Name: plate-based large-scale cultivation of caenorhabditis elegans: sample preparation for the study of metabolic alterations in diabetes
Uploaded: 2018-08-24T14:00:00
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本研究は、ドイツ研究振興協会 (DFG) IRTG 1874「糖尿病性血管合併症」と CRC 1118「糖尿病合併症の原因として反応性代謝物」によって支持されました。線虫株 N2 と CL2166 は、CGC、研究インフラ プログラム (P40 OD010440) の NIH のオフィスによって資金が供給されるによって提供されました。

注: このプロトコルは、5 つのセクションに分かれています。セクション 1-3 大規模な線虫を培養する主なプロトコルが表示されます。セクション 4 と 5 は、糖尿病代謝で発生する例示代謝物の評価の追加のプロトコルを提供します。詳しくは、セクション 1 は板の一般的な大規模な文化について説明します。セクション 2 はc. の elegansの大量の転送に焦点を当てて説明 3 は、大?...

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	<li>Fronius, M., Clauss, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-sensitivity+of+ENaC:+may+the+(shear)+force+be+with+you.">Mechano-sensitivity of ENaC: may the (shear) force be with you.</a> Pfl&#252;gers Archiv. 455 (5), 775-785 (2008).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Sohn, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+neurodegeneration+may+precede+microvascular+changes+characteristic+of+diabetic+retinopathy+in+diabetes+mellitus.">Retinal neurodegeneration may precede microvascular changes characteristic of diabetic retinopathy in diabetes mellitus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (19), E2655-E2664 (2016).</li><li>Chilelli, N. C., Burlina, S., Lapolla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AGEs,+rather+than+hyperglycemia,+are+responsible+for+microvascular+complications+in+diabetes:+a+&amp;#34;glycoxidation-centric&amp;#34;+point+of+view.">AGEs, rather than hyperglycemia, are responsible for microvascular complications in diabetes: a &amp;#34;glycoxidation-centric&amp;#34; point of view.</a> Nutrition, Metabolism &amp; Cardiovascular Diseases. 23 (10), 913-919 (2013).</li><li> Schlotterer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+as+model+for+the+study+of+high+glucose-+mediated+life+span+reduction.">C. elegans as model for the study of high glucose- mediated life span reduction.</a> Diabetes. 58 (11), 2450-2456 (2009).</li><li>Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Caenorhabditis+elegans+life+span+on+solid+media.">Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).</li><li>Leiers, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stress-responsive+glutathione+S-transferase+confers+resistance+to+oxidative+stress+in+Caenorhabditis+elegans.">A stress-responsive glutathione S-transferase confers resistance to oxidative stress in Caenorhabditis elegans.</a> Free Radical Biology and Medicine. 34 (11), 1405-1415 (2003).</li><li>Rabbani, N., Thornalley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+methylglyoxal+by+stable+isotopic+dilution+analysis+LC-MS/MS+with+corroborative+prediction+in+physiological+samples.">Measurement of methylglyoxal by stable isotopic dilution analysis LC-MS/MS with corroborative prediction in physiological samples.</a> Nature Protocols. 9 (8), 1969-1979 (2014).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 7 (72), 248-254 (1976).</li><li>Ahmed, N., Argirov, O. K., Minhas, H. S., Cordeiro, C. A., Thornalley, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+advanced+glycation+endproducts+(AGEs):+surveying+AGEs+by+chromatographic+assay+with+derivatization+by+6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate+and+application+to+Nepsilon-carboxymethyl-lysine-+and+Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified+albumin.">Assay of advanced glycation endproducts (AGEs): surveying AGEs by chromatographic assay with derivatization by 6-aminoquinolyl-N-hydroxysuccinimidyl-carbamate and application to Nepsilon-carboxymethyl-lysine- and Nepsilon-(1-carboxyethyl)lysine-modified albumin.</a> Biochemical Journal. 364 (Pt 1), 1-14 (2002).</li><li>Thornalley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+screening+of+advanced+glycation+endproducts+in+cellular+and+extracellular+proteins+by+tandem+mass+spectrometry.">Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry.</a> Biochemical Journal. 375 (Pt 3), 581-592 (2003).</li><li>Karachalias, N., Babaei-Jadidi, R., Ahmed, N., Thornalley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+fructosyllysine+and+advanced+glycation+end+products+in+the+kidney,+retina+and+peripheral+nerve+of+streptozotocin-induced+diabetic+rats.">Accumulation of fructosyllysine and advanced glycation end products in the kidney, retina and peripheral nerve of streptozotocin-induced diabetic rats.</a> Biochemical Society Transactions. 31, 1423-1425 (2003).</li><li>Morcos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glyoxalase-1+prevents+mitochondrial+protein+modification+and+enhances+lifespan+in+Caenorhabditis+elegans.">Glyoxalase-1 prevents mitochondrial protein modification and enhances lifespan in Caenorhabditis elegans.</a> Aging Cell. 7 (2), 260-269 (2008).</li><li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cer&#243;n, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Caenorhabditis+elegans+methods:+synchronization+and+observation.">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).</li><li>Lagido, C., McLaggan, D., Glover, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Screenable+In+Vivo+Assay+for+Mitochondrial+Modulators+Using+Transgenic+Bioluminescent+Caenorhabditis+elegans.">A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53083 (2015).</li><li>Takamiya, S., Mita, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+purification+of+active+liquid-cultured+Caenorhabditis+elegans+using+a+modified+Baermann+apparatus.">Large-scale purification of active liquid-cultured Caenorhabditis elegans using a modified Baermann apparatus.</a> Parasitology International. 65 (5 Pt B), 580-583 (2016).</li><li>Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+systems+for+high-throughput+and+high-content+screening+using+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Microfluidic systems for high-throughput and high-content screening using the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 17 (22), 3736-3759 (2017).</li><li>Zhu, G., Yin, F., Wang, L., Wei, W., Jiang, L., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+type+2+diabetes-like+hyperglycemia+in+C.+elegans+on+a+microdevice.">Modeling type 2 diabetes-like hyperglycemia in C. elegans on a microdevice.</a> Integrative Biology. 8 (1), 30-38 (2016).</li></ol>

このプロトコルは、定量的な結果を得るためのc. の elegansの大規模養殖のための信頼性の高い方法を示します。文献からの知見は、代表の結果に示すように、レプリケート可能性があります。にもかかわらず、 c. の elegansの大規模なサンプルのコレクションのこのプロトコルはストレート フォワード法のように思える、考慮する点があります。線虫密度の同期に関?...

西部のしみや質量分析法などのタンパク質解析タンパク質のミリグラムが必要です。この収量の線虫、洗濯によって液体培養または線虫を転送する固体メディア上を達成することができます何百もの大規模な養殖が必要です。流体とせん断応力は、ナトリウム、線虫の寿命を変えることと代謝解析1 に影響を与える可能性があるの増加の取り込みによる浸透圧ストレスを高めることができる上皮性ナトリウム チャネル (ENaC) の発現を誘導します。.したがって、プレート ベースのアプローチのこのプロトコルのいくつかの重要なステップは、アカウントに実験的変動に影響を与えるストレスの軽減を取る。液体培養は、他の一方で、線虫の表現型に影響を与えるし、文化と線虫2の正確な数のコレクションが複雑になります。さらに、反応生成物は、メディア コンポーネントによって変更することができ、線虫に達する前に均等に分散可能性があります。液体文化の制限については、このプロトコルはc. の elegansの大規模なサンプルを培養する方法を提供します。
線虫は 302 の神経細胞の異なるネットワークのモデル生物すべてのセル3の 3 分の 1 を構成します。多くの相同科学への導入以来オーソログ遺伝子の説明、医学研究のためのモデルとしてその値を増幅されています。最近では、糖尿病性網膜症、血管の損傷の前の神経学的な減損の証拠は4を提示されています。線虫は血管が欠けているが、血管のものから離れて神経の変化を調査するための適切なモデルを作るそれ異なる神経ネットワークが含まれています。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。糖尿病合併症の生化学的変化は、さらに高血糖5に応えて ROS の生成に及ぼす年齢の形成を含みます。年齢は線虫で発見され、神経損傷6に貢献。慢性疾患は、糖尿病合併症の評価をここで例示としてしばしば、メカニズムの評価のための多重アプローチを必要とする複雑なポリジーンのプロセスによって引き起こされます。このプロトコルは、だけでなく、その後複数のパラメーターを同時に、取得のための使用することができます。増加の比較と多重手法の再現性は、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで実現できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E. coli OP50</td>
			<td>CGC</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans N2</td>
			<td>CGC</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C. elegans CL2166</td>
			<td>CGC</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, 60 x 15 mm</td>
			<td>Greiner One</td>
			<td>628161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric pipet, glas, 10 mL</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>E-0413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>04693124001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-denaturing lysate buffer:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl, pH 8</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodiumchloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E5391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plates, transparent bottom</td>
			<td>Brand</td>
			<td>781611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infinite M200, plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>30017581</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zirconium Oxide Beads, 0.5 mm</td>
			<td>Next advance</td>
			<td>ZROB05-RNA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender, homogenizer</td>
			<td>Next advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pepsin from porcine gastric mucosa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thymol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T0501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E/ Protease from Streptomyces griseus </td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P43339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolidase from Porcine Kidney</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aminopeptidase from Aeromonas proteolytica</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>Merckmillipore</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Materials for plate culture are described in Reference 6.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

plate-based large-scale cultivation of caenorhabditis elegans: sample preparation for the study of metabolic alterations in diabetes

線虫(C. elegans) を寒天に大規模な方法で養殖は時間がかかり、困難にすることができます。このプロトコルでは、西部のしみ、質量分析法、またはさらにプロテオミクス解析を続行する蛋白質の分離のための動物の大規模な番号を取得する簡単で安価な方法について説明します。さらに、immunostainings の線虫の数の増加と同じ培養条件下で複数の解析の統合容易に達成します。さらに、異なる実験条件とプレート間の移動が促進されます。平板培養における一般的な技法白金線を使用して 1 つのc. の elegansの転送と住まれた寒天の転送チャンク メスします。ただし、線虫数増加に伴い、これらの技術に過度に時間がかかる。このプロトコルはc. の elegans多数の手順を含むワームの生理学的試料の影響を最小限に抑えるための大規模な文化をについて説明します。流体および剪断応力の寿命や線虫、こうして信頼性と再現性のある結果を取得するために重要な手順の詳細な説明を必要とする代謝過程を変更できます。線虫は最大 1/3 の神経細胞から成るが血管に欠けている、従って神経変化のみ血管制御の独立を検討する可能性を提供するモデル生物であります。最近では、早期の神経変性糖尿病網膜症は血管病変の前に発見されました。したがって、 c. の elegansは糖尿病合併症の一般的なメカニズムを研究するための特別な関心です。たとえばの高められた形成高度糖化最終製品 (年齢)、線虫に見られる再現性をもって、活性酸素種 (ROS) を観察しました。調査のより広いスペクトルのための適切なサイズのサンプルを処理するプロトコルは、糖尿病による生化学的変化の研究に代表されるここで、掲載されています。一般に、このプロトコルは大規模な線虫を必要とする研究に有用することができます番号とどの液体培養は適していません。

ここで大規模な線虫の作成例文化の糖尿病研究のアプリケーションに渡されます。総蛋白濃度を正常化するのではなく、パラメーターを 1 つの動物に関連する関心のことです。線虫の数が少ないを必要とする試金、これ簡単に達成できます、線虫をカウントすることによって。大規模な線虫の実験グループごと線虫の数百人を文化、この方法は便利です?...

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Plate-based Large-scale Cultivation of Caenorhabditis elegans: Sample Preparation for the Study of Metabolic Alterations in Diabetes

このプロトコルは固体媒体で線虫の大規模栽培の方法をについて説明します。液体培養する代わりに、このプロトコルは、栽培プレート ベースの異なるスケールのパラメーターを取得できます。これは、液体と固体のメディア文化の形態と代謝の違いを省略することで結果の比較可能性を向上します。

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