifferentiated+cells+in+retinal+pigment+epithelial+cells+derived+from+human+iPS+cells.">Highly sensitive in vitro methods for detection of residual undifferentiated cells in retinal pigment epithelial cells derived from human iPS cells.</a> PLoS One. 7 (5), e37342 (2012).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival,+proliferation,+and+migration+after+cardiac+delivery.">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113 (7), 1005-1014 (2006).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+of+embryonic+stem+cell+misbehavior+and+suicide+gene+ablation.">Molecular imaging of embryonic stem cell misbehavior and suicide gene ablation.</a> Cloning Stem Cells. 9 (1), 107-117 (2007).</li><li>Kotini, A. G., de Stanchina, E., Themeli, M., Sadelain, M., Papapetrou, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escape+Mutations,+Ganciclovir+Resistance,+and+Teratoma+Formation+in+Human+iPSCs+Expressing+an+HSVtk+Suicide+Gene.">Escape Mutations, Ganciclovir Resistance, and Teratoma Formation in Human iPSCs Expressing an HSVtk Suicide Gene.</a> Molecular Therapy - Nucleic Acids. 5, e284 (2016).</li><li>Smith, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptotic+susceptibility+to+DNA+damage+of+pluripotent+stem+cells+facilitates+pharmacologic+purging+of+teratoma+risk.">Apoptotic susceptibility to DNA damage of pluripotent stem cells facilitates pharmacologic purging of teratoma risk.</a> STEM CELLS Translational Medicine. 1 (10), 709-718 (2012).</li><li>Choo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+against+undifferentiated+human+embryonic+stem+cells+by+a+cytotoxic+antibody+recognizing+podocalyxin-like+protein-1.">Selection against undifferentiated human embryonic stem cells by a cytotoxic antibody recognizing podocalyxin-like protein-1.</a> Stem Cells. 26 (6), 1454-1463 (2008).</li><li>Yorke, E., Gelblum, D., Ford, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient+safety+in+external+beam+radiation+therapy.">Patient safety in external beam radiation therapy.</a> American Journal of Roentgenology. 196 (4), 768-772 (2011).</li><li>Zhou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+micro-computed+tomography-based+image-guided+conformal+radiotherapy+system+for+small+animals.">Development of a micro-computed tomography-based image-guided conformal radiotherapy system for small animals.</a> International Journal of Radiation Oncology &#8226; Biology &#8226; Physics. 78 (1), 297-305 (2010).</li><li>Slatkin, D. N., Spanne, P., Dilmanian, F. A., Gebbers, J. O., Laissue, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subacute+neuropathological+effects+of+microplanar+beams+of+x-rays+from+a+synchrotron+wiggler.">Subacute neuropathological effects of microplanar beams of x-rays from a synchrotron wiggler.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (19), 8783-8787 (1995).</li><li>Lee, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+Report:+External+Beam+Radiation+Therapy+for+the+Treatment+of+Human+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Teratomas.">Brief Report: External Beam Radiation Therapy for the Treatment of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Teratomas.</a> Stem Cells. 35 (8), 1994-2000 (2017).</li><li>Berkowitz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioproliferative+Lesion+of+the+Spinal+Cord+as+a+Complication+of+&amp;#34;Stem-Cell+Tourism&amp;#34.">Glioproliferative Lesion of the Spinal Cord as a Complication of &amp;#34;Stem-Cell Tourism&amp;#34.</a> The New England Journal of Medicine. 375 (2), 196-198 (2016).</li><li>Swijnenburg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+stem+cells+reveals+patterns+of+survival+and+immune+rejection+following+transplantation.">In vivo imaging of embryonic stem cells reveals patterns of survival and immune rejection following transplantation.</a> Stem Cells and Development. 17 (6), 1023-1029 (2008).</li><li>Cao, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+de+novo+imaging+of+human+embryonic+stem+cell-derived+teratoma+formation.">Noninvasive de novo imaging of human embryonic stem cell-derived teratoma formation.</a> Cancer Research. 69 (7), 2709-2713 (2009).</li><li>Priddle, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+of+human+embryonic+stem+cells+transplanted+in+vivo+in+murine+and+chick+models.">Bioluminescence imaging of human embryonic stem cells transplanted in vivo in murine and chick models.</a> Cloning and Stem Cells. 11 (2), 259-267 (2009).</li><li>Dale, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose-rate+effects+in+targeted+radiotherapy.">Dose-rate effects in targeted radiotherapy.</a> Physics in Medicine &amp; Biology. 41 (10), 1871-1884 (1996).</li></ol>

I dati preclinici e casi aneddotici da vittime del "turismo delle cellule staminali" confermano che il rischio di sviluppare i teratomas è un grave inconveniente associato PSC trattamenti23. Sviluppo di approcci attenti per prevenire e trattare il rischio neoplastico associato a terapie con cellule staminali è, pertanto, un passo importante nel facilitare la traduzione clinica delle terapie rigenerative delle cellule staminali. In questo articolo, abbiamo descritto un metodo di targeting terapeu...

Lo sviluppo di terapie con cellule staminali per la rigenerazione tissutale ha rilevato un numero di barriere in parecchi decenni passati, che ostacola gli sforzi per la distribuzione efficiente di clinica. Questi ostacoli sono conservazione scadente delle cellule ai luoghi di consegna, l'immunogenicità delle cellule staminali e il potenziale neoplastico a forma i teratomas1. Carcinogenicità è di particolare interesse clinico in quanto può potenzialmente danneggiare cellule staminali trapianto destinatari2. Conti di formazione del tumore a causa di iniezioni di cellule staminali non regolamentata sono già stati segnalati in molteplici contesti clinici3,4,5. Il potenziale per la formazione di teratoma è il più frequentemente citati preoccupazione clinica nello sviluppo delle cellule staminali (PSC) pluripotenti e ha provocato ritardi e cancellazioni di più alto profilo sulle cellule staminali embrionali (ESC) e indotta da cellule staminali pluripotenti (iPSC) prove6,7,8,9. Così, c'è una necessità urgente per una ricerca traslazionale dedicata verso fornendo trattamento appropriato, dovrebbero sorgere questi tumori iatrogenici.
Ad oggi, la maggior parte delle strategie per controllare il comportamento scorretto di cellule staminali si sono concentrati sulla riduzione del numero degli sportelli unici con potenziale cancerogeno2,10. Purtroppo, solo un piccolo numero di cellule residue (ad es.., 1 x 104 a 1 x 105 celle11) è necessario per la formazione di teratoma, che è molto di sotto del limite di rilevazione citata da saggi attualmente disponibili12, 13. altre limitazioni di utilizzo di questi metodi preseparazione includono bassa efficienza e costi elevati, dipendenza dalle sospensioni unicellulari che potrebbe non essere appropriato per più recenti approcci di ingegneria dei tessuti e il danno potenziale della cella sopravvivenza e l'attecchimento.
Pochi studi hanno affrontato le opzioni di trattamento seguendo la formazione di teratoma. Forse la strategia più ben studiata è l'incorporazione di geni di "suicidio" in cellule staminali14,15. Questo metodo consiste nel manipolare geneticamente le cellule staminali per incorporare un gene d'attivazione apoptosi inducibile che può essere attivato da postinjection di stimolazione farmacologica, fornendo così un approccio di salvataggio se iniettato le cellule producono i teratomas. Questo approccio, tuttavia, soffre di notevoli inconvenienti, tra cui gli effetti delle modificazioni genetiche di sportelli unici e il potenziale per uno sviluppo graduale di farmaco resistenza16fuori bersaglio. Un simile approccio utilizza piccole molecole per indurre la morte selettiva delle cellule degli sportelli unici via l'inibizione di anti-apoptotici vie17. Altri gruppi hanno preso di mira la morte delle cellule degli sportelli unici usando gli anticorpi contro marcatori di pluripotenza superficie, come Podocalixina-come proteina-1 (PODXL)18. I tempi di consegna della piccolo-molecola o anticorpo si trova ad avere un impatto significativo sul potenziale terapeutico degli sportelli unici, se consegnato troppo presto e può alcuna efficacia terapeutica, se consegnato troppo tardi. Inoltre, non sono stati studiati gli effetti sistemici di piccole molecole e gli anticorpi usati in questo modo.
Un approccio alternativo per il trattamento di questi tumori si basa sull'utilizzo di radioterapia esterna del fascio (EBRT). Radioterapia esterna è una delle modalità primaria attualmente impiegata nel trattamento di tumori solidi19. Innovazioni nella radioterapia esterna, compreso lo sviluppo del fascio di protoni e radiosurgery di stereotactic, hanno permesso l'ottimizzazione avanzata delle strutture patologiche, evitando danni al tessuto normale, rendendo conformal EBRT ideale per affrontare il teratoma formazione in strutture anatomicamente sensibili20. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale delle cellule staminali, che sono entrambi irto di ulteriore sicurezza clinica e l'efficacia riguarda15. Infine, gli avanzamenti in micro-irradiatori hanno permesso l'applicazione di EBRT in roditori21.
In questo articolo, dimostriamo come creare un modello di piccoli animali di formazione di teratoma iniettando iPSCs umane in topi. Abbiamo quindi illustrato come applicare EBRT per sradicare selettivamente questi tumori in vivo con minimo danno al tessuto circostante. Questo approccio fornisce una terapia mirata per i teratomas PSC-derivati, evitando gli effetti fuori bersaglio della consegna sistemica di molecole biologiche e peptidi e la manipolazione genetica degli sportelli unici. Ai fini d'investigazione, offriamo un passaggio facoltativo per trasdurre cellule staminali con geni reporter di monitorare la risposta del tumore alla radioterapia via bioluminescenza imaging (BLI).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Induced Pluripotent Stem Cell Control Line</td>
			<td>Stanford University</td>
			<td>Nguyen Lab</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning matrigel basement membrane matrix 354234</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CB-40234</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Essential 8 culture medium</td>
			<td>ATCC-The global bioresource center</td>
			<td>30-2203</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryple E</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605-036</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 inhibitor 2 HCL (ROCK Inhibitor)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S104950MG</td>
			<td>Cell culture of iPSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lentivirus</td>
			<td>Cyagen</td>
			<td>P170721-1001cjn</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyrbrene Infection/Transfection Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>TR-1003-G</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluc-eGFP reporter gene driven by ubiquitin promoter</td>
			<td>Stanford University</td>
			<td>Sam Gambhir lab</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>122799</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene and BLI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer (BD FACSARIA III)</td>
			<td>BD Biosciences&#160;</td>
			<td>FACSAria</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microplate spectrofluorometer (Glomax Navigator System)</td>
			<td>Promega Bio Systems, Sunnyvale, CA</td>
			<td>GM2000</td>
			<td>Transduction of iPSC with double fusion reporter gene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xenogen IVIS 200&#160;</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>124262</td>
			<td>BLI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CDS019936</td>
			<td>irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-Rad SmART image-guided irradiator&#160;</td>
			<td>Precision X-ray Inc., North Branford, CT</td>
			<td>X-Rad SmART</td>
			<td>irradiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT_Image software package</td>
			<td>Stanford University (http://rtimage.sourceforge.net/)</td>
			<td>RT_Image v0.2&#946;</td>
			<td>Irradiation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted and selective treatment of pluripotent stem cell-derived teratomas using external beam radiation in a small-animal model

Il crescente numero di vittime del "turismo delle cellule staminali," il trapianto non regolamentato delle cellule staminali in tutto il mondo, ha sollevato preoccupazioni circa la sicurezza del trapianto di cellule staminali. Sebbene il trapianto di differenziato piuttosto che cellule indifferenziate è pratica comune, i teratomas possono ancora derivano dalla presenza di cellule staminali indifferenziate residuale al momento del trapianto o da mutazioni spontanee in differenziato cellule. Perché terapie con cellule staminali sono spesso trasportate in siti anatomicamente sensibili, anche i piccoli tumori possono essere clinicamente devastanti, con conseguente cecità, paralisi, cognitive anomalie e disfunzioni cardiovascolari. L'accesso chirurgico a questi siti potrebbe essere ridotte, lasciando i pazienti con poche opzioni terapeutiche. Controllo comportamento scorretto della cellula formativa è, quindi, critico per la traduzione clinica della terapia cellulare.
Radiazione esterna del fascio offre un mezzo efficace di erogare la terapia mirata a diminuire l'onere di teratoma, riducendo al minimo lesioni di organi circostanti. Inoltre, questo metodo evita la manipolazione genetica o trasduzione virale di cellule staminali, che sono associati con clinici supplementari di sicurezza ed efficacia. Qui, descriviamo un protocollo per creare i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti in topi e applicare la radioterapia esterna del fascio per ablazione selettivamente questi tumori in vivo.

Topi iniettati in genere dimostrerà la formazione di teratoma crescita dopo 4 – 8 settimane come confermato da BLI imaging (Figura 2). I tumori si ridurranno drasticamente quando irradiati con una dose cumulativa di 18 Gy dato un mese dopo la consegna delle cellule, provocando una diminuzione significativa nel segnale di luciferasi (Figura 2). D'importanza, tessuti normali prelevati 5 mm dal sito irradiato non sembrano avere a...

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Targeted and Selective Treatment of Pluripotent Stem Cell-derived Teratomas Using External Beam Radiation in a Small-animal Model

Ricerca sulle strategie di trattamento per i teratomas derivati da cellule staminali pluripotenti è importante per la traduzione clinica della terapia cellulare. Qui, descriviamo un protocollo per, in primo luogo, generare teratomi derivati da cellule staminali in topi e, quindi, a selettivamente bersaglio e curare questi tumori in vivo usando un irradiatore di piccoli animali.

Trattamento mirato e selettivo dei Teratomas di derivati da cellule staminali pluripotenti utilizzando radiazione esterna del fascio in un modello di piccoli animali

The growing number of victims of &#34;stem cell tourism,&#34; the unregulated transplantation of stem cells worldwide, has raised concerns about the ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di indirizzare selettivamente i teratomi derivati dalle cellule staminali nei topi per la valutazione dell'efficacia in vivo della radioterapia con fascio esterno di piccole dimensioni. Il principale vantaggio della radioterapia esterna con fascio di radiazioni è che è una terapia mirata per i teramtomi associati alle cellule staminali che evita gli effetti avversi off-targets delle terapie fornite sistemicamente. I progressi nella radioterapia con fascio esterno hanno permesso il targeting specifico di piccoli teratomi evitando danni ai tessuti normali, rendendo questa terapia ideale per il trattamento di teratomi sensibili alle radiazioni.Questo metodo non solo può fornire informazioni sull'ottimizzazione delle strategie per le terapie cellulari, ma ha anche il potenziale per diventare clinicamente applicabile nelle terapie umane. Inizia prendendo una piastra da sei pomp po' contenente iPSC. Per indurre la formazione di tetratoma negli animali immunodifesa aggiungere un millilitro di miscela enzimatica di dissociazione cellulare ricombinante per pozzo della piastra a 6 pozzetti contenente cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo trasdotto con un gene reporter a doppia fusione per un'incubazione di cinque minuti a temperatura ambiente.Alla fine dell'incubazione disperdere le cellule pipettando e fermare la reazione enzimatica aggiungendo un volume uguale di mezzo di coltura cellulare ad ogni pozzo. Tirare le sospensioni a cella singola in un tubo conico da 15 millilitri per il conteggio. Al termine della centrifugazione, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet in 30 microlitri della soluzione a matrice Matrigel e posizionare il tubo sul ghiaccio.Se si utilizzano cellule trasfette da reportage a doppia fusione, queste cellule a doppio effetto positivo dovrebbero essere sospese anche in 30 microlitri di matrice. Successivamente, caricare ogni popolazione cellulare in una siringa da un millilitro dotata di ago calibro 28,5 e confermare la mancanza di risposta al dito del piedino in ogni topo ricevente nudo atimico di otto-10 settimane anestetizzato. Quindi, iniettare per via sottocutanea una miscela di matrice cellulare nel fianco dorsale di ogni animale ricevente.Nel momento sperimentale appropriato dopo l'inoculazione iniettare 375 milligrammi per chilogrammo di deluciferon intraperitonealmente in ciascun ricevente. Dopo 10 minuti immagine il segnale di bioluminescenza in ogni sonda reporter anestetizzata iniettato animale per 30 minuti utilizzando finestre di acquisizione di un minuto a intervalli di cinque minuti, secondo i protocolli standard di imaging a bioluminescenza. Per l'irradiazione del teratoma, nel momento sperimentale appropriato, posizionare innanzitutto un animale ricevente anestetizzato sul letto di un irradiatore preclinico guidato dall'immagine e acquisire una serie di 400 immagini di tomografia micro-calcolata di proiezione di oltre 360 gradi utilizzando un kilovoltage di picco di 40 picchi, un fascio di raggi X da 2 milliamp e ricostruire l'immagine in immagini volumetriche con una dimensione pixel isotropica di 0,2 millimetri.È fondamentale ricostruire le immagini volumetriche dei teratomi. Queste immagini aiuteranno a pianificare i trattamenti radioterapici solo per la consegna specifica della terapia ai teratomi, riducendo al minimo qualsiasi radiazione off-target dei tessuti circostanti. Quindi utilizzare le immagini micro-CT e il pacchetto software di immagine RT per pianificare un protocollo di trattamento delle radiazioni.Somministrare il trattamento per tre giorni consecutivi per fornire un totale di 18 grigi al tumore bersaglio. I topi iniettati in genere dimostrano la formazione di crescita del teratoma da quattro a cinque settimane dopo l'iniezione di cellule tumorali come confermato dall'imaging della bioluminescenza. Quando irradiati con una fa cumulativa di 18 grigi un mese dopo il parto cellulare, i tumori si ridurranno drasticamente con conseguente significativa diminuzione coincidente del segnale luciferasi.È importante sottolineare che, come dimostrano queste immagini, le normali biopsie tissutali raccolte da cinque millilitri dal sito irradiato non sembrano subire danni significativi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una chiara comprensione di come creare teratomi derivati dalle cellule staminali in vivo e trattarli in modo efficace e sicuro con radiazioni del fascio esterno. Questo semplice approccio richiede l'acquisizione di immagini CT ad alta risoluzione di un soggetto dopo di che potrebbe essere prescritta una serie di terapie con fascio di radiazioni per irradiare i tumori bersaglio, evitando al contempo il tessuto adiacente.Non dimenticare che lavorare con le radiazioni può essere estremamente pericoloso e che le precauzioni, come l'uso degli scudi appropriati, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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Medicine

Protocol for Long Duration Whole Body Hyperthermia in Mice

Protocollo per lungo Ipertermia Corpo intera durata in Mouse

Hyperthermia is a general term used to define the increase in core body temperature above normal. It is often used to describe the increased core body ...

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Medicina

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery (SALLI) MRI in Rats

Assessment of Cardiac Function and Myocardial Morphology Using Small Animal Look-locker Inversion Recovery SALLI MRI in Rats

Valutazione della funzione cardiaca e Morfologia miocardica Utilizzando Small Animal Look-Locker Inversion Recovery (SALLI) MRI nei ratti

Small animal magnetic resonance  imaging is an important tool to study cardiac function and changes in myocardial  tissue. The high heart rates of small ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studiare cancro del pancreas staminali caratteristiche cellulari per lo sviluppo di nuove strategie di trattamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Scleral Cross-linking Using Riboflavin and Ultraviolet-A Radiation for Prevention of Axial Myopia in a Rabbit Model

Sclerale reticolazione Utilizzando riboflavina e raggi ultravioletti-A di radiazione per la prevenzione della miopia assiale in un modello di coniglio

Myopic individuals, especially those with severe myopia, are at higher-than-normal risk of cataract, glaucoma, retinal detachment and chorioretinal ...

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Evaluation of Fracture Callus Development During Bone Healing in Mice Using an MRI-compatible Osteosynthesis Device for the Mouse Femur

In Vivo Valutazione dello sviluppo di callo di frattura durante la guarigione dell'osso nei topi utilizzando un MRI-compatibile con osteosintesi per il femore di Mouse

Endochondral fracture healing is a complex process involving the development of fibrous, cartilaginous, and osseous tissue in the fracture callus. The ...

Radiation Planning Assistant - A Streamlined, Fully Automated Radiotherapy Treatment Planning System

Pianificazione Assistente - una struttura snella, radiazione completamente automatizzato sistema di pianificazione del trattamento di radioterapia

The Radiation Planning Assistant (RPA) is a system developed for the fully automated creation of radiotherapy treatment plans, including volume-modulated ...

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

A Small Animal Model of Ex Vivo Normothermic Liver Perfusion

Un piccolo modello animale di aspersione epatica normotermica Ex Vivo

There is a significant shortage of liver allografts available for transplantation, and in response the donor criteria have been expanded. As a result, ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Misurazione di contrattilità isometrica dell'arteria mesenterica Mouse con filo Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Establishing a Swine Model of Post-myocardial Infarction Heart Failure for Stem Cell Treatment

Istituzione di un modello suina di infarto post-miocardico per il trattamento delle cellule staminali

Although advances have been achieved in the treatment of heart failure (HF) following myocardial infarction (MI), HF following MI remains one of the major ...

Sarcomere Shortening of Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes using Fluorescent-Tagged Sarcomere Proteins.

Accorciamento sarcomere dei cardiomiociti pluripotenti derivati dalle cellule staminali utilizzando proteine sarcomere con tag fluorescenti.

Pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (PSC-CMs) can be produced from both embryonic and induced pluripotent stem (ES/iPS) cells. These cells ...