Name: decellularization of whole human heart inside a pressurized pouch in an inverted orientation
Uploaded: 2018-11-26T13:30:00
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Diese Forschung wurde von der Houston Endowment-Zuschuss und die Texas Emerging Technology Fund unterstützt. Die Autoren erkennen die Orgel Beschaffungsbehörde LifeGift, Inc. und der Spenderfamilien dafür, dass diese Studie ermöglicht.

Alle Experimente eingehalten, die Ethik-Ausschuss Leitlinien aus Texas Heart Institute.
1. Orgel-Vorbereitung
Hinweis: In Zusammenarbeit mit LifeGift, einer Non-Profit-Organbeschaffungsorganisation in Texas (http://www.lifegift.org), spendete die Herzen der Menschen nicht geeignet für Transplantation waren für die Forschung mit zugelassenen Zustimmung verwendet.
<ol><li>Um Herzen zu beschaffen, die intravenös Infusion 30.000 U Heparin in die Herzen. Sicher Naht...

<ol>
	<li>Writing Group Members. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary:+Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2016+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).</li><li>Zia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearts+beating+through+decellularized+scaffolds:+whole-organ+engineering+for+cardiac+regeneration+and+transplantation.">Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).</li><li>Zimmermann, W. 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Nach unserer Kenntnis ist dies die erste Studie, Bericht invertiert Decellularization menschlicher Herzen in einem unter Druck stehenden Beutel mit Zeitraffer Überwachung der Flow-Rate und Zelle Schmutzentfernung. Der Perikard-wie Beutel hält die Ausrichtung des Herzens stabil während des Decellularization-Verfahrens. Eintauchen und invertieren von ganzen Herzen in einem Beutel verhindert Austrocknung und minimiert die übermäßige Belastung der Aorta (von Herzen Gewicht) als im Vergleich zu den herkömmlichen aufrec...

Herzinsuffizienz führt zu hoher Sterblichkeit bei Patienten. Die ultimative Behandlungsoption für terminaler Herzinsuffizienz ist allo-Transplantation. Jedoch gibt es eine lange Warteliste für eine Transplantation aufgrund des Mangels an Spenderorganen und Patienten Gesicht nach Transplantation Hürden, die von lebenslange Immunsuppression zu chronischen Orgel Ablehnung1,2reichen. Bioengineering funktionale Hearts von Wiederbevölkerung decellularized menschlicher Herzen mit einer patienteneigenen Zellen könnten diese Hürden3zu umgehen.
Ein wichtiger Schritt in der "Technik" ein Herz ist die Schaffung ein Gerüst mit geeigneten Gefäß- und parenchymatösen Struktur, Zusammensetzung und Funktion um die Ausrichtung zu führen und Organisation von gelieferten Zellen. Im Beisein der geeignete Rahmen sollte Zellen ausgesät auf dem Schafott die Umwelt zu erkennen und erfüllen die erwartete Funktion als Teil dieses Organs. Unserer Meinung nach umfasst decellularized Orgel extrazelluläre Matrix (dECM) die notwendigen Merkmale das ideale Gerüst.
Durch die Verwendung von intrinsischen Gefäßsystem, kann komplexe ganze-Orgel Decellularization durch Antegrade oder retrograde Perfusion4 zelluläre Komponenten zu entfernen, unter Beibehaltung der zarten 3D extrazelluläre Matrix und Gefäßsystem2erreicht werden, 5,6,7. Eine funktionale Gefäßsystem ist in Bioengineering ganze Organe nur wichtig, wie in Vivo, Nährstoffverteilung und Abfallentsorgung8. Koronaren Perfusion Decellularization nachweislich wirksam bei der Schaffung von decellularized Herzen von Ratten4oder Schweine4,7,9,10,11 ,12,13, und Menschen5,7,14,15,16. Jedoch kann die Integrität der Ventile, Atrien und anderen "dünnen" Regionen leiden.
Menschliche Größe decellularized Herzen Gerüste erhalten Sie von Schweinen mit Druck Kontrolle7,9,10,11,12 oder Infusion Flow Rate Control13, 17 und5,7,14,15von menschlichen Spendern mit Druck zu kontrollieren. Decellularization der menschlichen Spender Herzen erfolgt über 4-8 Tage unter Druck auf 80-100 MmHg in aufrechter Orientierung5,15,16 oder über 16 Tage unter Druck gesteuert um 60 MmHg14 gesteuert . Unter Antegrade, druckgesteuerten Decellularization spielt die Aortenklappe Kompetenz eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der koronaren Perfusion Effizienz und stabile Druck an die Aortenwurzel. Unsere bisherige Arbeit ergab, dass die Ausrichtung des Herzens die koronaren Perfusion Effizienz während des Decellularization-Verfahrens und damit das Gerüst Integrität im Ende9beeinflusst.
Als Fortsetzung von unserer bisherigen Arbeit9stellen wir ein neuartiges Konzept, wobei ein Herzbeutel-wie Beutel hinzugefügt wird, um vollem Herzen Decellularization zu verbessern. Wir beschreiben die Decellularization menschlicher Herzen platziert in unter Druck stehenden Beutel, umgekehrt orientiert, und unter Druck auf 120 MmHg auf die Aortenwurzel gesteuert. Dieses Protokoll umfasst die Überwachung der Strömungsprofil und Sammlung von Abfluss Medien während des Decellularization-Verfahrens, koronaren Perfusion Effizienz und Schmutzentfernung Zelle zu bewerten. Biochemische Tests werden dann durchgeführt, um die Wirksamkeit der Methode zu testen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA85H</td>
			<td>Suture used to ligate superior and inferior vena cava</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; x 3/8&#34; connector with luer</td>
			<td>NovoSci</td>
			<td>332023-000</td>
			<td>Connect aorta and pulmonary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing to connect heart chambers/veins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion and outflow line</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>MX452FL</td>
			<td>For flowing solutions through the vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>01-812-17</td>
			<td>Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapware Square-Grip Canister</td>
			<td>Snapware</td>
			<td>1022</td>
			<td>1-liter Container used for perfusing heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black rubber stoppers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59586-162</td>
			<td>To seal the perfusion container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>881003</td>
			<td>To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L aspirator bottle with bottom sidearm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-532</td>
			<td>For holding solutions/perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td>For quantifying dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf thymus standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4522</td>
			<td>DNA standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit</td>
			<td>Biocolor Ltd</td>
			<td>Blyscan #B1000</td>
			<td>GAG assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 Pro</td>
			<td>For analytical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE fluoroscopy</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>OEC 9900 Elite</td>
			<td>Angiogram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visipaque</td>
			<td>GE</td>
			<td>13233575</td>
			<td>Contrast agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of whole human heart inside a pressurized pouch in an inverted orientation

Die ultimative Lösung für Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz ist Organtransplantation. Aber Spender Herzen sind begrenzt, Immunsuppression erforderlich ist und letztendlich Ablehnung auftreten kann. Erstellen einer funktionalen, könnte autologes Bio-künstliches Herz diese Herausforderungen lösen. Biofabrication eines Herzens bestehend aus Gerüst und Zellen ist eine Option. Eine natürliche Gerüst mit gewebespezifischen Zusammensetzung sowie Mikro- und Makro-Architektur erhalten Sie von einem Herzen von Menschen oder große Tiere wie Schweine. Decellularization beinhaltet Zelltrümmer und gleichzeitig 3D extrazellulären Matrix und Gefäßsystem und damit "Cellularization" auf einen späteren Timepoint auswaschen. Aufbauend auf unseren Roman zu finden, dass Perfusion Decellularization komplexe Organe ist möglich, entwickelten wir eine weitere "physiologisch" Methode, um nicht transplantable Menschenherzen zu decellularize, indem man sie in einem unter Druck stehenden Beutel in einem umgekehrten Orientierung unter kontrollierter Druck. Der Zweck der Verwendung eines unter Druck stehenden Beutels ist die Schaffung Druckgradienten über die Aortenklappe geschlossen halten und Verbesserung der myokardialen Perfusion. Gleichzeitige Beurteilung der Strömungsdynamik und Zelltrümmer Entfernung bei Decellularization erlaubt uns, sowohl Flüssigkeit und Schmutz Abfluss zu überwachen, damit erzeugen ein Gerüst, das sein kann entweder für einfache kardiale Reparatur verwendet (z.B. als Pflaster oder Ventil-Gerüst) oder als Ganzes-Orgel Gerüst.

Nach einer 7-Tage-Decellularization mit Antegrade aortalen Perfusion unter dem ständigen Druck von 120 MmHg wandte sich das menschliche Herz transluzente (Abb. 6 b). Das Herz war grob in 19 Sektionen für biochemische (DNA, Knebel und SDS) Analyse (Abbildung 6), um das Endprodukt decellularized bewerten seziert.
Während des Decellularization Prozesses war Fluss Infusi...

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Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Diese Methode ermöglicht Decellularization ein komplexes solide Organ mit einem einfachen Protokoll basierend auf osmotischen Schock und Durchblutung des Ionischen Waschmittel mit minimalen Orgel Matrix Störung. Es verfügt über eine neuartige Decellularization-Technik für die Herzen der Menschen in einem unter Druck stehenden Beutel mit Echtzeit-Überwachung der Strömung Dynamik und zellulären Schutt Abfluss.

Decellularization des ganzen menschlichen Herz in einem unter Druck stehenden Beutel in eine umgekehrte Orientierung

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Erzeugung von vaskularisierten Gerüsten zu beantworten, die wirklich der Heilige Gral des Tissue-Engineering-Bereichs sind. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass ein Druckbeutel in umgekehrter Ausrichtung die Dezellularisierung nicht transplantierbarer menschlicher Organe verbessert und uns dies in einer sterilen Weise über einen angemessenen Zeitrahmen tun lässt. Um das Herz auf die Dezellularisierung vorzubereiten, führen Sie zunächst eine interne Inspektion auf mögliche Defekte durch.Wenn ein Septaldefekt vorliegt, korrigieren Sie den Mangel mit den entsprechenden Nähten. Als nächstes ligate die überlegenen und unterlegenen Venenhöhlen mit 2:0 Seidennaht. Die rechte Atriumwand mit 5-0 PROLENE bedecken und die Aorta für die anschließende Kanulation von der Hauptpulmonalarterie absezieren.Setzen Sie die Verbinder entsprechend dem Durchmesser des Gefäßes in die Aorta und die Lungenarterie ein und sichern Sie die Verbinder mit 2-0 Seidennähten. Mit einer der Lungenvenenöffnungen legen Sie eine Schlauchlinie durch das linke Atrium in Richtung des linken Ventrikels ein und verbinden Sie eine Infusionsleitung mit dem Stecker in der Aorta und eine Abflussleitung mit dem Verbinder in der Lungenarterie. Legen Sie das vorbereitete Herz in der umgekehrten Ausrichtung in einen Polyesterbeutel und legen Sie den Beutel in einen Perfusionsbehälter.Verbinden Sie jede der Leitungen mit den entsprechenden Anschlüssen im Gummistopfen, je nach Behälterdurchmesser, und stecken Sie den Stopfen in den Deckel des Perfusionsbehälters, um den Polyesterbeutel zu versiegeln. Dann durchdringen PBS über den Infusionsanschluss des Gummistopfens, um den Abfluss aus der Lungenarterie und aus der linie, die in die linke Herzkammer eingeführt wird, zu überprüfen, indem Sie diesen Fluss verwenden, um das Organ von allen verbleibenden Blutspuren innerhalb der Gefäße zu reinigen. Wenn das Herz fertig ist, legen Sie den montierten Bioreaktor in eine aufrechte Ausrichtung und verbinden Sie die Infusionsleitung, die Druckkopflinie, die Pulmonale-Abflussleitung und die Bioreaktor-Abflussleitung mit den Gummikappen-Oberflächenöffnungen auf der Oberseite des Perfusionsbioreaktors.Dann dezellularisieren Sie das Herz für vier Stunden mit hypertonischer Lösung, zwei Stunden mit hypotonischer Lösung, 120 Stunden mit Natriumdodecylsulfat oder SDS, und eine endende Wäsche mit 120 Litern PBS, alle unter konstantem 120 Millimeter Quecksilberdruck, gemessen an der Aortenwurzel. Während der letzten 10 Liter der PBS-Waschanlage 500 Milliliter sterile 2,1%Peressigsäurelösung mit 10 normalen Natriumhydroxid neutralisiert in die Perfusionslösung, um das Gerüst zu sterilisieren. Typischerweise nimmt die Durchflussrate in die Aorta während des Dezellularisierungsprozesses allmählich ab, wenn sich die Perfusionslösung von hypertonisch zu hypotonisch ändert.Im Gegensatz dazu steigt der Durchfluss, wenn die Perfusionslösung von einer hypotonischen Lösung auf SDS umgestellt wird, wozu die Infusionsrate Schwankungen zeigt. Die Abflussrate aus der Lungenarterie zeigt einen ähnlichen Trend mit den hyper- und hypotonischen Lösungen. Die Abflussrate während der SDS-Perfusion weist jedoch einen Gesamtrückgang auf.Die koronare Perfusionseffizienz nimmt im Laufe der Zeit ebenfalls ab, da die verschiedenen Reagenzien durch die Gefäße durchdrungen werden. Da der Abfluss perfusate aus der Lungenarterie und der linken Herzkammer gleichzeitig gesammelt werden, kann ihr Schmutzgehalt durch Spektroskopie verglichen werden. Die Trübung der Abwässer aus beiden Gefäßen nimmt im Laufe der Zeit während der Perfusionen ab, obwohl die Trübung der Lungenarterie eine abruptere Farbänderung aufweist als die, die während der ersten Perfusionsperiode vom linken Ventrikel beobachtet wurde.Die Auswertung der Korrelation zwischen der Abflusstrübung und den Zellablagerungen durch einen Bicinchoninsäure-Protein-Assay aus sechs dezellularisierten menschlichen Herzen zeigt eine lineare Korrelation zwischen der Proteinkonzentration und der Trübung der Abwässer. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Durchflussrate zu überwachen und die Perfusate regelmäßig zu sammeln, um den Perfusionsprozess tatsächlich zu überwachen. Nach diesem Verfahren können andere Techniken wie mechanische Auswertung oder Sterilitätstests verwendet werden, um die Genauigkeit des Gerüsts und seine mögliche Verwendung für die Rezellularisierung zu bewerten, um ein funktionelles Herzgewebe zu erzeugen.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher im Bereich der regenerativen Medizin und Tissue-Engineering, um die Erzeugung ganzer vaskularisierter Organe zu erforschen und das Feld der Festorgantransplantation buchstäblich zu verändern. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Organen und Geweben und Chemikalien wie SDS extrem gefährlich sein kann und bei diesem Verfahren immer geeignete persönliche Schutzausrüstungen tragen kann.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Dezellularisierung und Recellularization von Whole Livers

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Forschung

Biotechnik

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametrische Optical Mapping der Langendorff-perfundierten Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optische Mapping von Aktionspotentialen und Calcium Transienten in der Maus Herz

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Verfahren für Dezellularisierung der Porcine Heart von Retrograde Coronary Perfusion

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

Ein Dezellularisierung Methodik für die Herstellung von Naturdarm Azelluläre Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Eine injizierbare and Drug belasteten supramolekulares Hydrogel für Lokale Catheter Injection in die Pig Herz

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Verfahren für Dezellularisierung von Rattenlebern in einer oszillierenden Druck Perfusionsvorrichtung

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization und Recellularization Methoden für menschliche Saphenous Adern

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Isolation und Decellularization eine ganze Schweine Pankreas

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...