Name: decellularization of whole human heart inside a pressurized pouch in an inverted orientation
Uploaded: 2018-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation at JoVE.com

이 연구는 휴스턴 기부 그랜트와 텍사스 신흥 기술 기금에 의해 지원 되었다. 저자 인정 기관 조달 기관 LifeGift, 주식 회사와 본이 연구 가능한 만들기 위한 기증자의 가족.

모든 실험에서 텍사스 심장 연구소 윤리 위원회 지침을 준수 됩니다.
1. 기관 준비
참고: 이식에 적합 하지 않은 LifeGift, 텍사스 (http://www.lifegift.org), 비영리 기관 조달 조직 기증 협력 인간의 마음에 승인 동의 연구를 위해 사용 되었다.
<ol><li>마음을 조달, 정 맥으로 마음을 30000 U 덤플링을 달 이다. 안전 하 게 대동맥 정 맥 cardioplegia 봉합 하 고 채워 관류 ?...

<ol>
	<li>Writing Group Members. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary:+Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2016+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).</li><li>Zia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearts+beating+through+decellularized+scaffolds:+whole-organ+engineering+for+cardiac+regeneration+and+transplantation.">Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).</li><li>Zimmermann, W. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularization+of+rat+liver:+An+in+vitro+model+for+assessing+human+drug+metabolism+and+liver+biology.">Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology.</a> PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).</li><li>Baghalishahi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+extracellular+matrix+hydrogel+together+with+or+without+inducer+cocktail+improves+human+adipose+tissue-derived+stem+cells+differentiation+into+cardiomyocyte-like+cells.">Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).</li><li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization.">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li><li>Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+cardiac+extracellular+matrix+hydrogels+for+cultivation+of+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).</li><li>Oberwallner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+scaffolds+by+decellularization+of+human+myocardium.">Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).</li></ol>

우리의 지식을 하려면이 보고서 거꾸로 decellularization 가압된 주머니 안에 인간 심 혼의 흐름 속도 세포 파편 제거의 시간 경과 모니터링에 첫 번째 연구 이다. 심장 모양의 주머니는 심장의 방향을 decellularization 절차에 걸쳐 안정 유지합니다. 잠수 하 고 주머니 안에 전체 마음 반전 탈수를 방지 하 고 때 (심장 무게)에서 대동맥에 과도 한 부담을 최소화는 종래의 직 립 Langendorff 관류 decellularization ?...

심장 마비 환자에서 높은 사망률에 지도 한다. 말기 심장 마비에 대 한 궁극적인 치료 옵션은 여 보세요-이식 합니다. 그러나, 공여 장기의 부족으로이 식 위한 긴 대기 목록 이며 환자 얼굴 후 이식 허들 만성 장기 거부1,2에 평생 면역 억제에 이르기까지 다양. 바이오 기능 마음 decellularized 인간 크기는 환자 자신의 마음을 다시 채우기로 셀3이러한 장애물 우회 수.
중요 한 단계 "공학"는 마음은 적절 한 혈관과 parenchymal 구조, 구성 및 맞춤 가이드 함수 비의 생성 및 전달된 세포의 조직. 적절 한 프레임 워크의 발판에 시드 셀 환경을 인식 하 고 그 장기의 일환으로 예상된 기능을 수행 해야 합니다. 우리의 의견에 decellularized 기관 기질 (dECM) 이상적인 발판의 필요한 특성을 함유 한다.
기본 맥 관 구조를 이용 하 여 복잡 한 전체 기관 decellularization antegrade 또는 퇴행 성 관류4 섬세 한 3D 기질 및 맥 관 구조2, 유지 하면서 세포 구성 요소 제거를 통해 달성 될 수 있다 5,,67. Vivo에서, 영양소 분배 및 폐기물 제거8기능 맥 관 구조 공학 전체 기관 다만에서 중요 하다. 관상 동맥 관류 decellularization 쥐4, 또는 돼지4,7,,910,11 decellularized 마음 만들기에 효과적인 것으로 입증 되었습니다. ,,1213및 인간5,7,14,,1516. 그러나, 밸브, 심 방 및 다른 "얇은" 영역 무결성은 겪을 수 있다.
인간 크기 decellularized 심장 건설 기계는 압력 제어7,9,10,,1112 또는 주입 흐름 속도 제어13, 를 사용 하 여 돼지에서 얻어질 수 있다 17 및 압력을 사용 하 여 인간 기증자에서 제어5,7,,1415. 수직 방향5,,1516 또는 60 mmHg14 에서 제어 하는 압력을 받고 16 일 이상 80-100 mmHg에서 제어 하는 압력을 받고 4-8 일 동안 발생 하는 인간 기증자 심 혼의 decellularization . Antegrade, 압력 제어 decellularization에서 대동맥 밸브 역량 관상 동맥 관류 효율성과 대동맥 루트에서 안정적인 압력 유지에 중요 한 역할을 하고있다. 우리의 이전 작품 심장의 방향을 따라서 끝9에서 비 계 무결성 decellularization 절차 동안 관상 동맥 관류 효율이 영향을 밝혔다.
우리의 이전 작품9의 계속으로 어떤 점에서 심장 모양의 주머니 전체 심장 decellularization 향상에 추가 됩니다 새로운 개념을 소개 합니다. 대동맥 루트에서 120 mmHg에서 제어 하는 압력을 받고 반대로 지향, 가압된 파우치 안에 배치 하는 인간 심 혼의 decellularization을 설명 합니다. 이 프로토콜 모니터링 흐름 프로필 및 decellularization 절차 관상 동맥 관류 효율성과 세포 파편 제거 평가를 통해 유출 미디어 컬렉션을 포함 합니다. 생 화 확 적인 분석 실험 방법의 효과 테스트 하려면 다음 수행 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA85H</td>
			<td>Suture used to ligate superior and inferior vena cava</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; x 3/8&#34; connector with luer</td>
			<td>NovoSci</td>
			<td>332023-000</td>
			<td>Connect aorta and pulmonary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing to connect heart chambers/veins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion and outflow line</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>MX452FL</td>
			<td>For flowing solutions through the vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>01-812-17</td>
			<td>Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapware Square-Grip Canister</td>
			<td>Snapware</td>
			<td>1022</td>
			<td>1-liter Container used for perfusing heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black rubber stoppers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59586-162</td>
			<td>To seal the perfusion container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>881003</td>
			<td>To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L aspirator bottle with bottom sidearm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-532</td>
			<td>For holding solutions/perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td>For quantifying dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf thymus standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4522</td>
			<td>DNA standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit</td>
			<td>Biocolor Ltd</td>
			<td>Blyscan #B1000</td>
			<td>GAG assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 Pro</td>
			<td>For analytical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE fluoroscopy</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>OEC 9900 Elite</td>
			<td>Angiogram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visipaque</td>
			<td>GE</td>
			<td>13233575</td>
			<td>Contrast agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of whole human heart inside a pressurized pouch in an inverted orientation

말기 심장 마비 환자에 대 한 궁극적인 해결책은 장기 이식 이다. 하지만 기증자 마음은 제한 하 고 면역 억제가 필요 하 고, 궁극적으로 거부 발생할 수 있습니다. 기능 만들기, 헌 바이오 인공 심장 이러한 과제를 해결할 수 있습니다. Biofabrication 비 계 및 셀의 구성 하는 심장의 한 옵션입니다. 마이크로 및 매크로 아키텍처 뿐 아니라 조직 특정 구성 자연 비 계는 인간이 나 돼지 등 큰 동물에서 decellularizing 마음에 의해 얻어질 수 있다. Decellularization 3 차원 기질 및 맥 관 구조를 보존 하 고 나중 timepoint에 "cellularization"를 허용 하는 동안 세포 파편에 밖으로 세척 하는 작업이 포함 됩니다. 복잡 한 장기의 관류 decellularization 그를 찾는 우리의 소설에 대문자로 하는 것이 가능, 우리 비 transplantable 인간 심 혼에서 거꾸로 가압된 주머니 안에 배치 하 여 decellularize를 더 "생리" 방법 개발 방향, 제어 압력 하. 가압된 주머니를 사용 하 여의 목적은 대동맥 밸브 폐쇄 그것을 유지 하 고 향상 심근 관류를 통해 압력 그래디언트를 만드는 것입니다. 동시 평가 흐름 역학 및 decellularization 유체 유입 및 파편 유출 모니터링 하는 동안 세포 파편 제거, 간단한 심장 수리를 위해 사용 함으로써 생성 될 수 있는 비 계 (예: 패치로 또는 비 계 밸브) 또는 전체 기관 비 계.

Antegrade 120 mmHg의 일정 한 압력 대동맥 관류와 7 일 decellularization, 후 인간의 마음 반투명 (그림 6B) 아닙니다. 마음은 조잡 한 생화학 (DNA, 개 그와 SDS) 분석 (그림 6 c) 최종 decellularized 제품 평가를 위한 19 섹션으로 해 부.
Decellularization 과정 전반에 걸쳐 다양 한 압력으로 다른 솔루션의 ...

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Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

이 메서드는 decellularization의 삼투성 충격 및 최소한의 기관 매트릭스 중단 이온 세제의 관류에 따라 간단한 프로토콜을 사용 하 여 복잡 한 단단한 기관 수 있습니다. 그것은 흐름 역학 및 세포질 파편 유출의 실시간 모니터링으로 가압된 주머니 안에 인간의 마음에 대 한 소설 decellularization 기법으로를 구성 됩니다.

거꾸로 방향 가압된 주머니 안에 전체 인간의 마음의 decellularization

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

이 방법은 실제로 조직 공학 분야의 성배인 혈관 비계 생성에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 반전된 방향으로 가압 된 주머니가 이식 할 수없는 인간의 장기의 탈세포화를 개선하고 적절한 시간 프레임에 걸쳐 멸균 방식으로 그렇게 할 수 있다는 것입니다. 세포 제거를 위해 심장을 준비하려면 먼저 가능한 결함에 대한 내부 검사를 수행하십시오.중격 결함이 있는 경우 적절한 봉합사로 결함을 수정합니다. 다음으로, 2-0 실크 봉합사로 우수하고 열등한 베나 카바를 장식합니다. 오른쪽 아트리움 벽을 5-0 PROLENE로 봉합하고, 후속 수통을 위해 주요 폐 동맥에서 대동맥을 해부합니다.선박의 직경에 따라 커넥터를 대동맥과 폐 동맥에 삽입하고 2-0 실크 봉합사로 커넥터를 고정합니다. 폐 정맥 오리피스 중 하나를 사용하여 왼쪽 심실을 통해 튜브 라인을 삽입하고 대동맥의 커넥터에 주입 라인을 연결하고 폐 동맥의 커넥터에 유출 선을 연결합니다. 준비된 심장을 반전 된 방향으로 폴리 에스테르 파우치에 넣고 파우치를 관류 용기에 넣습니다.용기의 직경에 따라 고무 스토퍼의 각 라인에 각각의 선을 연결하고, 폴리에스테르 파우치를 밀봉하기 위해 관류 용기의 뚜껑에 스토퍼를 삽입한다. 이어서, 고무 스토퍼의 주입 포트를 통해 PBS를 침투하여 폐 동맥에서 유출되는 것을 확인하고 왼쪽 심실에 삽입된 라인에서, 이 흐름을 이용하여 혈관 내의 혈액의 잔류 흔적의 장기를 청소한다. 심장이 준비되면 조립된 생물 반응기를 똑바로 방향으로 배치하고 주입 라인, 압력 헤드 라인, 폐 동맥 유출 라인 및 생물 반응기 배수 선을 관류 생물 반응기 위에 있는 고무 캡 표면 포트에 연결합니다.그런 다음, 고독용액으로 4시간 동안 심장을 탈세포화하고, 저혈압용액으로 2시간, 도데킬 황산나트륨120시간, PBS 120리터를 함유한 최종 세척, 대동맥 뿌리에서 측정되는 수은 압력120밀리미터 의 최종 세척을 한다. PBS 워시의 마지막 10리터 동안, 비계를 살균하기 위해 10개의 일반 수산화나트륨으로 중화된 멸균 2.1%의 멸균산 용액 500밀리리터를 첨가한다. 전형적으로, 세포제거 과정에서 대어로의 유량은 과혈용에서 저혈압으로 변함에 따라 점차 감소한다.대조적으로, 유류율은 포혈 용액이 저혈압 용액에서 SDS로 변경될 때 증가하며, 이 시점에서 주입 유량은 변동을 보여줍니다. 폐 동맥의 유출 속도는 하이퍼 및 저혈압 솔루션과 유사한 추세를 보여줍니다. 그러나, SDS 관류 중 유출속도는 전반적인 감소를 나타낸다.관상 동맥 관류 효율은 또한 다른 시약이 혈관을 통해 퍼짐으로 시간이 지남에 따라 감소합니다. 폐 동맥과 좌심실의 유출이 동시에 수집됨에 따라 분광기에 의해 파편 함량을 비교할 수 있습니다. 폐 동맥의 탁도는 초기 관류 기간 동안 좌심실에서 관찰된 것과 비교하여 더 갑작스러운 색 변화를 나타내지만, 두 혈관모두에서 유출물의 탁도는 관류 기간 동안 시간이 지남에 따라 감소한다.6개의 탈세포 인간 심혼에서 비신천산 단백질 분석에 의한 유출 탁도와 세포 파편 사이의 상관관계에 대한 평가는 단백질 농도와 유출 탁도 사이의 선형 상관관계를 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안 유량을 모니터링하고 회두 공정을 실제로 모니터링하기 위해 주기적으로 perfusate를 수집하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 기계적 평가 또는 불임 테스트와 같은 다른 기술을 사용하여 스캐폴드의 충실도 및 기능성 심장 조직을 생성하기 위한 재세포화에 대한 잠재적 사용을 평가할 수 있습니다.개발 후, 이 기술은 재생 의학 및 조직 공학 분야의 연구원들이 말 그대로 고체 장기 이식 분야를 변화시키는 전체 혈관 화 기관의 생성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. SDS와 같은 인간의 장기 및 조직 및 화학 물질과 함께 일하는 것은 매우 위험할 수 있으며 이 절차를 수행 할 때 항상 적절한 개인 보호 장비를 착용한다는 것을 잊지 마십시오.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

전체 간은의 Decellularization 및 Recellularization

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

연구

생체공학

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Langendorff - perfused 토끼 하트의 Multiparametric 광 매핑

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

마우스 중심에 액션 후보와 칼슘 과도의 광학 매핑

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

퇴행성 관상 재관류에 의한 돼지 심장의 Decellularization 절차

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

자연 무 세포 창자 매트릭스의 생산을위한 탈세 포화 방법론

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

돼지 심장에 현지 카테터 주입 용 주사 및 약물로드 초분자 히드로 겔

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

진동 압 관류 장치에서 쥐 간을의 탈세 포화 절차

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization 및 Recellularization 방법론을 인간의 Saphenous 정 맥에 대 한

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

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Vivo에서 부분 간 엔지니어링을에서 위한 쥐를 기초로 새로운 수술 기법

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

절연 및 전체 돼지 췌 장 Decellularization

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...