Name: decellularization of whole human heart inside a pressurized pouch in an inverted orientation
Uploaded: 2018-11-26T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation at JoVE.com

Denna forskning stöds av Houston Endowment bidraget och Texas framväxande teknik fonden. Författarna erkänner byråns orgel upphandling LifeGift, Inc. och givarens familjer för att göra denna studie möjlig.

Alla experiment följs etiska kommitténs riktlinjer från den Texas Heart Institute.
1. orgel förberedelse
Obs: I samarbete med LifeGift, en ideell organ upphandling organisation i Texas (http://www.lifegift.org), donerade mänskliga hjärtan inte lämpar sig för transplantation användes för forskning med godkända samtycke.
<ol><li>För att upphandla hjärtan, intravenöst ingjuta 30.000 U heparin hjärtan. Säkert sutur cardioplegia kanyl i aorta och bifoga...

<ol>
	<li>Writing Group Members. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Executive+Summary:+Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2016+Update:+A+Report+From+the+American+Heart+Association.">Executive Summary: Heart Disease and Stroke Statistics--2016 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 133 (4), 447-454 (2016).</li><li>Zia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hearts+beating+through+decellularized+scaffolds:+whole-organ+engineering+for+cardiac+regeneration+and+transplantation.">Hearts beating through decellularized scaffolds: whole-organ engineering for cardiac regeneration and transplantation.</a> Critical Reviews in Biotechnology. 36 (4), 705-715 (2016).</li><li>Zimmermann, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strip+and+Dress+the+Human+Heart.">Strip and Dress the Human Heart.</a> Circulation Research. 118 (1), 12-13 (2016).</li><li>Ott, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion-decellularized+matrix:+Using+nature's+platform+to+engineer+a+bioartificial+heart.">Perfusion-decellularized matrix: Using nature's platform to engineer a bioartificial heart.</a> Nature Medicine. 14 (2), 213-221 (2008).</li><li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acellular+human+heart+matrix:+A+critical+step+toward+whole+heart+grafts.">Acellular human heart matrix: A critical step toward whole heart grafts.</a> Biomaterials. 61, 279-289 (2015).</li><li>Peloso, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+achievements+and+future+perspectives+in+whole-organ+bioengineering.">Current achievements and future perspectives in whole-organ bioengineering.</a> Stem Cell Research &amp; Therapy. 6, 107 (2015).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+decellularization+of+whole+organs.">Perfusion decellularization of whole organs.</a> Nature Protocols. 9 (6), 1451-1468 (2014).</li><li>Momtahan, N., Sukavaneshvar, S., Roeder, B. L., Cook, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+and+Processes+to+Decellularize+and+Cellularize+Hearts+to+Generate+Functional+Organs+and+Reduce+the+Risk+of+Thrombosis.">Strategies and Processes to Decellularize and Cellularize Hearts to Generate Functional Organs and Reduce the Risk of Thrombosis.</a> Tissue Engineering Part B-Reviews. 21 (1), 115-132 (2015).</li><li>Lee, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+orientation+improves+decellularization+of+whole+porcine+hearts.">Inverted orientation improves decellularization of whole porcine hearts.</a> Acta Biomaterialia. , (2016).</li><li>Momtahan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+Pressure+Control+Improves+Whole+Porcine+Heart+Decellularization.">Automation of Pressure Control Improves Whole Porcine Heart Decellularization.</a> Tissue Eng Part C Methods. , (2015).</li><li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Evaluation+of+a+Perfusion+Decellularization+Porcine+Heart+Model+-+Generation+of+3-Dimensional+Myocardial+Neoscaffolds.">Development and Evaluation of a Perfusion Decellularization Porcine Heart Model - Generation of 3-Dimensional Myocardial Neoscaffolds.</a> Circulation Journal. 75 (4), 852-860 (2011).</li><li>Weymann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioartificial+heart:+A+human-sized+porcine+model--the+way+ahead.">Bioartificial heart: A human-sized porcine model--the way ahead.</a> PLoS One. 9 (11), e111591 (2014).</li><li>Remlinger, N. T., Wearden, P. D., Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+decellularization+of+porcine+heart+by+retrograde+coronary+perfusion.">Procedure for decellularization of porcine heart by retrograde coronary perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (70), e50059 (2012).</li><li>Guyette, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineering+Human+Myocardium+on+Native+Extracellular+Matrix.">Bioengineering Human Myocardium on Native Extracellular Matrix.</a> Circulation Research. 118 (1), 56-72 (2016).</li><li>Sanchez, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+from+acellular+human+heart+matrix.">Data from acellular human heart matrix.</a> Data Brief. 8, 211-219 (2016).</li><li>Garreta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+commitment+from+human+pluripotent+stem+cells:+Rapid+production+of+human+heart+grafts.">Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human heart grafts.</a> Biomaterials. 98, 64-78 (2016).</li><li>Wainwright, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Cardiac+Extracellular+Matrix+from+an+Intact+Porcine+Heart.">Preparation of Cardiac Extracellular Matrix from an Intact Porcine Heart.</a> Tissue Engineering Part C-Methods. 16 (3), 525-532 (2010).</li><li>Larson, A. M., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+characterization+of+sub-10-fs+pulses.">Ex vivo characterization of sub-10-fs pulses.</a> Optics Letters. 31 (11), 1681-1683 (2006).</li><li>Lee, P. F., Yeh, A. T., Bayless, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonlinear+optical+microscopy+reveals+invading+endothelial+cells+anisotropically+alter+three-dimensional+collagen+matrices.">Nonlinear optical microscopy reveals invading endothelial cells anisotropically alter three-dimensional collagen matrices.</a> Experimental Cell Research. 315 (3), 396-410 (2009).</li><li>Lee, P. F., Bai, Y., Smith, R. L., Bayless, K. J., Yeh, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenic+responses+are+enhanced+in+mechanically+and+microscopically+characterized,+microbial+transglutaminase+crosslinked+collagen+matrices+with+increased+stiffness.">Angiogenic responses are enhanced in mechanically and microscopically characterized, microbial transglutaminase crosslinked collagen matrices with increased stiffness.</a> Acta Biomaterialia. 9 (7), 7178-7190 (2013).</li><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research.">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li><li>Ramanathan, T., Skinner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coronary+blood+flow.">Coronary blood flow.</a> Continuing Education in Anaesthesia Critical Care &amp; Pain. 5 (2), 61-64 (2005).</li><li>Murthy, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Quantification+of+Myocardial+Blood+Flow+Using+PET:+Joint+Position+Paper+of+the+SNMMI+Cardiovascular+Council+and+the+ASNC.">Clinical Quantification of Myocardial Blood Flow Using PET: Joint Position Paper of the SNMMI Cardiovascular Council and the ASNC.</a> Journal of Nuclear Cardiology. 25 (1), 269-297 (2018).</li><li>Molina, D. K., DiMaio, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+organ+weights+in+men:+Part+I-the+heart.">Normal organ weights in men: Part I-the heart.</a> The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 33 (4), 362-367 (2012).</li><li>Molina, D. K., DiMaio, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+Organ+Weights+in+Women:+Part+I-The+Heart.">Normal Organ Weights in Women: Part I-The Heart.</a> The American Journal of Forensic Medicine and Pathology. 36 (3), 176-181 (2015).</li><li>Robertson, M. J., Dries-Devlin, J. L., Kren, S. M., Burchfield, J. S., Taylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+cellularization+of+whole+decellularized+heart+extracellular+matrix.">Optimizing cellularization of whole decellularized heart extracellular matrix.</a> PLoS One. 9 (2), e90406 (2014).</li><li>Robertson, M. J., Soibam, B., O'Leary, J. G., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellularization+of+rat+liver:+An+in+vitro+model+for+assessing+human+drug+metabolism+and+liver+biology.">Cellularization of rat liver: An in vitro model for assessing human drug metabolism and liver biology.</a> PLoS One. 13 (1), e0191892 (2018).</li><li>Baghalishahi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+extracellular+matrix+hydrogel+together+with+or+without+inducer+cocktail+improves+human+adipose+tissue-derived+stem+cells+differentiation+into+cardiomyocyte-like+cells.">Cardiac extracellular matrix hydrogel together with or without inducer cocktail improves human adipose tissue-derived stem cells differentiation into cardiomyocyte-like cells.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2018).</li><li>Perea-Gil, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+comparative+study+of+two+decellularization+protocols+in+search+of+an+optimal+myocardial+scaffold+for+recellularization.">In vitro comparative study of two decellularization protocols in search of an optimal myocardial scaffold for recellularization.</a> American Journal of Translational Research. 7 (3), 558-573 (2015).</li><li>Freytes, D. O., O'Neill, J. D., Duan-Arnold, Y., Wrona, E. A., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+cardiac+extracellular+matrix+hydrogels+for+cultivation+of+human+stem+cell-derived+cardiomyocytes.">Natural cardiac extracellular matrix hydrogels for cultivation of human stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Methods Molecular Biology. 1181, 69-81 (2014).</li><li>Oberwallner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+cardiac+extracellular+matrix+scaffolds+by+decellularization+of+human+myocardium.">Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102 (9), 3263-3272 (2014).</li></ol>

Till vår kunskap är detta den första studien som rapporten inverterad decellularization av människors hjärtan inuti en trycksatt påsen med time-lapse övervakning av flödet klassar och cell avlägsnande av skräp. Hjärtsäck-liknande påsen håller orientering på hjärtat stabil under hela förfarandet för decellularization. Dränka och vända hela hjärtan inuti en påsen förhindrar uttorkning och minimerar alltför stor belastning på aorta (från hjärtat vikt) när jämfört med den konventionella upprätt...

Hjärtsvikt leder till hög dödlighet hos patienter. Den ultimata behandlingsalternativ för slutstadiet hjärtsvikt är allo-transplantation. Men det finns en lång väntelista för transplantation på grund av bristen på donerade organ och patienter ansikte efter transplantation häck som spänner från livslångt immunsuppression till kronisk orgel avvisande1,2. Bioengineering funktionella hjärtan av återinplantering cell-lösa mänsklig storlek hjärtan med patientens egna celler kan kringgå dessa hinder3.
Ett stort steg i ”engineering” ett hjärta är skapandet av en byggnadsställning med lämplig vaskulär och parenkymal struktur, sammansättning och funktion att styra justeringen och organisationen av levererade celler. I närvaro av en lämplig ram, bör celler seedade på schavotten känner igen miljön och utföra den förvänta funktionen som en del av det orgeln. Enligt vår mening omfattar cell-lösa orgel extracellulär matrix (dECM) nödvändiga egenskaper av den idealisk byggnadsställningen.
Genom att utnyttja inneboende kärlsystemet, kan komplexa helhet-organ decellularization uppnås via antegrade eller retrograd perfusion4 ta bort cellulära komponenter samtidigt som den ömtåliga 3D extracellulära matrix och kärlsystemet2, 5,6,7. En funktionell kärlsystemet är viktigt i bioteknik hela organ bara som det är i vivo, för näringsämnen distribution och avfallshantering8. Koronar genomblödning decellularization har visat sig vara effektivt att skapa cell-lösa hjärtan från råttor4eller svin4,7,9,10,11 ,12,13, och människor5,7,14,15,16. Ännu, integritet ventilerna, atria och andra ”tunn” regioner kan lida.
Mänsklig storlek cell-lösa hjärtat ställningar kan erhållas från grisar med hjälp av tryck kontroll7,9,10,11,12 eller infusion flödet klassar kontroll13, 17 och från mänskliga donatorer med hjälp av tryck kontroll5,7,14,15. Decellularization av mänskliga givare hjärtan uppstår under 4-8 dagar under tryck kontrolleras på 80-100 mmHg i stående orientering5,15,16 eller under 16 dagar pressad styrda 60 mmHg14 . Under antegrade, tryckstyrda decellularization, spelar aortaklaffen kompetensen en avgörande roll för att upprätthålla koronar genomblödning effektivitet och stabilt tryck i aortaroten. Vårt tidigare arbete visade att orienteringen av hjärtat påverkar dess koronar genomblödning effektivitet under det decellularization förfarandet och därför byggnadsställning integritet i slutet9.
Som en fortsättning på våra tidigare arbete9introducerar vi ett nytt koncept som vari en hjärtsäck-liknande påse är till för att förbättra hela-hjärta decellularization. Vi beskriver decellularization av människors hjärtan placerade inuti trycksatt påsar, omvänt orienterade, och under tryck kontrolleras på 120 mmHg på aortaroten. Detta protokoll omfattar övervakning av flödet profil och samling utflöde media under hela decellularization förfarandet att utvärdera koronar genomblödning effektivitet och cell avlägsnande av skräp. Biokemiska analyser utförs sedan för att testa effektiviteten av metoden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-0 silk suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>SA85H</td>
			<td>Suture used to ligate superior and inferior vena cava</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1/4&#34; x 3/8&#34; connector with luer</td>
			<td>NovoSci</td>
			<td>332023-000</td>
			<td>Connect aorta and pulmonary artery</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex platinum-cured silicone tubing</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>HV-96410-16</td>
			<td>Tubing to connect heart chambers/veins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>infusion and outflow line</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>MX452FL</td>
			<td>For flowing solutions through the vasculature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyester pouch (Ampak 400 Series SealPAK Pouches)</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>01-812-17</td>
			<td>Pericardium-like pouch for containing heart during decellularization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snapware Square-Grip Canister</td>
			<td>Snapware</td>
			<td>1022</td>
			<td>1-liter Container used for perfusing heart</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black rubber stoppers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>59586-162</td>
			<td>To seal the perfusion container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>881003</td>
			<td>To pump fluid through the inflow lines and to drain fluids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L aspirator bottle with bottom sidearm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89001-532</td>
			<td>For holding solutions/perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td>For quantifying dsDNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf thymus standard</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4522</td>
			<td>DNA standard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit</td>
			<td>Biocolor Ltd</td>
			<td>Blyscan #B1000</td>
			<td>GAG assay kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>Infinite M200 Pro</td>
			<td>For analytical assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE fluoroscopy</td>
			<td>General Electric</td>
			<td>OEC 9900 Elite</td>
			<td>Angiogram</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visipaque</td>
			<td>GE</td>
			<td>13233575</td>
			<td>Contrast agent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

decellularization of whole human heart inside a pressurized pouch in an inverted orientation

Den ultimata lösningen för patienter med Terminal hjärtsvikt är organtransplantation. Men givare hjärtan är begränsade, immunsuppression krävs och i slutändan avslag kan uppstå. Att skapa en funktionell, kunde autolog bio-konstgjort hjärta lösa dessa utmaningar. Biofabrication av ett hjärta består av byggnadsställning och celler är ett alternativ. En naturlig Rullställning med vävnadsspecifika sammansättning samt mikro - och makro-arkitekturen kan erhållas genom decellularizing hjärtan från människor eller stora djur som grisar. Decellularization innebär att skölja cellulära skräp samtidigt bevara 3D extracellulära matrix och kärlsystemet och tillåter ”cellularization” vid en senare tidpunkt. Kapitalisera på vår roman att hitta att perfusion decellularization av komplexa organ är möjligt, vi utvecklat en mer ”fysiologisk” metod att decellularize icke-transplanterbara människors hjärtan genom att placera dem inuti en trycksatt påsen, i en inverterad orientering, under kontrollerad press. Syftet med att använda en trycksatt påse är att skapa trycket lutningar över aortaklaffen till hålla den stängd och förbättra myocardial perfusion. Samtidiga bedömning av dynamik och cellulära skräp borttagning under decellularization tillät oss att övervaka både flytande inflöde och utflöde på skräp, därmed generera en byggnadsställning som kan användas antingen för enkel hjärt reparation (t.ex. som en patch eller ventil byggnadsställning) eller som en helhet-orgel byggnadsställning.

Efter en 7-dagars decellularization med antegrade aorta perfusion under konstant tryck 120 mmHg vände det mänskliga hjärtat genomskinlig (figur 6B). Hjärtat var grovt dissekeras i 19 sektioner för bioanalys (DNA, GAG och SDS) (figur 6 c) för att utvärdera cell-lösa slutprodukten.
Under hela decellularization hölls infusion flödet klassar av olika lösningar va...

Watch this Scientific Journal Video about Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation at JoVE.com

Decellularization of Whole Human Heart Inside a Pressurized Pouch in an Inverted Orientation

Denna metod möjliggör decellularization av en komplex solida organ med hjälp av ett enkelt protokoll baserat på osmotiska chock och perfusion av Joniska tvättmedel med minimal orgel matrix störningar. Den består av en roman decellularization teknik för människors hjärtan inuti en trycksatt påsen med realtidsövervakning av flow dynamics och cellulära skräp utflöde.

Decellularization av hela människans hjärta inuti en trycksatt påsen i en omvänd riktning

The ultimate solution for patients with end-stage heart failure is organ transplant. But donor hearts are limited, immunosuppression is required, and ...

Denna metod kan hjälpa till att svara på viktiga frågor om att generera vascularized byggnadsställningar, som verkligen är den heliga graal av vävnadsteknik området. Den största fördelen med denna teknik är att en trycksatt påse i en inverterad orientering förbättrar decellularization av icke-transplanterbara mänskliga organ och låter oss göra det på ett sterilt sätt över en lämplig tidsram. För att förbereda hjärtat för decellularisering, utför först en intern inspektion för eventuella defekter.Om en septal defekt är närvarande, korrigera defekten med lämpliga suturer. Därefter ligate den överlägsna och sämre vena cavas med 2-0 siden sutur. Suturera den högra atriumväggen med 5-0 PROLENE, och dissekera aortan bort från den huvudsakliga lungartären för efterföljande kanylulering.För in kontaktdonen, enligt kärlets diameter, i aorta och lungartären, och säkra kontaktdonen med 2-0 silkessuturer. Med hjälp av en av pulmonal vein kroppsöppningar, sätt in en slanglinje genom vänster atrium mot vänster kammare, och anslut en infusionsledning till kontakten i aorta och ett utflöde linje till kontakten i lungartären. Placera det förberedda hjärtat i en polyesterpåse i den inverterade orienteringen, och placera påsen i en perfusionsbehållare.Anslut var och en av linjerna till respektive portar i gummiproppen, enligt behållarens diameter, och sätt in proppen i locket till perfusionsbehållaren för att täta polyesterpåsen. Sedan, genomsyra PBS via infusionsporten av gummiproppen för att verifiera utflödet från lungartären och från den linje som förs in i den vänstra ventrikeln, med hjälp av detta flöde för att rengöra organet av eventuella kvarvarande spår av blod inom vasculature. När hjärtat är redo, placera den monterade bioreaktorn i en upprätt orientering, och anslut infusionsledningen, tryck-huvud linje, pulmonell artär-utflöde linje, och bioreaktor dräneringsledning till gummi locket ytportar ovanpå perfusion bioreaktor.Sedan, decellularize hjärtat i fyra timmar med hypertonisk lösning, två timmar med hypotonisk lösning, 120 timmar med natrium dodecyl sulfat, eller SDS, och en sista tvätt med 120 liter PBS, allt under konstant 120 millimeter kvicksilver tryck mätt vid aorta roten. Under de sista 10 liter av PBS tvätta, tillsätt 500 milliliter av steril 2,1%perättik syra lösning neutraliseras med 10 normala natriumhydroxid till perfusionslösningen för att sterilisera ställningen. Typiskt, flödeshastigheten i aorta under decellularisering processen gradvis minskar som perfusion lösningen ändras från hypertoniska till hypotoniska.Däremot ökar flödeshastigheten när perfusionslösningen ändras från en hypotonisk lösning till SDS, vid vilken tidpunkt infusionsflödet visar på fluktuationer. Utflödeshastigheten från lungartären visar en liknande trend med de hyper- och hypotoniska lösningarna. Utflödeshastigheten under SDS-perfusion uppvisar dock en total minskning.Koronarperfusionseffektiviteten minskar också med tiden då de olika reagenserna perfunderas genom vasculaturen. Eftersom utflödet perfusate från lungartären och vänster kammare samtidigt samlas in, deras skräp innehåll kan jämföras med spektroskopi. Grumligheten i utflödet från båda kärlen minskar med tiden under perfusionerna, även om grumlighet från pulmonal artery uppvisar en mer abrupt färgförändring jämfört med den som observerats från vänster kammare under den inledande perfusionsperioden.Utvärdering av sambandet mellan utflödesturbiditet och cellen skräp av en bicinchoninic syra protein analysen från sex decellularized mänskliga hjärtan avslöjar en linjär korrelation mellan proteinkoncentrationen och utflödet grumlighet. Medan du försöker den här proceduren är det viktigt att övervaka flödeshastigheten och att samla in perfusatet med jämna mellanrum för att faktiskt övervaka perfusionsprocessen. Efter detta förfarande, andra tekniker som mekanisk utvärdering eller sterilitet testning kan användas för att utvärdera trohet av ställningen och dess potentiella användning för recellularization att generera en funktionell hjärt vävnad.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom det regenerativa medicin- och vävnadsteknikområdet att utforska generationen av hela kärlorgan, vilket bokstavligen förändrade det fasta organtransplantationsfältet. Glöm inte att arbeta med mänskliga organ och vävnader och kemikalier som SDS kan vara extremt farligt, och alltid bära lämplig personlig skyddsutrustning när du utför detta förfarande.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Decellularization och Recellularization av Whole Lever

The liver is a complex organ which requires constant perfusion for delivery of nutrients and oxygen and removal of waste in order to survive1. Efforts to ...

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparameter Optisk Kartläggning av Langendorff-perfusion Kanin hjärta

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

Optisk Kartläggning av aktionspotentialer och transienter Kalcium i musen hjärta

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

Procedure for Decellularization of Porcine Heart by Retrograde Coronary Perfusion

Förfarande för decellularisering av grishjärta genom retrograd koronarperfusionstrycket

Perfusion-based  whole organ decellularization has recently gained interest in the field of  tissue engineering as a means to create site-specific ...

A Decellularization Methodology for the Production of a Natural Acellular Intestinal Matrix

En decellularization Metod för produktion av en naturlig Acellular Intestinal Matrix

Successful tissue engineering involves the  combination of scaffolds with appropriate cells in vitro or in vivo.  Scaffolds may be synthetic, ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

En injicerbar and Drug belastad Supra Hydrogel för lokal kateter Injektion i Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device

Förfarande för decellularisering av råttlevrar i ett oscillerande tryck perfusionsanordning

Decellularization and recellularization of parenchymal organs may enable the generation of functional organs in vitro, and several protocols for rodent ...

Decellularization and Recellularization Methodology for Human Saphenous Veins

Decellularization och Recellularization metodik för mänskliga ytlig venerna

Vascular conduits used during most vascular surgeries are allogeneic or synthetic grafts that often lead to complications caused by immunosuppression and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

En ny kirurgisk teknik som en grund för In Vivo delvis lever Engineering i råtta

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Isolation and Decellularization of a Whole Porcine Pancreas

Isolering och Decellularization av en hela svin bukspottkörtel

Tissue engineering of the whole pancreas can improve current treatments for diabetes mellitus. The ultimate goal is to tissue engineer pancreas from an ...