Name: decellularization of whole human heart inside a pressurized pouch in an inverted orientation
Uploaded: 2018-11-26T13:30:00
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この研究は、ヒューストン基金助成金とテキサスの新興技術基金によって支持されました。著者認める臓器調達機関株式会社 LifeGift、この研究を可能にするためドナーの家族。

すべての実験は、テキサス心臓研究所から倫理委員会ガイドラインに従います。
1. 臓器準備
注: 寄付の LifeGift、テキサス州 (http://www.lifegift.org) の非営利臓器調達機関連携人間の心移植には適していない研究承認の同意を得て使用されました。
<ol><li>心を調達するには、心に 30,000 の U ヘパリン静脈内注入します。安全にカニュラ大動脈にカニューレ...

<ol>
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私たちの知る限り、これはフロー率および細胞残骸の取り外しの時間経過モニタリングと加圧のポーチの中の人間の心の反転レポート decellularization に最初の研究です。心膜のようなポーチは、decellularization プロシージャ全体で安定した心の向きを保持します。水没しポーチの中の全体の心を反転脱水を防ぐことができ、とき (心重量) から大動脈に過大な負担を最小限に抑える、従来直立蛍?...

心不全は、患者の高い死亡率に します。末期心不全の究極の治療法の選択肢は、同種移植です。ただし、移植ドナー臓器不足のため長い待ちリストがある、患者の顔移植後慢性臓器拒絶反応1,2生涯免疫抑制からその範囲のハードルします。患者さん自身で脱人間サイズ心の再作成によって生体機能心細胞がこれらのハードル3を回避できます。
主要なステップ「エンジニア リング」で心が適切な血管および実質の構造、構成および配置をガイドするには関数と足場の作成と配信の細胞の組織。適切な枠組みの存在下で足場に播種された細胞環境を認識し、その臓器の一部として予想される関数を実行します。我々 の意見では、脱臓器細胞外マトリックス (dECM) には理想的な足場の必要な特性が装備されています。
本質的な血管を活用し、複雑な全体器官 decellularization 達成できる順行または逆行性灌流4繊細な 3 D 細胞外マトリックスと血管2、維持しながら携帯電話のコンポーネントを削除するには 5,6,7。それは生体内で、養分分布と廃棄物の除去8の機能血管系バイオ エンジニア リング全臓器だけで重要です。Decellularization 冠動脈灌流ラット4、または豚4,7,9,10,11 から脱心の作成に効果を発揮する実証されています ,12,13, と人間5,7,14,,1516。まだ、バルブ、心房および他の「薄い」地域の整合性は苦しむことができます。
人間サイズ脱心臓の足場豚圧力制御7,9,10、11,12または注入流れ率コントロール13,を使用して得られる17および圧力を使用して人間のドナーから5,7,14,15を制御します。人間のドナー心の decellularization 発生する縦方向5,,1516または 60 mmHg14で制御圧力の下で 16 日間で 80-100 mmHg で制御圧力の下で 4-8 日間.順行、圧力制御 decellularization の下では、大動脈弁能力は、冠灌流効率と大動脈のルートで安定した圧力を維持する上で重要な役割を果たしています。我々 の以前の仕事では、decellularization プロシージャしたがって最後9の足場の整合性の中に心の向きが、冠灌流効率の影響を及ぼすことを明らかにしました。
私たちの以前の仕事9の続きは、として全体心 decellularization を改善するために膜のようなポーチを追加する前記斬新なコンセプトを紹介します。加圧袋は、反比例指向の内部と大動脈のルートで 120 mmHg で制御圧力の下で人間の心の decellularization について述べる.このプロトコルには監視フロー プロファイルと冠灌流効率と細胞の破片の除去を評価する decellularization プロシージャ全体の流出媒体のコレクションが含まれます。生化学的アッセイは、手法の有効性をテストするのには、実行されます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA85H</td>
			<td>Suture used to ligate superior and inferior vena cava</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; x 3/8&#34; connector with luer</td>
			<td>NovoSci</td>
			<td>332023-000</td>
			<td>Connect aorta and pulmonary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing to connect heart chambers/veins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion and outflow line</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>MX452FL</td>
			<td>For flowing solutions through the vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>01-812-17</td>
			<td>Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapware Square-Grip Canister</td>
			<td>Snapware</td>
			<td>1022</td>
			<td>1-liter Container used for perfusing heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black rubber stoppers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59586-162</td>
			<td>To seal the perfusion container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>881003</td>
			<td>To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L aspirator bottle with bottom sidearm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-532</td>
			<td>For holding solutions/perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td>For quantifying dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf thymus standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4522</td>
			<td>DNA standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit</td>
			<td>Biocolor Ltd</td>
			<td>Blyscan #B1000</td>
			<td>GAG assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 Pro</td>
			<td>For analytical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE fluoroscopy</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>OEC 9900 Elite</td>
			<td>Angiogram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visipaque</td>
			<td>GE</td>
			<td>13233575</td>
			<td>Contrast agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of whole human heart inside a pressurized pouch in an inverted orientation

末期心不全患者のための究極のソリューションは、臓器移植です。しかし、ドナー心は限られて、免疫抑制は必須であり最終的に拒絶反応が発生することが。機能を作成して、自家バイオ人工心臓は、これらの課題を解決できます。足場と細胞から成る心臓の立体組織自動製造は 1 つのオプションです。マイクロおよびマクロ アーキテクチャと同様に、組織固有の構成と自然な足場は、人間や豚などの大型動物から decellularizing 心によって取得できます。Decellularization は、3 D の細胞外マトリックスと血管系を維持すると、後で timepoint で「cellularization」を許可する細胞の残骸洗浄を含みます。複雑な器官の血流 decellularization を見つける私たちの小説を生かすことが可能、内部加圧ポーチ、逆にそれらを配置することによって非可移植性の人間の心を decellularize により「生理」手法を開発しました。制御圧力下での配向。加圧ポーチを使用する目的は、閉めたままにしておくと心筋灌流を改善する大動脈弁に圧力勾配を作成します。流動ダイナミクスと流体の流入と流出の破片の両方を監視することができました decellularization 中細胞の残骸除去の同時評価は単純な心臓の修復のいずれかを使用ことができる足場を生成するため (例えばパッチとしてまたはバルブ足場) または全体器官足場として。

120 mmHg の一定の圧力下で順行大動脈送血法を 7 日間 decellularization 後、は、人間の心は、半透明 (図 6 b) をなった。心は、生化学 (DNA、ギャグおよび SDS) 分析最終 decellularized 製品を評価する (図 6) のための 19 のセクションに肉眼的解剖されました。
Decellularization プロセス全体に?...

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Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

このメソッドにより、高浸透圧刺激とイオン洗剤最小限オルガン マトリックス破壊の灌流に基づく単純なプロトコルを使用して複雑な固体器官の decellularization です。流れのダイナミクスと細胞残骸の流出のリアルタイム モニタ リングと加圧のポーチの中の人間の心の新しい decellularization 技術が装備されています。

逆方向に加圧ポーチ内全体の人間の心の decellularization

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

この方法は、実際に組織工学分野の聖杯である血管化足場の生成に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、逆向きの加圧パウチが非移植可能なヒト器官の脱細胞化を改善し、適切な時間枠にわたって無菌の方法でそれを行うことができるということです。脱細胞化のために心臓を準備するために、まず、可能な欠陥のための内部検査を行う。中隔欠陥が存在する場合は、適切な縫合線で欠陥を修正します。次に、2-0シルク縫合糸で上手と下の大静脈をリゲートします。5-0 PROLENEで右心房壁を縫合し、その後のカヌリンのために大動脈を主肺動脈から離れて解剖する。大動脈と肺動脈に、血管の直径に応じてコネクタを挿入し、2-0シルク縫合糸でコネクタを固定します。肺静脈オリフィスの1つを使用して、左心室に向かって左心房を通してチューブラインを挿入し、大動脈のコネクタと肺動脈のコネクタに流出線を注入ラインを接続します。作った心臓を逆向きのポリエステルポーチに入れ、パウチを灌流容器に入れます。ゴム栓の各ポートに各ラインを接続し、容器の直径に応じて、ポリエステルポーチを密封するために、灌流容器の蓋にストッパーを挿入します。次に、ゴム栓の注入口を介してPBSをパーフュージョンし、肺動脈からの流出を検証し、左心室に挿入されたラインから、この流れを使用して血管構造内の血液の残りの痕跡の器官をきれいにする。心臓の準備ができたら、組み立てられたバイオリアクターを直立方向に配置し、注入ライン、圧力ヘッドライン、肺動脈流出ライン、およびバイオリアクタードレインラインを灌流バイオリアクターの上にあるゴムキャップ表面ポートに接続します。次いで、高張液で4時間、低張性溶液で2時間、ドデシル硫酸ナトリウム、またはSDSで120時間、PBSの120リットルで最終洗浄し、すべて大動脈根で測定された水銀圧力の一定の120ミリメートルの下で、心臓を脱周細胞化する。PBS洗浄の最後の10リットルの間に、スキャフォールドを殺菌するために、10の通常の水酸化ナトリウムで中和された滅菌2.1%過酢酸溶液の500ミリリットルを加える。典型的には、輸液が高張性から低張薬に変化するにつれて、脱細胞化プロセス中の大オルタへの流量は徐々に低下する。対照的に、灌流溶液が低張性溶液からSDSに変化すると流量が増加し、その時点で輸液流量が変動を示す。肺動脈からの流出率は、超低調溶液と同様の傾向を示す。しかし、SDS灌流時の流出速度は全体的に低下を示す。冠状動脈灌流効率は、異なる試薬が血管系を通して浸透するにつれて時間の経過とともに減少します。肺動脈と左心室からの流出パーフューズは同時に収集されるため、その破片含有量は分光法によって比較することができる。両方の血管からの排水の濁度は、灌流の間に時間の経過とともに減少するが、肺動脈からの濁度は、最初の灌流期間中に左心室から観察したものに比べてより急激な色変化を示す。6つの脱細胞化されたヒトの心臓からのビチンチオン酸タンパク質アッセイによる流出濁度と細胞デブリとの相関を評価すると、タンパク質濃度と流出濁度との間の線形相関が明らかとなる。この手順を試みる際には、流量を監視し、灌流プロセスを実際に監視するために定期的に透過液を収集することが重要です。この手順に従って、機械的評価や無菌性試験などの他の技術を使用して、足場の忠実度と、機能的な心臓組織を生成するための再細胞化のためのその潜在的な使用を評価することができます。その開発後、この技術は、再生医療および組織工学分野の研究者が血管化された臓器全体の生成を探求する道を開き、文字通り固体臓器移植分野を変えました。人間の臓器や組織、SDSなどの化学物質を扱うと非常に危険であり、この手順を実行する際には常に適切な個人保護装置を着用することを忘れないでください。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

全肝臓の細胞化とRecellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓のMultiparametric光学マッピング

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

マウスの心臓の活動電位およびカルシウムトランジェントの光学的マッピング

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

逆行性冠灌流によってブタ心臓の脱細胞化するための手順

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

ナチュラル無細胞腸基質の産生のための脱細胞化の方法論

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

豚の心臓にローカルカテーテルを注入するための注射や薬物を装填した超分子ヒドロゲル

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

振動圧力潅流装置内のラット肝臓の脱細胞化のための手順

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization とひと伏在静脈の Recellularization 方法

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

ラットでの肝部分工学生体内での基盤として新しい手術手技

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

分離と全体ブタ膵臓の Decellularization

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...